專利名稱：適體在蛋白質(zhì)組學中的用途的制作方法
適體在蛋白質(zhì)組學中的用途本發(fā)明涉及復雜混合物中蛋白質(zhì)的鑒定和定量。具體而言，本發(fā)明涉及適體 (aptamer)作為復雜混合物中蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)數(shù)量的標簽(tag)或代替物(proxy)的用途。 在另一個方面，本發(fā)明涉及下一代多核苷酸測序方法在蛋白質(zhì)組學中的用途。蛋白質(zhì)組通常被描述為在生物學系統(tǒng)(例如細胞、組織、體液、器官或生物體)中 找到的蛋白質(zhì)的全集。對天然存在蛋白質(zhì)的研究通常稱作“蛋白質(zhì)組學”且涵蓋對在特定 時間時和/或在感興趣的內(nèi)部或外部條件下表達的蛋白質(zhì)組的研究。蛋白質(zhì)組學方法常常 針對蛋白質(zhì)組的整體分析且要求能自一份或多份樣品解析、鑒定和定量多種(例如數(shù)百種 或數(shù)千種)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學的承諾中有其識別新的生物標志物(即作為生物學指示劑發(fā)出生 理學狀態(tài)改變(例如由于疾病或治療性干預)的信號的蛋白質(zhì))的能力。生物標志物 發(fā)現(xiàn)通常涉及比較在不同生理學狀態(tài)中表達的蛋白質(zhì)組并鑒定其存在或表達水平在 生理學狀態(tài)間一致不同(consistently differ)的蛋白質(zhì)(Schrattenholz A, Groebe K. Electrophoresis. (2007) Jun 28(12) 1970-9)。血液中的蛋白質(zhì)是鑒定疾病狀態(tài)和藥物治療標志物的特殊靶物。廣泛假設，血液 中的蛋白質(zhì)的量和/或構象應當在統(tǒng)計上與此類狀況有關，其方式在權重上超過內(nèi)在的天 然變異性。血液和其它體液是特殊的靶物，因為它們浸泡(bathe)受影響組織，轉(zhuǎn)運生死攸 關的蛋白質(zhì)且能在醫(yī)學會診過程中使用相對便宜和直接的規(guī)程獲得供測試用。然而，血液中的蛋白質(zhì)具有很大范圍的濃度，其中少數(shù)蛋白質(zhì)占比超過所有蛋白 質(zhì)的99. 9%而且其它蛋白質(zhì)占據(jù)的分布為皮克至毫克每毫升(QianW.J.等，Mol. Cell. Prot. (2006) 5 (10) 1727-1744) 0由于現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學技術的限制，此豐度范圍仍然是假設 的。蛋白質(zhì)組學科學家采用多種方法來達到此范圍，目的也是使對蛋白質(zhì)相對豐度的破壞 最小化。這常常要求通過選擇性純化來排除高豐度的蛋白質(zhì)。還嘗試通過選擇性聚焦樣品 中所有肽的子集來降低所獲得的肽的復雜性。這些規(guī)程是漫長的，而且樣品、復制品、儀器 和實驗室間的再現(xiàn)性仍有待以生物標志物蛋白質(zhì)的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(statisticaldiscovery)的 必要方式來證明。生物標志物發(fā)現(xiàn)中常常使用的基于常規(guī)質(zhì)譜術(MS)的蛋白質(zhì)組學通過將生物學 樣品分開以自所研究的混合物分離單一蛋白質(zhì)來進行。最近，這從二維凝膠前進至多維基 于柱的高效液相層析(HPLC)。蛋白質(zhì)能被分解成較短的亞基或肽。然后將分離的肽進料入 質(zhì)譜儀中，質(zhì)譜儀將肽離子化并使它們進一步分解，產(chǎn)生質(zhì)量/電荷測量的梯狀物。這些測 量及其豐度也能在多種方案下量化，通常是相對于一些對照。然后將所得圖譜梯狀物針對 已知肽序列或盲目地自原始數(shù)據(jù)進行解讀，并使用獲得的質(zhì)量和序列信息來搜索序列數(shù)據(jù) 庫以鑒定作為各肽起源的蛋白質(zhì)。然而，復雜生物學樣品的蛋白質(zhì)水解通常產(chǎn)生數(shù)以十萬計的肽，它們會壓倒已知 層析和MS系統(tǒng)的分辨能力，引起不完全的分辨和組分肽鑒定受損。通常，在基于MS的蛋白 質(zhì)組學中，自樣品得到的圖譜中多達80%不能正確或一致地重解讀成差別肽或(因此)蛋 白質(zhì)。它們在MS過程中的片段化行為和豐度也能是依賴背景的，進一步使再現(xiàn)性變復雜(Liu H, Sadygov RG, Yates JR3rd. , Anal. Chem. (2004) Jul 15 76(14)4193-201)。使生物學樣品的蛋白質(zhì)組分析能夠進行的一種方法是在對所生成的肽混合物進 行下游解析和鑒定步驟(如層析分離和/或質(zhì)譜術(MS))之前，降低由分開此類樣品來產(chǎn) 生的所述肽混合物的復雜性。理想的是，降低蛋白質(zhì)肽混合物的復雜性會降低樣品的每種 個別蛋白質(zhì)所存在的不同肽的平均數(shù)目，仍會使肽混合物中實際呈現(xiàn)的樣品中蛋白質(zhì)的級 分最大化。蛋白質(zhì)的生物學加工以使基于MS的確認混淆的多種方式使血液(血清或血漿) 的使用進一步不明(Qian W. J.等，Mol. Cell. Prot. (2006)5(10) 1727-1744)。最近的研究 顯示了極其矛盾的自臨床樣品鑒定和計數(shù)蛋白質(zhì)的嘗試。就是以常規(guī)的基于MS的蛋白質(zhì) 組學分離、斷裂和測量蛋白質(zhì)的動作改變了它們的相對豐度和化學組成?；诘鞍踪|(zhì)組學的分析的輸出是所研究的樣品中顯著關聯(lián)的蛋白質(zhì)的“命中列 表”。通常，此列表是具有可變統(tǒng)計意義的蛋白質(zhì)的選集。通常對該列表進行生物學導向研 究，并對每個成員的潛在生物學意義做出理性選擇。搜索具有推定統(tǒng)計意義的蛋白質(zhì)或假 定生物標志物列表的過程一般稱作“發(fā)現(xiàn)”。然后將努力聚焦于檢驗和驗證少數(shù)選定的“命中”。這涉及在更寬的臨床樣品群 體中證實測量得到的蛋白質(zhì)豐度，目的是顯示所發(fā)現(xiàn)的和所選擇的蛋白質(zhì)是真實的而非 假陽性，而且它們是對疾病或藥物狀態(tài)特異性的。這種證實蛋白質(zhì)組學測量和推定生物 標志物在更一般化的群體中的數(shù)量意義的過程通常稱作“驗證”(Zolg，Mol. Cell. Prot. (2006) 5 (10)，1720-1726)。