專利名稱：用于檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品epsps基因的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品快
速篩選與檢測(cè)的方法，具體是一種快速檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品內(nèi)含的整合基因
EPSPS所用的引物序列。
背景技術(shù)：
植物基因工程的迅速發(fā)展促進(jìn)了許多轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)，它們對(duì)人類健康及環(huán)境安全的影響受到全世界的廣泛關(guān)注?？茖W(xué)地對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行長期有效地監(jiān)控，建立快速、有效的檢測(cè)方法體系，對(duì)人類健康及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。由于對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品安全性的關(guān)注及國際貿(mào)易等問題，世界許多國家紛紛出臺(tái)了嚴(yán)格的管理法規(guī)?，F(xiàn)有135個(gè)國家在2000年1月對(duì)此已達(dá)成協(xié)議。如歐盟規(guī)定，食品中基因修飾物質(zhì)(genetically modified orgnisms， GM0s)的含量如果超過1 % ，就必須在標(biāo)簽上做出標(biāo)示。我國于2002年5月公布了轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)規(guī)定，并于2003年3月20起正式實(shí)施。我國政府規(guī)定，凡是列入標(biāo)識(shí)管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)當(dāng)加以標(biāo)識(shí)，未標(biāo)識(shí)和不按規(guī)定標(biāo)識(shí)的，不得進(jìn)口和銷售。這樣，就必須對(duì)農(nóng)作物中的GMOs進(jìn)行檢測(cè)。
除草劑是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分重要的生產(chǎn)資料，為拓展除草劑的應(yīng)用范圍和防止除草劑藥害，世界各國對(duì)抗除草劑作物品種的選育高度重視，現(xiàn)已育成了一系列抗除草劑的作物品種，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆便是其中最有代表性的抗除草劑作物類型之一。草甘膦是一種非選擇性除草劑，它通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干擾芳香族氨基酸的生物合成而發(fā)揮毒性作用。當(dāng)前用于生產(chǎn)的抗草甘膦大豆主要是以CP4-EPSPS基因轉(zhuǎn)化大豆獲得的。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的育成和應(yīng)用極大地拓展了草甘膦的應(yīng)用范圍和機(jī)動(dòng)性，為豆田雜草防除帶來了歷史性變革。
抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是通過膿桿菌介導(dǎo)、PEC介導(dǎo)、電擊、花粉管通道、微注射和基因槍等方法將外源基因EPSPS導(dǎo)入大豆植株體內(nèi)而獲得的。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法已有不少報(bào)道，目前建立的檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品方法主要依照檢測(cè)內(nèi)源基因Lectin,35S啟動(dòng)子，NOS終止子和目的基因EPSPS，操作比較繁瑣，且由于豆制品經(jīng)過高溫等處理基因結(jié)構(gòu)遭到破壞，較難檢測(cè)。近年來出現(xiàn)的以蛋白為目標(biāo)的檢測(cè)方法(ELISA和膠體金快速檢測(cè)試紙條法)價(jià)格昂貴，難在日常檢測(cè)中普及。LAMP技術(shù)是2000年NotomiT等發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增方法，即所謂的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification，簡(jiǎn)稱LAMP)技術(shù)。因其具有高特異性、高效率和快速反應(yīng)等特點(diǎn)，可以大量擴(kuò)增所需的靶序列。該方法只需要極少的試劑費(fèi)用和一個(gè)水浴鍋即可完成絕大多數(shù)PCR檢測(cè)的過程，無論是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)還是現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)都可以準(zhǔn)確快速靈敏的完成，是真正普及型的核酸檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)EPSPS基因設(shè)計(jì)一組特異性引物，進(jìn)而建立一種快速篩選和檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工豆制品的方法，以克服基于蛋白的檢測(cè)方法在豆制深加工產(chǎn)品檢測(cè)中的局限性，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)提供有效工具，從而加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督監(jiān)管，確保產(chǎn)品標(biāo)簽的一致性，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。 本發(fā)明的主要原理為設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；其中一個(gè)內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動(dòng)的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA;內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA;在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到109 101Q拷貝。擴(kuò)增結(jié)果可通過熒光染料染色肉眼觀察。 本發(fā)明涉及的EPSPS基因環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)用的引物，其序列如下
(1)上游內(nèi)引物(FIP) :5， -AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3';
(2)下游內(nèi)引物(BIP) :5' -AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3';
