專利名稱：：牙鲆彈狀病毒的全基因組序列及其測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，另外還涉及該序列的測定方法。
背景技術(shù)：
：牙鲆彈狀病毒(Hiramerhabdovirus,簡稱HRV)病毒粒子呈槍彈形，大小為80nmX160-180nm，1986年日本首次報道。我國黃海、渤海近岸等地養(yǎng)殖的牙鲆已被發(fā)現(xiàn)有此病癥。發(fā)病季節(jié)為冬季和早春，魚體發(fā)病時，水溫一般都在15i:以下。本病主要危害牙鲆，人工感染對真鯛、黑鯛有強(qiáng)烈的致病性，從香魚和無備平舳中也分離到此病毒，對虹鱒也有致病作用。幼苗期和仔魚期的魚體易患此病。感染牙鲆彈狀病毒的病魚體表和鰭充血或出血，腹部膨脹，內(nèi)有腹水。解剖魚體，肌肉、腸黏膜的固有層出血，生殖腺的結(jié)締組織充血或出血。中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局與韓國海洋水產(chǎn)部于2005年發(fā)布的《中韓進(jìn)出口活水生動物檢驗檢疫協(xié)議》中規(guī)定，我國出口到韓國的鱸魚、真鯛、大菱鲆、牙鲆等魚類必須進(jìn)行牙鲆彈狀病毒的檢驗檢疫。因此，急需對國內(nèi)所分離出來的牙鲆彈狀病毒的基因組序列進(jìn)行測定和分析，在此基礎(chǔ)上，建立牙鲆彈狀病毒的快速檢測方法和分子流行病學(xué)分析，保護(hù)我國進(jìn)出口海水魚類貿(mào)易和我國海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述問題，提供了一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，對牙鲆彈狀病毒的全基因組進(jìn)行了分段擴(kuò)增、克隆、序列測定及分析，構(gòu)建了基因組cDNA文庫，測定了11037bp的核苷酸序列。另外本發(fā)明還提供其測定方法，涉及對基因組中各開放讀碼框的分析，方法簡單，測定精確。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全長包括11037個核苷酸。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白核蛋白基因(N)，0RF1位于第170—1348核苷酸，編碼核蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含392個氨基酸，分子量為42.4kDa。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白磷蛋白(P)，0RF2位于第1448—2131核苷酸，編碼磷蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的磷蛋白包含227個氨基酸，分子量為25.8kDa。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白基質(zhì)蛋白(M)，0RF3位于第2237—2818個核苷酸，編碼基質(zhì)蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的基質(zhì)蛋白包含193個氨基酸，分子量為21.5kDa。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白糖蛋白(G)，0RF4位于第2927—4453個核苷酸，編碼糖蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的糖蛋白包含508個氨基酸，分子量為56.6kDa。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白RNA聚合酶(L)蛋白，0RF5位于第4950—10910個核苷酸，是最大的開放讀碼框，編碼RNA聚合酶蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含1986個氨基酸，分子量為224.6kDa。所述牙鲆彈狀病毒的全基因組序列擴(kuò)增引物序列如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示，共10個引物對。所述一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列的測序方法，具體工藝是1)病毒分離與PNA的提??；2)合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，對病毒的全基因組序列分段為10段；3)對病毒基因組的分段進(jìn)行RT—PCR擴(kuò)增；4)目的基因片段的回收；5)目的基因序列測定、拼接；6)目的基因組序列驗證。所述病毒的分離用HRV病毒懸液感染24h內(nèi)培養(yǎng)的鯉魚上皮瘤細(xì)胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，20。C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)90%時，收集500mL細(xì)胞和培養(yǎng)液，4°C3，000Yrr畝"、、m，.n甘T7卜、)害fCM1、/1°廣/JB方、)V、)^RFImTSN1重'、t3畫-""y-i"t"i丄ii-yy,.1H3\"丄，丄/7丄ul/|、IJ7l乂畫J厶UlLvJ丄、丄半.