大豆開花基因FL1(PRR-like)及其編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆開花基因FLl(PRR-like)及其編碼蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物蛋白質(zhì)和油份。在世界范圍內(nèi)，北至高煒度的北歐瑞 典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區(qū)域內(nèi)均有大豆栽培，但單個品種或種質(zhì)資源 一般適宜種植的煒度跨度較小，這種區(qū)域適應(yīng)性與大豆的生育期基因密切相關(guān)。迄今已發(fā) 現(xiàn)了 10個主要影響大豆開花期和成熟期（生育期）基因位點E1-E9和J。但大豆的開花期 是一個數(shù)量性狀，受多個基因同時控制，發(fā)掘與大豆生育期有關(guān)的數(shù)量性狀遺傳位點，從而 找到該遺傳距離之間起作用的基因，有利于進(jìn)一步豐富大豆生育期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和深化大豆生 育期機(jī)制的研宄有重要意義。
[0003] 在大豆中，PRR家族基因是生物鐘的重要組成部分，且該家族基因在不同物種中具 有高度保守的特征。在大豆中，還沒有關(guān)于PRR家族基因的報道，因此對PRR家族基因的研 宄對于研宄大豆的生物鐘規(guī)律具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因FL1 (PRR-like)及其編碼蛋白。
[0005] 本發(fā)明的大豆開花基因FL1 (PRR-like)的基因序列如序列表Seq IDNo:1所示。
[0006] 本發(fā)明的大豆開花基因FL1 (PRR-like)的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No: 2所示。
[0007] 本發(fā)明的有益效果：
[0008] 本發(fā)明是在遺傳數(shù)量性狀研宄的基礎(chǔ)上，利用分子手段首次成功地克隆出生育期 基因FL1 (PRR-like)。
[0009]本發(fā)明利用大豆品種TK780和H4雜交后代所產(chǎn)生E1背景下的60個重組自交系 個體，通過兩種不同的遺傳定位方法（MQM和MCIM)都檢測到在11號染色體的Satt519附 近有一個關(guān)于大豆開花期的QTL。把Satt519附近的基因與擬南芥開花期基因進(jìn)行比對， 發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間，只有一個大豆基因與擬南芥的開花基因同源，即FL1 (PRR-like)基因，并對 此基因進(jìn)行了克隆。本發(fā)明獲得的FL1 (PRR-like)基因編碼區(qū)全長序列（SeqIDNo:1)與 phytozome(http://www.phytozome.net)中公布的GlymaU034500. 1 (大豆基因組Glymal. 0 版本的基因詮釋）相對應(yīng)，但是其序列并不一致，本發(fā)明獲得的FL1 (PRR-like)基因翻譯的 蛋白質(zhì)具有836個氨基酸（SeqIDNo:2)。通過轉(zhuǎn)基因，驗證了FL1 (PRR-like)基因具有 強(qiáng)烈抑制大豆開花的生理功能。
[0010] 同時，通過同源比對，發(fā)現(xiàn)FL1 (PRR-like)基因與擬南芥PRR家族具有很高的同源 性。通過對FL1 (PRR-like)蛋白的研宄，表明該基因含有一個CCT模塊和一個未知功能的 PRR結(jié)構(gòu)域。
【附圖說明】
[0011] 圖1為PTF10I-FL1 (PRR-like)質(zhì)粒過表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012] 圖 2 為Williams82 轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因和未轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因大豆 的開花時間圖；其中，W82為Williams82未轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因的大豆，35S:FL1為 Williams82轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因后的大豆。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0013] 一：本實施方式的大豆開花基因FL1 (PRR-like)的基因序列如序列 表SeqlDNo:1 所示。
[0014] 本實施方式對TK780和H4雜交后代的重組自交系進(jìn)行研宄，并確定了 FL1 (PRR-like)基因，其與大豆開花期關(guān)系密切。
[0015] 本實施方式通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化手段，將FL1 (PRR-like)基因在大豆中表達(dá)，驗證 了本發(fā)明的FL1 (PRR-like)基因能夠顯著的抑制大豆開花。
【具體實施方式】 [0016] 二：本實施方式的大豆開花基因FL1 (PRR-like)的編碼蛋白的氨基 酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
[0017] 通過以下試驗驗證本發(fā)明的效果：
[0018] (1)大豆開花期FL1 (PRR-like)基因的獲得
[0019] 一、在2010年，將TK780和H4雜交后代產(chǎn)生的96個重組自交種植在中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研宄所哈爾濱園區(qū)院內(nèi)，并檢測花期；
[0020] 二、利用已經(jīng)構(gòu)建的遺傳圖譜，結(jié)合檢測的花期數(shù)據(jù)，進(jìn)行遺傳數(shù)量性狀定位，初 步遺傳定位只發(fā)現(xiàn)一個主效QTL，即E1;
[0021] 三、為了排除E1的效應(yīng)，我們將96個重組自交系分成兩個亞群體：E1背景下的60 個個體和elnl背景下的36個個體；
[0022] 四、利用E1背景下的60個個體進(jìn)行QTL檢測時，我們在Satt519發(fā)現(xiàn)了一個與大 豆開花期密切相關(guān)的QTL;
[0023] 五、將此標(biāo)記附近的大豆基因提取出來，與擬南芥的開花期基因聚類分析比較，發(fā) 現(xiàn)唯一一個與擬南芥開花有關(guān)的基因，即FL1 (PRR-like)基因；