這常常要求對發(fā)現(xiàn)階段使用備選技術。這通常是使用針對純化的推定蛋白質(zhì)生成的抗體實現(xiàn)的。然后能在基于ELISA的 測定法中針對數(shù)以百計的樣品使用這些抗體，再次應用相關統(tǒng)計學，并確立該蛋白質(zhì)作為 生物標志物的有效性。此過程的最終意圖還有使抗體成為臨床測定法的一部分。然而，抗 體的生成是費時且昂貴的，而且并非總是可能生成對給定蛋白質(zhì)特異性的抗體。另一項復 雜因素是蛋白質(zhì)備選變體或同型(isoform)的存在，它們可以在其表面上具有所附著糖分 子的殼和其它修飾。同型在發(fā)現(xiàn)階段基于MS的鑒定中可能是不明顯的，并因此使測量的 統(tǒng)計顯著性及特異性抗體的生成變復雜(Zolg, Mol. Cell. Prot. (2006) 5 (10)，1720-1726 ； Rifai 等，Nature Biotech (2006) 24 (8) 971-83)。發(fā)現(xiàn)和驗證都具有高失敗率，而且是費時且昂貴的練習。成功和失敗通常只 能在付出很長時間和很多金錢后的驗證階段后判斷。因此，最近的努力聚焦于用于發(fā) 現(xiàn)的基于MS的方法的精化和抗體的大量生成，以努力加速發(fā)現(xiàn)、驗證及衍生臨床產(chǎn)品 (Anderson 禾口 Hunter，Mol. Cell Prot. (2006) 5 (4) 573-588 ；Zangar φ, Expert Review of Proteomics(2006)3(1)37-44)。因而，顯然需要新方法來審查蛋白質(zhì)，特別是自體液得到的復雜的蛋白質(zhì)混合物。 具體而言，需要鑒定和測量蛋白質(zhì)豐度，尤其是復雜混合物中多種蛋白質(zhì)的豐度的技術，它 要克服技術缺點及妨礙當前技術的科學和成本約束。具體而言，需要工具來取代昂貴且有 時不可靠的抗體生成和使用以鑒定和驗證靶蛋白質(zhì)。此類工具還能用于代替現(xiàn)有的基于發(fā) 現(xiàn)的技術，如MS,前提是能足夠快速且便宜地生成有足夠多樣性的抗體備選物來探查生物 學樣品中的全范圍的天然蛋白質(zhì)。對此類工具的明顯要求是對混合物的最小限度操作，從而可獲得樣品中蛋白質(zhì)以其天然構造以及任何天然修飾和變異的真實呈現(xiàn)。此類工具還應是高度且準確可再現(xiàn)的。適體是形成限定明確的三維形狀，從而容許它們以與抗體在概念上相似的方式結 合靶分子的短聚合物，通常是核酸(DNA、RNA、PNA)。適體組合了小分子和抗體的最佳特征， 包括高特異性和親和力、化學穩(wěn)定性、低免疫原性、和靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的能力。 在高特異性之外，適體對它們的靶物具有非常高的親和力。通常，針對蛋白質(zhì)生成的適體具 有皮摩爾至低納摩爾范圍內(nèi)的親和力。與單克隆抗體不同，適體是化學合成的，而非生物表 達的，從而提供重大成本優(yōu)勢。雖然適體提供了抗體的有用且有效的備選，仍然有如何經(jīng)由適體對蛋白質(zhì)定量的 問題。復雜的蛋白質(zhì)混合物及生物學樣品中存在的大動態(tài)范圍的蛋白質(zhì)提供了特別的問 題。通常，使用放射性標記物對適體定量。雖然放射性標記物的定量是可接受的，而且已經(jīng) 使用多年，但是仍然需要改進和加速定量，以及改進準確度和再現(xiàn)性。如此，最廣義地，本發(fā)明涉及一種用于測量生物學樣品中至少一種分子的量的方 法，該方法包括a)將所述樣品或其衍生物與一種或多種適體組合并容許所述樣品中的一種或多 種分子結合至所述適體；b)將結合的分子與未結合的分子分開；并c)對結合至所述或每種適體的分子定量，其中對結合的分子的定量是通過對所述或每種適體的至少一部分測序來進行的。換言之，本發(fā)明涉及適體作為標簽用于對蛋白質(zhì)定量的用途，其中所述適體的序 列就是所述標簽?？衫斫獾氖牵m體具有可閱讀的獨特序列，例如像條形碼一樣。依照本發(fā) 明，此獨特條形碼成為該條形碼(適體)所結合的每種蛋白質(zhì)的標簽。通過閱讀條形碼(對 適體測序)，消除了對另外的標簽和/或標記物的需要。與現(xiàn)有方法不同，適體序列作為標簽的用途容許只使用單一分子實體進行蛋白質(zhì) 鑒定和定量。事實上，對適體測序容許對每種獨特序列的情況或出現(xiàn)計數(shù)，因此容許直接對 每種適體所結合的蛋白質(zhì)定量。換言之，當各適體結合各蛋白質(zhì)時，每種適體成為樣品或蛋 白質(zhì)混合物內(nèi)蛋白質(zhì)的直接呈現(xiàn)?？衫斫獾氖牵?jīng)由本發(fā)明的方法，對初始蛋白質(zhì)或樣品的 操作降至最少，由此容許盡可能接近天然狀態(tài)地審查蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物。這樣，可獲得 蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群體的真實圖像。在一個優(yōu)選的實施方案中，對適體測序是在沒有擴增的情況中實現(xiàn)的，所以通過 對如下的測序裝置上每個種類的出現(xiàn)計數(shù)來獲得適體的絕對或數(shù)字計數(shù)，該測序裝置在測 序之前將各分子分開，例如“下一代"DNA測序儀。獲得每種序列的出現(xiàn)的直接計數(shù)，它又等 于適體所結合的蛋白質(zhì)的絕對計數(shù)。可以將序列子集呈現(xiàn)在計數(shù)裝置上，這應當是所研究 的分子群體中給定序列的出現(xiàn)的代表性樣品。再一次，這與當前的適體定量方法不同，后者 通常要求擴增結合的標簽或擴增適體分子，從而產(chǎn)生其相對豐度的模擬估值(如專利公開 號US 2007-0166741中所記載的)。這是由于為了鑒定結合蛋白質(zhì)的適體而使用標記物和 別的標簽的限制。結果，定量與實際豐度(即模擬信號)成比例，而不能分辨絕對或個別出 現(xiàn)。使用適體序列作為標簽的另一項優(yōu)勢是序列提供極大范圍的可能標簽。例如，四 個堿基的序列提供256種不同組合及如此256種可能的獨特標識符或標簽。如此，雖然可
