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      一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法

      文檔序號(hào):571629閱讀:285來源:國(guó)知局
      專利名稱:一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及了 一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法。
      背景技術(shù)
      隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快,人們對(duì)石油的依賴越愛越大,使港口和沿海油輪密度增大,使得原已十分繁忙的通航環(huán)境更加復(fù)雜,導(dǎo)致船舶溢油污染的風(fēng)險(xiǎn)增大。近幾年的溢油事件造成了大面積的海洋污染,給海域的生態(tài)環(huán)境帶來巨大的損失,已經(jīng)引起了人們的重視。目甜對(duì)于油品毒性的檢測(cè)很大程度上依靠化學(xué)手段和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),但是這種方法價(jià)格昂貴、需要很多動(dòng)物,而且費(fèi)時(shí)。因而近年來更傾向于一種快速、簡(jiǎn)便的方法,發(fā)光細(xì)菌的毒性檢驗(yàn)方法就是符合這些要求的生物檢測(cè)方法之一。目前我國(guó)己經(jīng)制定了發(fā)光細(xì)菌的水質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T15441-1995),國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者也通過發(fā)光細(xì)菌對(duì)一些油品的生物毒性進(jìn)行了檢測(cè),但是由于實(shí)驗(yàn)采用的發(fā)光細(xì)菌是從海洋中提取來的,而在以往的檢測(cè)過程中都是利用純水作為配制水融合組分的溶劑,這樣就改變了發(fā)光細(xì)菌的鹽度,給結(jié)果來了一定的影響。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明針對(duì)上述問題,提供了一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法,它通過人工海水作為水融合組分制備的溶劑,并采用半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o作為油類在水中生物毒性的判定標(biāo)準(zhǔn),使難溶的油類的生物毒性判定更加科學(xué)和準(zhǔn)確,從而實(shí)現(xiàn)油品生物毒性的分級(jí)。
      本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法,具體步驟如下-
      一、 發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)
      菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(P/^o^"m'ww/7/m;^we,),制備發(fā)光菌新鮮菌懸液n)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面上接出第一代斜面,25'C土0.5。C培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面,25。C土0.5。C培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面,25'C土0.5。C培養(yǎng)24h后備用。
      (2) 搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán),接種于裝有30ml細(xì)菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶中,25°C±0. 5°C, 160r/min下培養(yǎng)24h備用。
      (3) 將培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌菌懸液稀釋至每毫升108個(gè)~109個(gè)細(xì)胞,初始發(fā)光度不低于800mV,備用。
      斜面和菌液的營(yíng)養(yǎng)基為
      胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
      酵母0.5g &油0.3g蒸餾水100ml固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g
      二、 水融合組分的制備
      在毒性試驗(yàn)中實(shí)際評(píng)定的是油類在水中溶解的成分和在水相中穩(wěn)定存在的小油珠部分,既水融合組分WAF。我們將配置好的人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液。人工海水
      的配方為
      NaCl 20gMgS04 3.6gMgCl 7.2 g
      無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml
      油類在水中的載荷率可以直接根據(jù)單位體積溶液添加的材料的重量(w/v)為基礎(chǔ)進(jìn)行添
      加。設(shè)置10g/L、 8 g/L、 6 g/L、 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7個(gè)載荷率梯度。
      如果試驗(yàn)材料比水密度小,應(yīng)采用從容器底部攪拌試驗(yàn)材料的攪拌器,而對(duì)于那些密度比水大的試驗(yàn)材料,則應(yīng)采用從容器頂部攪拌試驗(yàn)溶液的攪拌器,攪拌器的攪拌速度應(yīng)該適當(dāng)、勻速, 一般液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗(yàn)液高度的1(W-35%。對(duì)于同一種油溶液WAF的制備,攪拌速度應(yīng)相同。攪拌時(shí)速度不要太快,速度在1200-1500rpm/min為宜,防止乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生。