[0024] 六、以大豆品種H4的葉片為材料，用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的 操作手冊提取葉片總RNA;
[0025] 七、采用DNaseI處理步驟六提取的總RNA;
[0026] 八、取1yg步驟七處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購買 自BD Biosciences Clontech公司的BD SMART?RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的 使用手冊進(jìn)行，獲得cDNA;
[0027] 九、以獲得的cDNA為模板通過F1與R1引物擴(kuò)增FL1 (PRR-like)基因，PCR反應(yīng) 條件如下：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min30s，共35循環(huán)， 再72°C延伸5min，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測序儀（ABI公司）上進(jìn)行測序；
[0028] 其中，引物F1的序列為5' TTTTCAGTGC GGTTGATATA 3'；引物R1的序列為 5, GAACGGAATC AGTCAAATAA 3,。
[0029]測序結(jié)果表明大豆開花基因FL1 (PRR-like)具有序列表中SeqIDNo:1的核苷酸 序列，序列表中的Seq ID No :1由2511個核苷酸組成，并編碼具有序列表中Seq ID No :2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0030] (2)大豆開花基因FLl(PRR-like)的功能驗證
[0031] -、以大豆品種H4的葉片為材料，用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的 操作手冊提取葉片總RNA ;
[0032] 二、采用DNase I處理步驟一提取的總RNA ;
[0033] 三、取1 yg步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購買 自BD Biosciences Clontech公司的BD SMART?RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的 使用手冊進(jìn)行，獲得cDNA;
[0034] 四、分別以FLl(PRR-like)基因F2與R2為引物，對步驟三獲得的cDNA通過PCR 進(jìn)行5'與3'擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸3min，共35循環(huán)，再72°C延伸5min，獲得含有Xbal-SacI雙酶酶切位點的大豆開花基因 FLl(PRR-like)；
[0035] 五、將獲得的含有酶切位點的大豆開花基因FLl(PRR-like)克隆到pTFlOl質(zhì)粒 中，獲得pTFlOl-FLl(PRR-like)質(zhì)粒，以Willimas 82為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳 轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)FLl(PRR-like)基因大豆，將轉(zhuǎn)FLl(PRR-like)基因大豆和Willimas 82在16 小時光照和8小時黑暗條件下種植，觀察它們的開花狀態(tài)；
[0036]其中，引物F2的序列為5'GCTCTAGAGA TGAACAATAA TGITGGGAA 3'；引物R2的序 列為5'CGAGCTCGTT ATTGAGGAAT GTCGATAG 3'。
[0037] 步驟五獲得的pTF101-FLl (PRR-like)質(zhì)粒過表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示；
[0038] Williams 82轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因和未轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因大豆的開花 時間圖如圖2所示；其中，W82為Williams 82未轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因的大豆，35S:FL1 為Williams 82轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因后的大豆；從圖2可以看出，W82的開花時間為 50天，F(xiàn)L1 :35S的開花時間為55天，表明轉(zhuǎn)入FL1 (PRR-like)基因后的大豆開花時間比 Willimas 82的開花時間晚5天，從而說明FL1 (PRR-like)基因具有抑制大豆開花的功能。
【主權(quán)項】
1. 大豆開花基因FL1 (PRR-like)，其特征在于大豆開花基因FL1 (PRR-like)的基因序 列如序列表Seq ID No :1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的大豆開花基因FL1 (PRR-like)的編碼蛋白，其特征在于大豆開 花基因FL1 (PRR-like)的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。
【專利摘要】大豆開花基因FL1(PRR-like)及其編碼蛋白，它涉及大豆開花基因FL1(PRR-like)及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因FL1(PRR-like)及其編碼蛋白。本發(fā)明的大豆開花基因FL1(PRR-like)的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。本發(fā)明大豆開花基因FL1(PRR-like)的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。本發(fā)明通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化驗證，表明FL1(PRR-like)基因抑制大豆開花的生理功能。本發(fā)明應(yīng)用于大豆基因工程領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-29, C07K14-415
【公開號】CN104593382
【申請?zhí)枴緾N201510001534
【發(fā)明人】孔凡江, 劉寶輝, 蘆思佳, 曹東, 王家麟
【申請人】中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月4日