6以獲得整個適體序列，但是測序的核苷酸數(shù)目只需要足以鑒定特定適體就夠了。換言之，或 者整個適體序列作為標簽，或者標簽是適體序列的一部分。雖然本發(fā)明的方法可用于用一種適體序列對樣品中的一種蛋白質(zhì)定量，但是本發(fā) 明的另一項優(yōu)勢是由獨特序列提供的可能的標簽的范圍容許同時對同一樣品中的多種蛋 白質(zhì)定量。如此，可以使用一組已知適體序列或已知適體序列文庫來對復雜混合物中的多 種蛋白質(zhì)定量，而且這樣，本發(fā)明容許審查復雜生物學樣品。另外，一組適體或適體文庫可 以靶向特定蛋白質(zhì)，特別是已知在樣品中少量存在的蛋白質(zhì)。因為使用已知方法不太可能 鑒定和定量樣品中的低豐度蛋白質(zhì)，所以本發(fā)明提供了用于審查這些小且至今難以捉摸的 群體的解決方案。文庫或組應當理想地含有過度的適體種類來探查樣品。本發(fā)明可分析一種蛋白質(zhì)(例如凝膠切下的蛋白質(zhì))，而且特別適合于分析蛋白 質(zhì)混合物，包括復雜蛋白質(zhì)混合物。術語“蛋白質(zhì)的混合物”或“蛋白質(zhì)混合物，，一般指兩 種或更多種蛋白質(zhì)的混合物，例如包含兩種或更多種不同蛋白質(zhì)的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，要分析的蛋白質(zhì)混合物可包括超過約10、優(yōu)選超過約50、 甚至更優(yōu)選超過約100、仍更優(yōu)選超過約500種不同蛋白質(zhì)，如例如超過約1000或超過約 5000種不同蛋白質(zhì)。一種例示性復雜蛋白質(zhì)混合物可涉及而非限于生物學樣品或其部分中 存在的所有或部分蛋白質(zhì)。如本文中所使用的，術語“生物學樣品”或“樣品” 一般指自生物學來源獲得的未 純化或純化形式的材料。舉例而言，而非限制，樣品可以獲得自病毒，例如原核或真核宿 主的病毒；原核細胞，例如細菌或古細菌，例如自由活動的(free-living)或浮游的原核生 物或者包含原核生物的集落或生物膜；真核細胞或其細胞器，包括自體內(nèi)或原位獲得的或 體外培養(yǎng)的真核細胞；真核組織或生物體，例如來自真核組織或生物體的，含有細胞的或不 含細胞的樣品；真核生物可包含原生生物(例如原生動物或藻類)、真菌(例如酵母菌或 霉菌)、植物和動物(例如哺乳動物，人類或非人哺乳動物)?！吧飳W樣品”可如此涵蓋 例如細胞、組織、生物體、或其提取物。可以優(yōu)選通過合適方法自其生物學來源(例如自動 物，如哺乳動物，人類或非人哺乳動物)移出生物學樣品，如但不限于收集或采集尿液、唾 液、痰、精液、乳、粘液、汗液、糞便等，采集血液、腦脊髓液、間質(zhì)液、眼液(玻璃體)或滑液， 或組織活檢、切除術、等?？梢赃M一步細分生物學樣品以分離或富集其一部分，該部分要用 于獲得本發(fā)明中所分析的蛋白質(zhì)。舉例而言，而非限制，可以將多種組織類型彼此分開； 可以自樣品分離特定細胞類型或細胞表型，例如使用FACS分選、抗體淘選、激光捕捉解剖 (laser-capture dissection)等；可以將細胞與間質(zhì)液分開，例如可以將血細胞與血漿或 血清分開；等等?？梢灾苯訉悠窇糜诒景l(fā)明的方法，或者可以在使用前將樣品加工、提 取或純化至不同程度?？梢宰越】凳茉囌呋蚧加袪顩r、病癥、疾病或感染的受試者得到樣品。例如，而非 限制，受試者可以是健康的動物(例如人類或非人哺乳動物)，或者具有癌癥、炎性疾病、自 身免疫性疾病、代謝病、CNS疾病、眼科疾病、心臟病、肺病、肝病、胃腸病、神經(jīng)變性性疾病、 遺傳病、傳染病、或病毒感染、或其它病的動物(例如人類或非人哺乳動物)。優(yōu)選的是，可以處理自生物學樣品得到的蛋白質(zhì)混合物以從中消減高豐度蛋白 質(zhì)，從而提高蛋白質(zhì)組分析的靈敏度和性能。舉例而言，哺乳動物樣品(如人類血清或血 漿樣品)可以包括含量豐富的蛋白質(zhì)，例如清蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、運鐵蛋白、觸珠蛋白(haptoglobin)和纖維蛋白原(fibrinogen)，可以優(yōu)選自樣品如此消減它們。用于 清除含量豐富的蛋白質(zhì)的方法和系統(tǒng)是已知的，如例如免疫親和消減，而且通常是商業(yè)上 可得到的，例如Agilent Technologies (Santa Clara, California)的多重親和清除系統(tǒng) (MARS-7, MARS-14)。雖然本發(fā)明具有蛋白質(zhì)定量的具體應用，但是可理解的是，本發(fā)明還具有其它分 子(如代謝物)定量及潛在小分子和生物學治療劑鑒定的應用。在一個實施方案中，本發(fā)明使用下一代多核苷酸測序技術來鑒定和定量適體標 簽。這樣，本發(fā)明提供了與當前可用方法相比更靈敏且有效的定量方法，并在蛋白質(zhì)組學領 域中利用由這種基因組方法提供的大動態(tài)范圍、特異性和靈敏度。下一代多核苷酸測序技術要求將DNA或RNA或其它多核苷酸序列的各分子分離到 表面(如珠或芯片)上，由此創(chuàng)建序列的單分子陣列。該陣列的表面密度容許每個分子得 到個別分辨，例如通過光學顯微術。在陣列上對多核苷酸分子的測序容許對序列進行“數(shù) 字”(即絕對)計數(shù)，如此對陣列上存在的序列直接定量。在一些技術中，一旦排列就可以 克隆擴增序列以加強和/或闡明來自每種序列的信號。但是，通過對陣列上序列的出現(xiàn)而 非自每種擴增子生成的信號計數(shù)來獲得定量。合適的測序和定量技術的例子可見于出版物 中，如 WO 00/006770 和 Branton 等(Nature Biotechnology (2008) 26 1146-1153)。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，對結合的適體序列的定量是使用結合的序列的 單分子陣列進行的?；蛘?，可以在克隆陣列上對適體序列定量，其中在表面上排列后擴增每 種序列。由于適體對其靶蛋白質(zhì)的高特異性，可以使用適體作為混合物內(nèi)蛋白質(zhì)的代替 物。結合于其蛋白質(zhì)和后續(xù)洗脫后，經(jīng)由對其序列在平行測序裝置上的頻率計數(shù)來對適體 定量，從而能夠?qū)悠穬?nèi)的特定蛋白質(zhì)定量。通過暗示或代替，這與使用抗體作為蛋白質(zhì)的 代替物的方式相似。事實上，適體序列或標簽的分布代表獲得蛋白質(zhì)的生物學群體或樣品 中相應蛋白質(zhì)的分布。此外，在陣列上對克隆分子計數(shù)為每種適體標簽的數(shù)量或比例提供絕對數(shù)。這稱 作“數(shù)字計數(shù)”，而且與現(xiàn)有的DNA/RNA定量方法不同，后者依賴如附著染料的熒光等參數(shù) 的間接模擬測量。這樣，不需要操作蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物，除了在合適條件下暴露適體。 另外，認為數(shù)字計數(shù)是卓越的，因為它避免了模擬定量的許多含混(ambiguity)和信號噪 聲問題(Smyth GK, Bioinformatics (2007) Sep 19)。在一個具體的實施方案中及如

