專利名稱：補料發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及補料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，更具體地說，是涉及一種吸 水鏈霉菌的補料發(fā)酵方法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
背景技術(shù)：
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，Microbial Trans-glutaminase, EC 2.3.2. 13，簡稱MTG)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它能催 化化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨 酰胺基的水解反應(yīng)，從而直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細胞、組織等的結(jié)構(gòu)與 功能性質(zhì)的特性，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。因此，MTG在食品、紡織、生物制藥等領(lǐng)域有著廣 泛的應(yīng)用前景。近年來，商業(yè)化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶主要從動物組織中提取，價格昂貴。目前， 人們開始轉(zhuǎn)向于研究利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，以滿足市場對低成本高產(chǎn)量 的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種補料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法；該生 產(chǎn)方法通過分別在細胞生長階段補充碳源和產(chǎn)酶階段補充氮源的補料策略實現(xiàn)了吸水鏈 霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高產(chǎn)。為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明如下技術(shù)方案，本發(fā)明的生產(chǎn)工藝是在吸水鏈 霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)分批發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，通過在菌體生長階段指數(shù)流 加葡萄糖，進行高細胞密度培養(yǎng)，獲得了較高的菌體量；待菌體生長進入產(chǎn)酶期后，通過補 加氮源，為產(chǎn)酶提供充足的氮源，其中通過流加蛋白質(zhì)氮源，可以減少蛋白酶對成熟MTG的 分解，促進產(chǎn)酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的生產(chǎn)工藝通過分別在細胞生長階段補充碳源和產(chǎn)酶階段補充氮源的補 料策略實現(xiàn)了吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高產(chǎn)。通過指數(shù)流加可以實現(xiàn)吸水 鏈霉菌細胞的高密度生長，通過在8-16h采用較高的的比生長速率(0. 15h-l)，后期降低比 生長速率(0. IOh-I)這種較優(yōu)的葡萄糖流加速率組合，細胞干重可達到36g/L，在32h添加 50g/L的豆餅粉最終酶活可達到5. 79U/mL。指數(shù)流加的技術(shù)已經(jīng)相對成熟，也便于實際操 作，另外豆餅粉價格較低，在實際發(fā)酵過程中也易于操作，因此對吸水鏈霉菌進行補料發(fā)酵 生產(chǎn)有很好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式菌種吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)可從市場購置。試劑口服葡萄糖為山東祥瑞藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。α-N-Carbobenzyloxy-Glutamine-Glycine(a-N-CBZ-GLN-GLY)和 L-谷氨酸-Y-單羥胺酸(HCA)由Sigma公司提供，三羥基氨基甲烷(Tris)由上?；瘜W(xué)試劑廠提 供，谷胱甘肽(還原型)由華美生物工程公司提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨25，酵母膏5，無水硫酸 鎂2，磷酸氫二鉀3. 75，無水磷酸二氫鉀0.25，碳酸鈣5，pH 8.0。流加發(fā)酵3L全自動發(fā)酵 罐(LiFlus GM BioTRON, Korea)中裝液量為1. 5L，接種量6%，前期培養(yǎng)條件同分批發(fā)酵。 待葡萄糖消耗完畢向發(fā)酵罐中按要求流加營養(yǎng)物，通氣量1.25vvm，攪拌轉(zhuǎn)速700r/min，溫 度控制在32°C，對發(fā)酵過程的pH不進行控制。指數(shù)流加底物流加速率F按下式計算F= {μ (VX) 0/[YX/S (SF-S) ]}exp( μ t)，式中X，S分別為發(fā)酵罐中細胞和底物濃 度(g/L)，μ為比生長速率(h-Ι)，V為發(fā)酵液體積(L)，SF為流加底物的濃度(g/L)，YX/S 為細胞對底物的得率系數(shù)(g/g)，(VX)O為培養(yǎng)體系的初始細胞量(g)。
權(quán)利要求
補料發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其特征在于所采用的生產(chǎn)工藝為在吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，通過在菌體生長階段指數(shù)流加葡萄糖，進行高細胞密度培養(yǎng)，獲得了較高的菌體量；待菌體生長進入產(chǎn)酶期后，通過補加氮源，為產(chǎn)酶提供充足的氮源，其中通過流加蛋白質(zhì)氮源，可以減少蛋白酶對成熟MTG的分解，促進產(chǎn)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補料發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其特征在于培養(yǎng)基和培養(yǎng) 方法發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨25，酵母膏5，無水硫酸鎂2，磷酸氫二鉀3. 75， 無水磷酸二氫鉀0.25，碳酸鈣5，pH 8. O。流加發(fā)酵3L全自動發(fā)酵罐(LiFlus GM BioTRON, Korea)中裝液量為1. 5L，接種量6%，前期培養(yǎng)條件同分批發(fā)酵。待葡萄糖消耗完畢向發(fā)酵 罐中按要求流加營養(yǎng)物，通氣量1. 25vvm,攪拌轉(zhuǎn)速700r/min，溫度控制在32°C，對發(fā)酵過 程的PH不進行控制。
全文摘要
補料發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是涉及補料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，更具體地說，是涉及一種吸水鏈霉菌的補料發(fā)酵方法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。本發(fā)明提供一種補料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法；該生產(chǎn)方法通過分別在細胞生長階段補充碳源和產(chǎn)酶階段補充氮源的補料策略實現(xiàn)了吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高產(chǎn)。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝是在吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，通過在菌體生長階段指數(shù)流加葡萄糖，進行高細胞密度培養(yǎng)，獲得了較高的菌體量；待菌體生長進入產(chǎn)酶期后，通過補加氮源，為產(chǎn)酶提供充足的氮源，其中通過流加蛋白質(zhì)氮源，可以減少蛋白酶對成熟MTG的分解，促進產(chǎn)酶。
文檔編號C12N9/10GK101993859SQ20091001307
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者褚思衡 申請人:褚思衡