懸，快速反復(fù)凍溶3次，超聲波降解，重懸沉淀細(xì)胞，4°C4，000Xg離心20min，收集上清(SN2)，與SNl混合，4。C過夜，4°C15，000Xg離心8h，2mLTN緩沖液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)重懸，上清液裝入15_60%(重量/體積)的蔗糖梯度離心管，4°C200,000Xg離心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用針刺破離心管，收集病毒相，用TN緩沖液稀釋，200，OOOxg離心lh，用200WTN緩沖液重懸后-20°C保存。所述病毒RNA的提取上述分離后的病毒用RNA提取試劑盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒總RNA。所述合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，對病毒的全基因組序列分段為10段；引物序列見表1,其中F代表正向引物，R代表反向引物，1-IO分別代表IO對引物的編號，每對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在1000bp左右。表l:用于HRV基因組測序的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述病毒基因組的分段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以病毒RNA為模版進(jìn)行RT-PCR分析，RT-PCR實驗采用試劑盒SuperscriptIIIFirst-StmndSynthesisSystemkit(invitrogen)來完成。反應(yīng)體系為5u110XRT—PCRBuffer,10u125mMMgC12，5u110mMd,，1li1RnaseInhibitor(40U/u1)，1u1AMV-OptimizedTaq，1P1AMVRtaseXL(5U/ul),lyl正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反應(yīng)條件為50。C預(yù)變性15min;之后94°C2min;最后35個循環(huán)為94。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min。所述目的基因的回收如下述a-e，a)目的DNA的純化用WizardDNA純化試劑盒(Promega公司)從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中純化目的DNA，具體按照試劑盒操作說明進(jìn)行；b)目的DNA與載體的連接將10條純化后的PCR產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pmdl8-T中，具體操作是在O.2mlPCR管中加入鏈接緩沖液7.5ul，載體lul，PCR純化產(chǎn)物2.5ul，T4DNA連接酶(3U/ul)lul，然后用滅菌雙蒸水將體系定容到15yl，將反應(yīng)液混勻，4'C連接過夜；c)轉(zhuǎn)化將5pl連接產(chǎn)物加入到200ul感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，冰浴30分鐘，42。C熱擊90秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上3分鐘；加入37"C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基800u1，37"C震蕩培養(yǎng)45分鐘，4000rpm離心2分鐘，棄部分上清，約留200ul，混勻；均勻涂布在加有16ulX-gal(50mg/ul)和4ulIPTG(200mg/pl)LB板上，倒放平皿，37。C過夜；d)陽性克隆菌的鑒定在涂布有X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色單個菌落，接種于含有AMP(氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，37"C震蕩培養(yǎng)12小時后，提取質(zhì)粒；e)質(zhì)粒的制備用堿裂解法提取質(zhì)粒。用50P1水溶解質(zhì)粒DNA，保存在-2(TC。所述病毒全基因組序列測定、拼接如下述a-c，a)序列測定采用ABIPRISM3770型核酸序列測定儀進(jìn)行測序，具體操作按照儀器說明書進(jìn)行；b)序列拼接利用軟件VectorNtisoftware(InforMaxInc.,USA)將測序結(jié)果拼接成完整的病毒基因組序列，基因組長度為11037bp(序列表SEQIDNO.1)，與HIRRV韓國株(GenBankAcc.No.NC_005093)相似，病毒核酸為單鏈RNA，GC含量50.8%;所述基因組序列驗證序列分析基因組在DNAStar軟件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.,MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf(ORFfinder)運行分析，驗證所有的開放讀碼框(Openreadingframes,ORFs)，所有的開放閱讀框都由ATG開始，至少編碼40個氨基酸才成為一個假定基因；序列驗證分別根據(jù)每個ORF的序列設(shè)計了引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于L基因太長，因此設(shè)計4對引物，將其分成4段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與所預(yù)測的ORF序列進(jìn)行比較，驗證HRV的五個開放閱讀框的存在和序列。