圖1所示，針對自生物學材料(例如血清)得到的 體外折疊蛋白質(zhì)集篩選并選擇適體文庫?？衫斫獾氖牵梢酝ㄟ^任何方法來生成適體標簽 文庫，包括SELEX和共同待審的(co-pending)申請?zhí)朎P07020629. 7中記載的方法。清除或洗脫不結合蛋白質(zhì)的適體。為了實現(xiàn)這一點，有多種已知選項可用。例如， 可用在固體支持物上固定化一種蛋白質(zhì)或復雜蛋白質(zhì)樣品。可以實施嚴格清洗來清除不 結合的和弱結合的適體。另一個選項是使用蛋白質(zhì)靶物上適體的可逆交聯(lián)(光適體)。也 可以采用基于平衡混合物的平衡毛細管電泳(ECEEM)或非平衡變體(NECEEM)的非SELEX 辦法來快速選擇具有規(guī)定結合特性的“聰明”適體(Drabovich等，Anal. Chem. (2006)78， 3171-3178)。自它們的蛋白質(zhì)宿主移除剩余的、結合的適體，并運行穿過(rim through)下一代測序儀，由此對它們測序和計數(shù)。作為下一代測序的一個具體例子，將結合的適體隨機排列在表面(如珠或芯片) 上。任選地循環(huán)擴增適體，在表面上的離散χ和y坐標處或在各珠上產(chǎn)生多組克隆單鏈分 子。序列結合至陣列后，將引物添加至每個序列。然后DNA測序儀執(zhí)行逐步化學，該逐步化 學由容許每個循環(huán)測定每個互補序列上一個堿基的試劑組成。這樣，確立反映每個結合的 適體序列的互補序列。照明和成像系統(tǒng)容許此過程被拍照，而且通過多次重復規(guī)程，能獲得 初始適體的序列。此類技術通常能夠?qū)Τ^0. 4-1億種長達50個堿基對的DNA片段測序， 而且這些數(shù)目正在快速增長。從樣品準備到測序輸出，此過程目前需要少于1-3天，而且這 些時間表(time scale)正在縮短?？衫斫獾氖?，可以使用落在“下一代多核苷酸測序”范疇中的其它方法，而且本發(fā) 明不限于所提供的具體例子?！跋乱淮嗪塑账釡y序”是一般用來描述自2004年出現(xiàn)的 DNA/RNA測序平臺的新創(chuàng)術語。它們的共同特征是它們使用與基于“Sanger”測序的舊技術 不同的測序化學。新平臺使用新化學且一般具有很高的通量和低得多的成本。這是通過平 行運行測序反應的能力來實現(xiàn)的。新平臺通常通過合成或鏈延伸(建造)來行進，與通過 剪斷堿基(降解)來運轉(zhuǎn)的Sanger法不同。另外，新平臺操作微量的克隆分子，與具有很 大的DNA測序儀分子對堿基測量比的Sanger法不同。也可理解的是，雖然提到了 DNA測序，但是DNA測序技術也可用于RNA或PNA (肽 核酸)序列。如此，提到下一代測序儀或測序涵蓋DNA、RNA和PNA，以及基于核酸的聚合物 的所有其它化學變體及其類似物，它們適合于在本發(fā)明的方法中使用。雖然本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案使用適體序列的二維陣列，但是本發(fā)明涵蓋溶液 中的和三維的下一代測序。對于后者，可以連鎖標簽以提高陣列的動態(tài)范圍。本發(fā)明的一項重大優(yōu)勢是可以在一項測定法或?qū)嶒炛惺褂冕槍Σ煌鞍踪|(zhì)的多 種適體來審查復雜蛋白質(zhì)混合物，由此能夠平行地對一份樣品中的多種蛋白質(zhì)定量。此多 重性顯然適應高通量測定法，如下一代測序。認為在聯(lián)合使用時，多種蛋白質(zhì)充當特異和靈 敏生物標志物的力量在權重上遠遠勝過一種蛋白質(zhì)的使用，因為多種生物標志物在患病狀 態(tài)中通常共同地而非個別地起作用。理想的是，文庫適體序列包含對一種蛋白質(zhì)特異性的適體序列池(pool)?；蛘撸?池包含對超過一種蛋白質(zhì)特異性的適體序列。例如，該文庫可以含有已知對蛋白質(zhì)A特異 性的適體序列al、a2和a3。或者，該文庫可以含有適體序列al、a2和a3，以及對蛋白質(zhì)B 特異性的bl和b2，cl等。雖然適體序列al、a2和a3可以是對蛋白質(zhì)A特異性的，但是本 發(fā)明涵蓋如下的情況，例如適體序列a2對蛋白質(zhì)B也是特異性的。換言之，適體文庫可以 含有離散地對蛋白質(zhì)特異性的序列，以及結合超過一種蛋白質(zhì)的序列。后一種情況當在混 合物中搜索相關蛋白質(zhì)家族和組時可能是有用的。雖然優(yōu)選所述或每種適體所結合的蛋白質(zhì)或分子的身份是已知的，但是此類特征 不是至關重要的。例如，適體所結合的蛋白質(zhì)的類別可以是已知的，但是該類別的具體成員 在患病狀態(tài)中可發(fā)生改變。一旦完成定量，就可以闡明蛋白質(zhì)的身份。例如，可以針對蛋白 質(zhì)混合物測定一種或多種特異性適體。適體特異性結合感興趣蛋白質(zhì)，然后可以自混合物 分離和純化感興趣蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一項重大優(yōu)勢是直到審查過程結束時才需要確定蛋白 質(zhì)生物標志物的實際鑒定。如此，審查期間不需要操作蛋白質(zhì)樣品。
可理解的是，可以通過任何已知方法來進行多肽測序。例如，可以在柱上固定化感 興趣適體，使蛋白質(zhì)混合物流過柱，并使用常規(guī)的基于MS的蛋白質(zhì)組學分析與柱上結合于 適體的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，適體攜帶獨特的序列標簽。這樣，一旦適體被鑒定為結合一 種或多種感興趣蛋白質(zhì)，就可以自適體移除標簽，然后對標簽測序和計數(shù)。這樣，使用標簽 作為適體的地址并提供備選方法來提供定量?？衫斫獾氖?，該方法可用于提供多種解決方案和答案。具體而言，該方法可用于審 查生物學樣品以確定與健康狀態(tài)相比某些蛋白質(zhì)或分子在疾病狀態(tài)是否上調(diào)或下調(diào)。因為 可以同時使用多組適體，所以本發(fā)明容許同時審查多種潛在和/或已知生物標志物。適體 序列作為標簽的使用(而非間接標簽和標志物，如放射性標記物和抗體)容許鑒定上調(diào)和 下調(diào)的分子，以及翻譯后修飾的改變、構象變化、變體出現(xiàn)等等。