      在制備WAF溶液時(shí),為了使油與水充分融合,需要一定的攪拌時(shí)間,隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng),.水中油的含量增加,但增加量逐漸平緩。 一般需要攪拌24h,攪拌后,為使混合液中非分散的油成分與已分散和溶解組分分離,應(yīng)靜置4h。
      在為一種油制備不同載荷率的WAF時(shí),必須用一個(gè)載荷率制備一種WAF,不能僅制備--種WAF,經(jīng)過稀釋后制成試驗(yàn)用WAF系列,因?yàn)樵囼?yàn)材料在較低載荷率時(shí),各種成分的溶解度不同。
      三、 發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光度的測(cè)定
      測(cè)定時(shí)的室溫要控制在2o 25'c,同一批樣品在測(cè)定過程中要求溫度波動(dòng)不超過士rc。取
      若干試管,給每支作為對(duì)照管的試管加1.98ral的人工海水,給每支作為樣品管的試管加1. 98ml的WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細(xì)菌菌液0. 02ml,放入發(fā)光光度計(jì)中檢測(cè)。
      i-s甜ttf弁w、 _樣品管發(fā)光度(w^)相對(duì)放光度(%) I照管發(fā)光度(附巧
      四、 半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o的確定
      (1) 繪制試驗(yàn)材料載荷率(mg/L)與其相對(duì)發(fā)光度(%)的相關(guān)曲線或相關(guān)方程。
      (2) 在相關(guān)曲線坐標(biāo)圖上,相對(duì)發(fā)光度50。/。處畫一水平線,與相關(guān)曲線有一交點(diǎn),該點(diǎn)的載荷率即是半數(shù)效果載荷EL5o值。如建立了相關(guān)方程,也可代入該方程求出樣品的仏50值。(3)根據(jù)表2的化5。值鑒別不同油品的生物毒性。
      表2.難溶物質(zhì)急性生物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)毒性等級(jí)EU。載荷率/ (tng' L—')毒性級(jí)別
      > 10000無毒
      I10000-5000微毒
      II5000-1000低毒
      III1000-100中毒
      IV100-10重度
      V10-1咼毒
      VI< 1劇毒
      本發(fā)明的有益效果是通過人工海水配置水融合組分,可以在檢測(cè)過程中更加滿足發(fā)光細(xì)菌的生活條件,減少細(xì)菌由于反應(yīng)條件的影響而給結(jié)果帶來的誤差,使檢測(cè)結(jié)果更加科學(xué)可靠。


      圖1為實(shí)施例相對(duì)發(fā)光度與載荷率的關(guān)系曲線及相關(guān)方程。
      具體實(shí)施例方式
      一、 發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)
      菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(P/zotoZw"erz'wn;^ow/ orewM),制備發(fā)光菌新鮮菌懸液、1)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面h接出第一代斜面,25'C土0.5'C培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面,25°C±0. 5'C培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面,25°C±0. 5。C培養(yǎng)24h后備用。
      (2) 搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán),接種于裝有30ml細(xì)菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶屮,25°C±0. 5°C, 160r/min下培養(yǎng)24h備用。
      (3) 將培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌菌懸液稀釋至每毫升108個(gè)~109個(gè)細(xì)胞,初始發(fā)光度不低于800mV,備用。
      斜面和菌液的營(yíng)養(yǎng)基為
      胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
      酵母0.5g 甘油0.3g蒸餾水100ml固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g
      二、 水融合組分的制備
      在毒性試驗(yàn)中實(shí)際評(píng)定的是油類在水中溶解的成分和在水相中穩(wěn)定存在的小油珠部分,既水融合組分WAF。將配置好的人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液。人工海水的配方為-.NaCl 20g MgS04 3.6g MgCl 7.2 g
      無7jC CaCl2 0.7g 蒸餾水 1000ml
      將潤(rùn)滑油設(shè)置為10g/L、 8 g,/U 6 g/U 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7個(gè)載荷率梯度。
      丙為潤(rùn)滑油密度比水小,所以采用從容器底部攪拌試驗(yàn)材料的攪拌器,攪拌器的攪拌速 度應(yīng)該適當(dāng)、勻速,液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗(yàn)液高度的10y。-35y。。勻速攪拌, 速度不要太快,轉(zhuǎn)速為1200-1500卬m/min,防止乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生。攪拌時(shí)間為24h,隨攪拌時(shí) 間的延長(zhǎng),水中油的含量增加,但增加量逐漸平緩。攪拌后,為使混合液中非分散的油成分 與己分散和溶解組分分離,靜置4h。