(3)上游外引物(F3) :5' -CCATGGGCGCCAGGAT-3';
(4)下游外引物(B3) :5' -ATCGGGCGCTTTGTGAG-3'。 在應(yīng)用中，上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物體積比為
6:6:i:i。 使用上述引物，檢測(cè)產(chǎn)品中抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物成分的方法，依次包括下列步驟
(1)_(3): (1)待檢樣品DNA的提取 DNA提取可采用普通酚_氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。[OO1 S] (2) EPSPS環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入lOXBst buffer反應(yīng)緩沖液2. 5ii L(內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1 %曲拉通X-100) 、25mmol/LdNTP1. 3 ii L、 lOOmmol/L硫酸鎂3 ii L、2mol/L甜菜堿5ii L、10iimol/L上游內(nèi)引物3ii L、10iimol/L下游內(nèi)引物3 y L、 10 y mol/L上游外引物O. 5iiL、10iimol/L下游外引物0. 5iiL、8U/iiL Bst DNA聚合酶1 ii L、 ddH20 (滅菌雙蒸水)3. 2 ii L，混勻;B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA2 y L(約200ng)，混勻； C.于恒溫水浴上65"放置60min ; D.將水浴調(diào)到85t:中止反應(yīng)，5min后取出待檢。 (3)結(jié)果檢測(cè) 在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入lyL顯色劑PICO Green，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為紅色，說明待檢樣品未檢出EPSPS基因，如果顏色變?yōu)槌赛S色，則說明檢出EPSPS基因，待檢樣品中含有抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物成分。也可以通過瓊脂糖電泳對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。配制1.5^的瓊脂糖凝膠，LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果取2iiL進(jìn)行瓊脂糖電泳。調(diào)整電泳儀至80V電泳約45min，置于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本發(fā)明根據(jù)EPSPS基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物。該組引物可保證在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物中EPSPS基因的檢出。使用該組引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可靈敏、特異地檢出轉(zhuǎn)基因大豆及加工品中的EPSPS基因。該方法不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋，且結(jié)果可以用凝膠電泳方法來觀察，亦可以使用熒光染料觀察，簡(jiǎn)單而快速，特別適用于一些基層單位。


圖1用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)某待測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆樣品DNA，樣品的顯色反應(yīng)。 圖2用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)某待測(cè)豆制品——豆腐樣品DNA，樣品的電泳檢測(cè)反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。 實(shí)施例1 按照以下程序進(jìn)行檢測(cè) (1)待測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆樣品DNA的提取 A.稱取0. lg大豆，磨碎，轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中。加入600 ii L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65t:水浴保溫10min ;B.在管中加入等體積酚/氯仿600 ii L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ; C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，
混勻，常溫放置10min后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀； D.在沉淀中加入60iiL RNA酶，37t:放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37t:溶解沉淀，5min后加入300 y L緩沖液，上下顛倒混勻10次； E.取出離心柱，將離心柱放置在1個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ; F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200 ii L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； G.在離心柱中加入200iiL70X乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液； I.將離心柱放置在一個(gè)新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 y L洗脫緩沖液，37t:放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。
(2)待測(cè)大豆樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入10XBst buffer反應(yīng)緩沖液2. 5ii L(內(nèi)含200mmo1/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1 %曲拉通X-100) 、25mmol/LdNTP1. 3 ii L、 10Ommol/L硫酸鎂3 ii L、2mol/L甜菜堿5ii L、10iimol/L上游內(nèi)引物3ii L、10iimol/L下游內(nèi)引物3 y L、 10 y mol/L上游外引物O. 5iiL、10iimol/L下游外引物0. 5iiL、8U/iiL Bst DNA聚合酶1 ii L、 ddH20 (滅菌雙蒸