這樣，能被鑒定的可能生物 標志物的細查(canvass)比使用當前可用技術時可能的情況寬得多。事實上，可以使用聚焦適體集選擇性地審查蛋白質(zhì)組的特定區(qū)域。另外，因為適體 序列提供這樣大范圍的可能標簽，所以可以同時審查蛋白質(zhì)組的多個離散區(qū)域。在又一個實施方案中，可以用復雜樣品考驗適體組或池。然后可以洗脫結合級分， 并針對第二份不同樣品再探查。然后游離的、未結合的適體反映蛋白質(zhì)豐度的差異。這樣， 能測量例如作為患病或處理后狀態(tài)的結果而發(fā)生的蛋白質(zhì)豐度的變化，以及樣品中出現(xiàn)的 任何蛋白質(zhì)的出現(xiàn)。在這些實施方案中，復雜蛋白質(zhì)混合物通常是自體液(如血液、血漿或 血清)得到的?？衫斫獾氖?，本發(fā)明還可用于驗證生物標志物。具體而言，可以針對來自一名或多 名健康個體的蛋白質(zhì)樣品篩選一組或一套不同適體，并與自患有感興趣疾病的一名或多名 個體采集的蛋白質(zhì)樣品比較。因為可以同時對多種蛋白質(zhì)定量，所以本發(fā)明高度適應高通量分析，由此顯著降 低生物標志物驗證通常所需要的成本和時間。本發(fā)明關于驗證蛋白質(zhì)生物標志物的一項優(yōu)勢是可使用適體來代替抗體。特異性 抗體的生成是昂貴的，而且并非總是成功的。另一方面，通?？赡軐o定過程生成選擇性適 體，而且該過程快速且便宜得多。在使用時，針對復雜蛋白質(zhì)混合物測定對特定感興趣蛋白 質(zhì)特異性的一種或多種適體。與患病樣品中的結合相比健康樣品中適體結合的缺失(或反 之亦可)可以通過適體計數(shù)來闡明。再次，無需對蛋白質(zhì)樣品進行操作，而且蛋白質(zhì)本身不 需要鑒定。另外，可以在一項實驗中針對多種感興趣蛋白質(zhì)測定多種適體。通過能夠?qū)彶榈鞍踪|(zhì)的全集(full complement)，本發(fā)明的方法還可用于建立個 體中蛋白質(zhì)的構象和豐度的圖像。也就是，提供患者的蛋白質(zhì)組成的序型或圖譜。例如，可 以使用前列腺特異性抗原(PSA)的圖像來建立前列腺癌的預后和診斷，以及提供疾病進展 的指示。又例如，如果發(fā)現(xiàn)患者具有某種蛋白質(zhì)變體，那么關于患者的蛋白質(zhì)序型的信息 可用于評估疾病預后或易感性，而且可用于幫助為患者開發(fā)個性化治療方案。例如，在他們 的CCR5基因中攜帶特定突變的人可生成CCR5受體變體。這些受體變體不結合HIV，因此攜 帶受體變體的人變成HIV+及因此進展至AIDS的機會較低。通過確定相同樣品的復制品之間的變異，以及自不同個體獲得的樣品之間的變異，本發(fā)明還可用于測定適體對單一分子(如蛋白質(zhì))的特異性。本發(fā)明的用途還在于診斷法。具體而言，已知鑒定經(jīng)過驗證的生物標志物的一種 或多種適體可簡單地用于審查自個體采集的體液，如血液或血清。因為適體的結合指示了 蛋白質(zhì)的存在，所以可以使用一組適體來鑒定已知在異常狀態(tài)中發(fā)生改變的一種或一組生 物標志物蛋白質(zhì)。例如，可以使用序型分析來針對已知基線評估特定蛋白質(zhì)的數(shù)量。此類 用途的例子有作為妊娠測試或PSA水平測試的用途。又例如，敗血癥是一種異常狀態(tài)，其中 已知許多因子根據(jù)敗血癥的類型和感染的階段而上調(diào)或下調(diào)。此類診斷法可以是試劑盒的形式，其包括一組適體，該適體的結合指示自個體衍 生的生物學樣品中已知對特定異常狀態(tài)特異性的生物標志物的存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明可用于測定疾病進展。例如，敗血癥中的生物標志物 樣式在感染過程里有變化。鑒定生物標志物作為敗血癥進展指示劑會大大有助于制定適宜 的治療方案。本發(fā)明還容許進行患者序型分析，其又可用于指導治療方案和可能的預防處理。如此，本發(fā)明提供了單一平臺，在該平臺上可實現(xiàn)多種輸出。在又一個方面，本發(fā)明涵蓋克隆或單一分子陣列用于適體測序和計數(shù)的用途。發(fā)明人認識到可以理想地對適體進行適應性修改，以增強它們與下一代DNA測序 平臺的相容性。因此，可以增強適體，從而能夠使用此類技術平臺來進行適體測序和鑒定。 如此，從另一方面看，本發(fā)明涵蓋包含適體序列和銜接頭序列的能夠測序的適體。銜接頭序 列包含如下的序列，該序列使適體能夠附接于表面，從而能夠?qū)m體測序。能夠測序的適體可以另外包含用于對適體測序的測序引物。此類構建物可以包括超過一個測序和附著銜接頭。例如，適體序列可以夾在退火 至適體序列每個末端的測序和附著銜接頭對之間。能夠測序的適體還可以包含標記物，從而能夠進行適體顯現(xiàn)。可理解的是，可以使 用任何合適的標記物，包括熒光標記物和放射性標記物。本發(fā)明的能夠測序的適體可以在上文所述方法、用途、和診斷試劑盒中使用。下面經(jīng)由非限制性實施例來描述本發(fā)明，其中圖1圖示了本發(fā)明的方法，其中將適體序列文庫與血清蛋白質(zhì)組混合。洗脫結合 的適體/蛋白質(zhì)級分，之后在第二代測序儀上測序和計數(shù)。來自測序儀的輸出是結合的級 分中存在的每種序列的數(shù)目。圖2圖示了該方法用于生物標志物發(fā)現(xiàn)的用途，其中將來自不同患者的蛋白質(zhì)組 與基線或?qū)φ毡容^。圖3圖示了本發(fā)明的一個備選實施方案中，其中將適體文庫與第一血清蛋白質(zhì)組 樣品混合。對結合的級分定量后，擴增血清樣品內(nèi)與感興趣蛋白質(zhì)結合的適體群體并與第 二血清蛋白質(zhì)組樣品混合。然后進行第一和第二相應定量輸出的比較。圖4的層析圖顯示了將等體積的150nM IgE和IOOnM ProNuclFR溫育30分鐘后 獲得的混合物的不同成分。圖 5 顯示了與恒定的(IOOnM) ProNuclF 濃度一起溫育的 0/20/40. · · 2000nM IgE(自底部至頂部)的CE層析圖。圖6的圖顯示了對不同蛋白質(zhì)濃度作圖的結合的ProNuclF的級分。