      三、發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光度的測(cè)定
      測(cè)定時(shí)的室溫要控制在2(K25'c,同一批樣品在測(cè)定過程中要求溫度波動(dòng)不超過士rc。在
      試管架上按下列方式排列測(cè)試管左側(cè)放對(duì)照管,右側(cè)放樣品管(從低載荷率到高載荷率依 次排列),每管3個(gè)重復(fù),具體擺放位置見表l。
      表l.試管在試管架上的排列
      對(duì)照管樣品管
      空白l空白2空白3樣l樣l樣l樣2樣2樣2…樣n樣n樣n
      給每支作為對(duì)照管的試管加1.98ml的人工海水,給每支作為樣品管的試管加1.98ml的 潤(rùn)滑油WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細(xì)菌菌液0.02ml,放入發(fā)光光度計(jì) 中檢測(cè)。
      相對(duì)放光度
      對(duì)照管發(fā)光度(wr) 四、半數(shù)效應(yīng)載荷率EL5o的確定
      以相對(duì)發(fā)光度與載荷率之間的關(guān)系做出關(guān)系曲線并得到相關(guān)方程,根據(jù)方程求的 EL50=2901.96 mg/L。根據(jù)表2得知潤(rùn)滑油的毒性屬于低毒。
      權(quán)利要求
      1、一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法,其特征在于,該方法步驟如下一、發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)菌種采用明亮發(fā)光桿菌T3變種(Photobacterium phosphoreum),制備發(fā)光菌新鮮菌懸液(1)斜面菌種培養(yǎng)在新鮮斜面上接出第一代斜面,25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面,25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后再轉(zhuǎn)接第三代斜面,25℃±0.5℃培養(yǎng)24h后備用;(2)搖瓶菌液培養(yǎng)取第三代斜面菌種近一環(huán),接種于裝有30ml細(xì)菌培養(yǎng)液的100ml三角燒瓶中,25℃±0.5℃,160r/min下培養(yǎng)24h備用;(3)將培養(yǎng)后的發(fā)光細(xì)菌菌懸液稀釋至每毫升108個(gè)~109個(gè)細(xì)胞,初始發(fā)光度不低于800mV,備用;斜面和菌液的營(yíng)養(yǎng)基為胰蛋白胨0.5g NaCl 3g Na2HPO40.5g KH2PO40.5g酵母0.5g甘油0.3g 蒸餾水100ml 固體培養(yǎng)基加瓊脂1.69g二、水融合組分的制備配置人工海水作為WAF中的水溶液和稀釋水溶液,人工海水的配方為NaCl 20gMgSO4 3.6gMgCl 7.2g無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml將潤(rùn)滑油設(shè)置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L 7個(gè)載荷率梯度;制備WAF溶液,如果試驗(yàn)材料比水密度小,應(yīng)采用從容器底部攪拌試驗(yàn)材料的攪拌器,而對(duì)于那些密度比水大的試驗(yàn)材料,則應(yīng)采用從容器頂部攪拌試驗(yàn)溶液的攪拌器,攪拌器的攪拌速度應(yīng)該適當(dāng)、勻速,為1200-1500rpm/min,一般液面漩渦的深度為WAF溶液制備容器中試驗(yàn)液高度的10%-35%,攪拌時(shí)間為24h,攪拌后,靜置4h;三、發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光度的測(cè)定測(cè)定時(shí)的室溫要控制在20~25℃,同一批樣品在測(cè)定過程中要求溫度波動(dòng)不超過±1℃。取若干試管,給每支作為對(duì)照管的試管加1.98ml的人工海水,給每支作為樣品管的試管加1.98ml的WAF溶液。向每管中加入步驟一制備的備用的發(fā)光細(xì)菌菌液0.02ml,放入發(fā)光光度計(jì)中檢測(cè);四、半數(shù)效應(yīng)載荷率EL50的確定(1)繪制試驗(yàn)材料載荷率(mg/L)與其相對(duì)發(fā)光度(%)的相關(guān)曲線或相關(guān)方程;(2)在相關(guān)曲線坐標(biāo)圖上,相對(duì)發(fā)光度50%處畫一水平線,與相關(guān)曲線有一交點(diǎn),該點(diǎn)的載荷率即是半數(shù)效果載荷EL50值,如建立了相關(guān)方程,也可代入該方程求出樣品的EL50值;(3)根據(jù)的EL50值鑒別不同油品的生物毒性。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種海洋溢油生物毒性快速檢測(cè)方法,該方法通過發(fā)光細(xì)菌作為檢驗(yàn)海洋溢油生物毒性的受試生物,同時(shí)利用人工海水配制水融合組分(WAF,water accommodation friction),解決了以往發(fā)光細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中由于應(yīng)用純水作為配制水融合組分的溶劑,從而降低了海洋發(fā)光細(xì)菌的鹽度,改變了發(fā)光細(xì)菌的生活條件而給實(shí)驗(yàn)帶來的誤差。
      文檔編號(hào)C12N1/20GK101551336SQ20091001042
      公開日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
      發(fā)明者劉長(zhǎng)安, 張世宇 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心
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