5水)3. 2 ii L，混勻;B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA 2 ii L(約200ng)，混勻； C.于恒溫水浴上65"放置60min ; D.將水浴調(diào)到85t:中止反應(yīng)，5min后取出待檢。 (3)加入顯色劑PICO Green，顯色檢測(cè) 樣品管顏色變?yōu)槌赛S色，見圖1。陰性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果均正常，據(jù)此可判定該
樣品檢出EPSPS基因。 實(shí)施例2 按照以下程序進(jìn)行檢測(cè) (1)待測(cè)豆腐樣品DNA的提取 A.稱取0. lg豆腐，剪碎，轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中。加入600 ii L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65t:水浴保溫lOmin ; B.在管中加入等體積酚/氯仿600 L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ;C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，
混勻，常溫放置lOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀； D.在沉淀中加入60iiL RNA酶，37t:放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37t:溶解沉淀，5min后加入300 y L緩沖液，上下顛倒混勻10次； E.取出離心柱，將離心柱放置在1個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ; F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200 ii L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； G.在離心柱中加入200iiL70X乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液； I.將離心柱放置在一個(gè)新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 y L洗脫緩沖液，37t:放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。
(2)待測(cè)豆腐樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入lOXBst buffer反應(yīng)緩沖液2. 5ii L(內(nèi)含200mmo1/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1 %曲拉通X-100) 、25mmol/LdNTP1. 3 ii L、 10Ommol/L硫酸鎂3 ii L、2mol/L甜菜堿5ii L、10iimol/L上游內(nèi)引物3ii L、10iimol/L下游內(nèi)引物3 y L、 10 y mol/L上游外引物O. 5iiL、10iimol/L下游外引物0. 5iiL、8U/iiL Bst DNA聚合酶1 ii L、 ddH20 (滅菌雙蒸水)3. 2 ii L，混勻; B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA 2 ii L (約200ng)，混勻； C.于恒溫水浴上65"放置60min ; D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。 (3)瓊脂糖電泳檢測(cè) 對(duì)豆制品——豆腐樣品進(jìn)行LAMP檢領(lǐng)"電泳圖譜見圖2。結(jié)果表明豆腐樣品出現(xiàn)階梯狀條帶，而陰性和空白對(duì)照均沒有條帶產(chǎn)生，即檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分EPSPS基因。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果均正常，據(jù)此可判定該樣品檢出EPSPS基因陽性。核苷酸序列表〈110〉山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心〈120〉用于檢測(cè)EPSPS基因的引物〈160>4<210>1〈211>38〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>prim_bind〈222>(1)... (38)〈400〉1aatcgagcggcgcctcaggccgtaaggaaggcgacacc〈210>2〈211>33〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>prim_bind〈222〉(1)…(33)〈400>2aatgccgccacgggctcgtcgccgatgaaggtg〈210>3〈211〉16〈212>DNA〈213〉人工序列〈221〉prim_bind〈222>(1)... (16)〈400>3ccatgggcgccaggat〈210>4〈211>17<212>廳〈213〉人工序列〈221>prim_bind〈222〉(1)…(17)〈400〉4atcgggcgctttgtgag
權(quán)利要求
抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品EPSPS基因LAMP快速檢測(cè)用的上游引物和下游引物，其特征在于上游內(nèi)引物序列為5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；下游內(nèi)引物序列為5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；上游外引物序列為5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；下游外引物序列為5’-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明屬于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品的快速篩查與檢測(cè)技術(shù)，具體地是用于檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物常用插入基因EPSPS的引物組。本發(fā)明針對(duì)EPSPS基因，根據(jù)其保守序列，設(shè)計(jì)兩組特異性引物。使用該組引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，可快速、靈敏、特異地檢測(cè)EPSPS基因，從而篩選產(chǎn)品中是否含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物成分。該引物也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101781676SQ20091000336
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者劉彩霞, 孫敏, 徐彪, 林超, 梁成珠, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心