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圖7是適體的下一代測序的適應樣品制備方案的示意圖。圖8的圖顯示了使用兩種不同分析方法找回的IgE適體序列的絕對計數(shù)。圖9的圖顯示了針對摻入無關(PhiX)序列混合物中的序列數(shù)目繪圖的通過下一 代測序計數(shù)得到的、序列混合物中存在的IgE適體序列的級分。實施例1此實施例圖示于圖1，其顯示了使用適體標簽文庫對血清樣品中的蛋白質(zhì)定量。針 對自血清得到的蛋白質(zhì)混合物篩選已知適體的多樣性文庫。在固體支持物上固定化蛋白質(zhì) 混合物并實施嚴格清洗以清除未結合的和弱結合的適體。然后自它們的蛋白質(zhì)宿主清除剩余的結合的適體，并在下一代測序儀上測序和計 數(shù)。排列后，可通過標準方法(如PCR)來擴增結合的適體序列以提高測序儀上信號相對于 背景噪聲的清晰度。來自測序儀的輸出會是如由適體文庫呈現(xiàn)的、生物學樣品中存在的蛋白質(zhì)的絕對定量。實施例2對于在生物標志物發(fā)現(xiàn)中的用途和如圖2所示，針對自不同個體得到的樣品篩選 適體文庫。還會要求合適數(shù)目的已知對照或健康樣品來建立基線或健康狀況。還會篩選一 定數(shù)目的、已知呈現(xiàn)疾病狀態(tài)的樣品。兩個群體(健康的對患病的)的比較會容許鑒定在兩 個群體間顯示顯著變化的適體。一旦闡明每種適體的序列，就可鑒定適體所結合的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)的鑒定可以通過下一代測序技術或基于蛋白質(zhì)組的方法(如層析和MS)來進行。實施例3此實施例描述了本發(fā)明的一種備選方法且圖示于圖3。針對第一生物學樣品篩選適體文庫。與實施例1或?qū)嵤├? —樣，清除未結合的 適體，自它們的宿主蛋白質(zhì)釋放剩余的結合的適體，并在下一代測序儀上測序和計數(shù)。然后針對第二生物學樣品篩選結合至第一樣品中蛋白質(zhì)的序列群。如前所述，丟 棄未結合的適體，并對剩余的適體測序和計數(shù)。如果這兩份樣品是自健康受試者得到的，那 么這兩份樣品之間的任何變化可歸于正常群體內(nèi)的變異。類似的，自已知患有特定疾病的 患者得到的兩份樣品的輸出之間的任何變化也可歸因于變異。然而，健康受試者與患病受 試者之間的任何顯著變異可歸因于由感興趣疾病引起的蛋白質(zhì)群體的變化。然后可以翻譯 其中找到顯著變化的適體序列以鑒定適體所結合的蛋白質(zhì)。實施例4在此實施例中，適體文庫包含至少一個對一種蛋白質(zhì)特異性的適體集合。同樣地， 該組可含有多個適體集合，其中每個集合是對不同蛋白質(zhì)特異性的。蛋白質(zhì)混合物可以僅僅是生物學樣品，如血液或血清?；蛘?，蛋白質(zhì)混合物可以是 通過對生物學樣品富集蛋白質(zhì)級分而獲得的。在此實施例中，必須小心使對蛋白質(zhì)群體的 破壞和變性最小化。針對蛋白質(zhì)混合物篩選已知的、選定的適體序列的文庫。在一個例子中，使蛋白質(zhì) 混合物結合至柱，并讓該組適體流過柱。清除不結合的適體。自它們的蛋白質(zhì)宿主移出結 合的適體，并在下一代測序儀上測序和計數(shù)。如果感興趣的蛋白質(zhì)確實是疾病狀態(tài)的生物標志物，那么適體可見于來自患病樣品的結合級分且不見于自健康個體得到的樣品。或者，蛋白質(zhì)作為生物標志物的作用可表 現(xiàn)為與健康受試者相比時患病個體中蛋白質(zhì)的上調(diào)或下調(diào)。實施例5在此實施例中，適體文庫含有已知對一種或多種蛋白質(zhì)特異性的一種或多種序 列。每種感興趣蛋白質(zhì)的身份也是已知的。文庫可包含對單一蛋白質(zhì)特異性的單一集合， 或者它可以包含對多種(an array of)蛋白質(zhì)特異性的多個集合。針對自個體得到的生物學樣品(如血液)篩選適體文庫?？梢栽谥С治锷媳３诌m 體文庫，并且生物學樣品通過適體。清除任何未結合的蛋白質(zhì)，并且保留適體蛋白質(zhì)復合 物。自它們的蛋白質(zhì)宿主釋放保留的適體，并在下一代測序儀上測序和計數(shù)?？梢允褂孟乱淮鷾y序儀上適體的存在和數(shù)量、或者缺失來診斷特定疾病或困境 (predicament)。實施例6設計了一種新的寡核苷酸適體，使得該適體與所使用的下一代DNA測序技術平臺 相容。該適體具有如下的寡核苷酸序列，其具有三個獨特區(qū)a)功能性適體區(qū)，b)銜接 頭區(qū)，和C)標記物。此研究中的適體區(qū)基于經(jīng)過充分研究的、對人免疫球蛋白E具有高親和力的適體 (Wiegand 等 Journal of Immunology(1996)157 221—230)。銜接頭區(qū)使得該構建物與Illumina GAl下一代測序儀的樣品制備規(guī)程相容，而且 是依照制造商的方案設計的。標記物是發(fā)熒光的6-羧基熒光素(FAM)，包括它是為了容許顯現(xiàn)構建物。構建物通過標準固相DNA合成獲得，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化以確保低錯誤率。帶FAM標記物的構建物在下文中稱作ProNuclF，而不帶標記物的稱作ProNucl。構建物用來證明i)此類適體衍生的單鏈寡核苷酸序列與用于下一代DNA序列應用的樣品制備規(guī) 程相容；ii)使用Illumina GAl測序技術能對序列測序，即能找回(“讀取”)ProNucl的 身份；及iii)遵循標準Illumina GAl測序?qū)嶒?，完整ProNucl序列的計數(shù)直接與摻入樣品 中的制備的ProNucl序列的數(shù)目關聯(lián)，由此證實下一代測序能依照本發(fā)明應用于蛋白質(zhì)組學。實施例7使用毛細管電泳(CE)來證實寡核苷酸序列展現(xiàn)獨特的蛋白質(zhì)親和力。試劑和溶液的制備如下自干的適體來源制備儲備IOOnM ProNucFl儲液，即在TGK緩沖液(三(羥基 氨基)甲烷-甘氨酸-鉀)緩沖液，PH 8.4)中稀釋DNA材料。稀釋后，將適體儲液于75°C 溫育10分鐘，隨后冷卻，并在冰中儲存以確保沒有多聚體。加熱規(guī)程還確保適體二級結構 的形成。
自濃縮的5500nM蛋白質(zhì)儲液開始，在TGK緩沖液中制備IgE的稀釋系列(表1)表l:lgE稀釋系列
溶液_濃度(nM)
1 . 20 通過將5 μ 1的ProNucFl儲液與5 μ 1蛋白質(zhì)溶液一起溫育來制備展現(xiàn)適體-蛋 白質(zhì)復合物形成的CE樣品。以此方式為每個蛋白質(zhì)濃度水平制備總共六份復制品。將所 有樣品于室溫溫育最少30分鐘且不長于40分鐘。設備分離是使用 Beckman P/ACE 2200 CE-LIF 系統(tǒng)(Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton， CA,USA)實現(xiàn)的。分離是使用熔融硅石毛細管(50 μ m ID,360ym0D)實施的，總長40. 2cm， 檢測儀位于30cm。通過泵入IM NaOH、去離子吐0、和緩沖液穿過毛細管，每種10分鐘，預 處理毛細管。在每次電泳分離之間，用堿、水、和緩沖液再次沖洗毛細管以自毛細管壁清除 任何殘留樣品。使用Ipsi壓力注射樣品4s。LIF檢測器采用3mW Ar離子激光的488nm 線(Beckman-Coulter)進行激發(fā)，并經(jīng)由520士 IOnm濾光片收集發(fā)射。用P/ACE軟件 (Beckman-Coulter)記錄并分析數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)-適體結合以正常模式使用表2所述條件在柱上運行每個蛋白質(zhì)濃度水平的樣品，首先確保 每份樣品溫育后確實形成了蛋白質(zhì)_適體復合物。表2:正常模式分離條件
操作_持續(xù)時間(S)_
沖洗20 psi —0.1 M NaOH120
沖洗20psi-緩沖液120注射Ipsi 4-樣品4 注射0.1 psi-水 1 分離 20kV 760
沖洗10 psi -緩沖液_60__結果作為例子，圖4顯示了含有150nM IgE和IOOnM ProNuclF的樣品的正常模式注射
14的層析圖。為了使適體-蛋白質(zhì)復合物形成適用定量目的，結合的適體級分必須反映蛋白質(zhì) 稀釋系列。為了證明這一點，將恒定量的ProNuclF與不同蛋白質(zhì)濃度一起溫育(見上文)。自圖5可見，隨著蛋白質(zhì)濃度升高(底部記錄線“O”；上部記錄線5000nM)，適 體-蛋白質(zhì)復合物的峰面積增大。同時，游離ProNuclF的信號降低至檢測不到游離適體的 點(上部記錄線)。這顯示了向針對IgE的已知適體序列添加對下一代測序規(guī)程特異性的 銜接頭序列沒有削弱ProNuclF的適體能力-ProNuclF保持其對IgE的高和選擇性親和力。圖6顯示了轉(zhuǎn)換成圖的圖5信息，其中將“結合的ProNuclF級分”對蛋白質(zhì)濃度 繪圖。自此圖可見，ProNuclF適體能用于“讀取出”定量蛋白質(zhì)信息。自此(和其它)圖還 有可能推導平衡解離常數(shù)Kd，由其可得知ProNuclF對IgE的親和力，即76_92nM。實施例8進行了實驗來證明在前實施例中所例示的結合特征在定量背景中是適用的，即 蛋白質(zhì)濃度的差異與結合的適體(適體_蛋白質(zhì)復合物)級分相關。對這些適體-蛋白 質(zhì)復合物的選擇是依靠平衡混合物的不平衡毛細管電泳(NECEEM)來實現(xiàn)的，NECEEM是由 Krylov 等開發(fā)的(Journal of the American ChemicalSociety (2002) 124 13674-13675; Analytical Chemistry(2003)75 1382—1386)。方法開發(fā)了適應樣品制備方案以容許對含有添加的測序序列的功能性IgE適體 (ProNucl)測序。圖7描繪了樣品制備方案中的不同步驟。測序引物位點1上引物1退火后，通過 用Taq聚合酶進行的延伸形成雙鏈分子。將銜接頭連接至雙鏈分子，生成完整分子。此研究中所使用的IgE適體序列是在其3’端具有測序引物位點1的單鏈寡核苷 酸。為了制備互補鏈，使加尾(tailed)引物與引物1退火，并使用Taq聚合酶實施延伸。此反應的配方為10 μ M Pronucl2μ 110 μ M 引物 15μ 12. 5mM dNTPs4μ 1IOx Taq聚合酶緩沖液5μ150mM MgCl22μ 1Taq 聚合酶0. 5 μ 1水31.5μ1將反應物混合并加熱至94°C達2分鐘，接著受控冷卻至60°C并于72°C溫育10分 鐘。使用Qiagen MinElute柱按照制造商的說明清潔反應產(chǎn)物，并在10 μ IEB緩沖液中洗 脫。通過加熱至94°C達2分鐘并受控冷卻至室溫，將100 μ M ProAdl和ProAd2銜接頭 溶液各20 μ 1在總體積50 μ 1 IOmM Tris-HCl ρΗ 8. 3中一起退火。ProAdl和ProAd2是自 Illumina GAl試劑盒得到的合成寡核苷酸。所使用的混合物為Ds 適體10 μ 1
2x DNA Illumina 連接酶緩沖液 25 μ 1 退火后的銜接頭寡聚物混合物 10 μ 1 Illumina DNA 連接酶 5 μ 1將反應物混合并于室溫溫育15分鐘，之后在2%瓊脂糖中進行凝膠電泳。自凝膠 切出適宜大小的條帶，提取DNA，并遵循標準Illumina富集PCR方案進行擴增。使用Agilent Bioanalyzer 2100對PCR擴增子定量，并通過如下制備測序反應 物將這些擴增的適體添加至恒定量的PhiX，意圖產(chǎn)生表3給出的11 IuminaGAl簇數(shù)目/格 (tile)，以產(chǎn)生2x稀釋系列。第4道是沒有添加適體的PhiX，充當對照道。為了避免懷疑，PhiX指雙鏈DNA PhiX174噬菌體的環(huán)狀基因組，其由5386個核苷 酸組成。在此研究中，依照Illumina GAl測序方案加工該基因組，充當不同道中序列載荷 的標準化。準備單末端流動室(single end flowcell)，并在Illumina GAl上按照制造商的 說明測序。表3 =Illumina GAl流動室上八條不同道的每個格所使用的實際ProNucl和PhiX 序列數(shù)目。一條道由約300個格組成。 結果按照制造商的說明加工測序數(shù)據(jù)。對于數(shù)據(jù)分析，應用不同策略來評估在不同道 中獲得的序列讀取a)對適體序列的精確匹配的搜索(Exact) ；b)容許多至3處擴增/測 序錯誤的搜索(Agi^p)。顯然也可以應用其它加工方法。圖8描繪了在不同道中通過尋找 在不同道中找回的精確匹配/至多三處錯誤的匹配，即精確適體序列計數(shù)和容錯適體序列 計數(shù)(Agr印)而計數(shù)得到的IgE適體絕對數(shù)。X軸的數(shù)值對應于第8道直至第1道的道讀 數(shù)(排除對照第4道；見表3)。相反，圖9相對于摻入PhiX序列混合物中的適體數(shù)目描繪了通過在獲得的全部序 列中尋找精確匹配而計數(shù)得到的IgE適體級分。在這兩種情況中都顯示了強線性相關性， 證實了下一代測序用于對適體定量的用途。上述數(shù)據(jù)顯示了，當遵循標準Illumina GAl測序方案時，全部ProNucl序列的計 數(shù)直接與摻入樣品中的制備的ProNucl序列的數(shù)目相關，由此證實下一代測序能依照本發(fā)
明用于定量。
此外，數(shù)據(jù)顯示了所制備的ProNucl序列能使用下一代測序技術來測序。換言之， 能找回(“讀取”)ProNucl的身份。
權利要求
一種用于測量生物學樣品中至少一種分子的量的方法，該方法包括a)將所述樣品或其衍生物與一種或多種適體組合并容許所述樣品中的一種或多種分子結合至所述適體；b)將結合的分子與未結合的分子分開；并c)對結合至所述或每種適體的分子定量，其中對結合的分子的定量是通過對所述或每種適體的至少一部分測序來進行的。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述至少一種分子是蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述分子的身份是已知的。
4.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述分子的身份是未知的。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中該方法進一步包括確定所述分子的身份。
6.根據(jù)權利要求1-4任一項的方法，其中所述或每種適體的序列是已知的。
7.根據(jù)權利要求1-6任一項的方法，其中每種適體序列攜帶獨特的標簽。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中所述標簽是所述適體的序列。
9.根據(jù)權利要求7或8的方法，其中所述標簽是所述適體的序列的一部分。
10.根據(jù)權利要求1-9任一項的方法，其中測序是在單分子陣列或克隆單分子陣列上 進行的。
11.根據(jù)權利要求1-10任一項的方法，其中該方法進一步包括清除結合至所述或每種 分子的所述適體并將所述適體排列在表面上。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中該方法進一步包括擴增所排列的適體。
13.根據(jù)權利要求1-12任一項的方法，其中所述一種或多種適體包含結合相同分子的 不同序列。
14.根據(jù)權利要求1-12任一項的方法，其中所述一種或多種適體包含多組適體序列， 每組結合不同分子。
15.根據(jù)權利要求1-14任一項的方法，其中所述適體是自多核苷酸或多肽衍生的。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述適體是多核苷酸且具有約30個至約60個堿基。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中所述適體具有約40個堿基。
18.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述適體是多肽且具有約30個至約60個氨基酸。
19.根據(jù)權利要求1-18任一項的方法，其中所述生物學樣品是體液。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中所述體液是血液或者是自血液衍生的。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述體液是血清或血漿。
22.根據(jù)權利要求1-21任一項的方法，其中該方法進一步包括d)將第二生物學樣品與c)中獲得的定量的適體組合；e)將結合的分子與未結合的分子分開；f)對結合至適體的分子定量；并g)將c)中獲得的數(shù)量與f)中獲得的數(shù)量比較，其中對結合至第二樣品中一種或多種分子的適體的定量是通過對每種適體的至少一 部分測序來進行的。
23.根據(jù)權利要求1-22任一項的方法，其中該方法進一步包括將所述或每種適體的數(shù) 量與對照或基線數(shù)量比較。
24.根據(jù)權利要求22或23的方法，其中所述第二樣品是自已知處于疾病狀態(tài)的個體獲 得的。
25.根據(jù)權利要求22或23的方法，其中所述第二樣品是自已知處于健康狀態(tài)的個體獲 得的。
26.根據(jù)權利要求22或23的方法，其中所述第二樣品是自藥物治療后的個體獲得的。
27.權利要求1-26任一項的方法用于鑒定一種或多種生物標志物的用途。
28.權利要求1-26任一項的方法用于驗證一種或多種生物標志物的用途。
29.權利要求1-21任一項的方法作為診斷方法的用途。
30.通過權利要求1-26任一項的方法鑒定的適體在診斷試劑盒中的用途。
31.以權利要求1-26任一項的方法使用的診斷試劑盒，其中該試劑盒包含一種或多種 適體。
32.根據(jù)權利要求31的診斷試劑盒，其中所述一種或多種適體是通過權利要求1-26任一項的方法鑒定的。
33.適體作為標簽用于對樣品中的分子定量的用途，其中所述適體的序列的至少一部 分是所述標簽。
34.根據(jù)權利要求33的用途，其中所述分子是蛋白質(zhì)。
35.根據(jù)權利要求33或34的用途，其中定量是通過對所述標簽的至少一部分測序來進 行的。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其中測序是在單分子陣列或克隆單分子陣列上進行的。
37.一種能夠測序的適體，其包括 適體序列；和至少一種銜接頭序列，其中所述銜接頭序列包含供所述適體附接于表面用來測序的附著序列。
38.根據(jù)權利要求37的適體，其中所述銜接頭序列進一步包含測序引物。
39.根據(jù)權利要求37或38的適體，其中所述適體序列是DNA、RNA、PNA或其混合物。
40.根據(jù)權利要求37-39任一項的適體，其中該適體進一步包括標記物。
41.根據(jù)權利要求40的適體，其中所述標記物是放射性標記物或者是發(fā)熒光的。
42.根據(jù)權利要求41的適體，其中所述標記物是6-羧基熒光素。
43.權利要求37-42任一項的適體在權利要求1-26任一項的方法或權利要求31或32 的診斷試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明是用于測量生物學樣品中至少一種分子的量的方法，該方法包括a)將所述樣品或其衍生物與一種或多種適體組合并容許所述樣品中的一種或多種分子結合至所述適體；b)將結合的分子與未結合的分子分開；并c)對結合至所述或每種適體的所述分子定量，其中對結合的分子的定量是通過對所述或每種適體的至少一部分測序來進行的。還涵蓋所述方法的用途和自所述方法衍生的產(chǎn)品。
文檔編號C12N15/115GK101896605SQ200880120684
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2007年10月12日
發(fā)明者克萊夫·G·布朗, 凱恩·卡斯, 斯文·A·J·艾克曼 申請人:普羅諾塔股份有限公司