本發(fā)明采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列測定技術(shù)，對牙鲆彈狀病毒進(jìn)行了分段擴(kuò)增、克隆、序列測定及分析。牙鲆彈狀病毒基因組由11037個核苷酸組成，包括5個開放讀碼框(ORF)，病毒核酸為單鏈RNA，GC含量50.896，其中的部分核苷酸序列可以用于牙鲆彈狀病毒的分子學(xué)診斷和相關(guān)核酸疫苗的開發(fā)。該基因組為中國首次在石鰈魚中分離出的牙鲆彈狀病毒的基因組序列進(jìn)行測定，對進(jìn)一步研究該病毒的致病機(jī)理和檢測方法有著重要的意義。圖1是牙鲆彈狀病毒基因組ORF序列驗證的電泳檢測圖。圖中l(wèi)-3:核蛋白基因(N);4-6:磷蛋白基因(P);7-9:基質(zhì)蛋白基因(M);10-12:糖蛋白基因(G);13:DL2000Marker(2000，1000，750，500，250bp);14-16:RNA酶基因第一個片段(L1);17-19:RNA酶基因第二個片段(L2);20-22:RNA酶基因第三個片段(L3);23-25:RNA酶基因第四個片段(L4)。具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述實施例1.一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全長包括11037個核苷酸。實施例2實施例l所述一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列的測序方法，具體過程如下-1、病毒分離提純和RNA提取用HRV病毒懸液感染24h內(nèi)培養(yǎng)的鯉魚上皮瘤細(xì)胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，20。C培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)90%時，收集500mL細(xì)胞和培養(yǎng)液，4°C3,000Xg離心30min，取上清(SN1)，4°C保存。沉淀用2mLSN1重懸，快速反復(fù)凍溶3次，超聲波降解，重懸沉淀細(xì)胞，4°C4，000Xg離心20min。收集上清(SN2)，與SN1混合，4°C過夜，4°C15，000Xg離心8h，2mLTN緩沖液(50mMTris-HC1，150mMNaCl,pH7.5)重懸，上清液裝入15—60%(重量/體積)的蔗糖梯度離心管，4。C200,000Xg離心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用針剌破離心管，收集病毒相，用TN緩沖液稀釋。200，000xg離心lh，用200WTN緩沖液重懸后-20。C保存。然后用RNA提取試劑盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒總RNA。2、合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，對病毒的全基因組序列分段為10段根據(jù)HRV韓國株基因組序列設(shè)計10對引物，其序列見表1，其中F代表正向引物，R代表反向引物，1-IO分別代表IO對引物的編號。每對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在1000bp左右。表l:用于HRV基因組測序的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>HRV-2-RACGTTCAAGGCGGTCCGGTASEQIDNo.5服V-3-FATCCGGTCCAACCTCAACGAGAACTSEQIDNo.6,-3-RACCTTGGATAGCTTAGCCGCAGGACSEQIDNo.7HRV-4-FTCCTCACGACAGCTGCCAGAGTCTASEQIDNo.8麗-4-RCAGTGCTGACAATGATGGCCAGAAGSEQIDNo.9HRV-5-FCGGTCTTCATGGCAACGATACTCCTSEQIDNo.10服V-5-RCTCTGGAGGAGGATTGTCCGGAGTTSEQIDNo.11,-6-FCGAGACAGCAACGGATCCACTACATSEQIDNo.12服V-6-RGCGATCAGTCTGTCTCCTTCGTTGTSEQIDNo.13HRV-7-FGCAGCATGGATCGAAGAAGGTCACTSEQIDNo.14HRV-7-RCACGCTTCTCTAGGTCGATCGGAGTSEQIDNo.15麗-8-FCGGCAATCATCTCCAGTGAACAATASEQIDNo.16HRV-8-RGCATGATTAGTTCGTCAAGATTGCTSEQIDNo.17HRV-9-FAAGACAGGAAGCAATCTTGACGAACSEQIDNo.18HRV-9-RCCTCCMTCACGACCAATAGGTCAGSEQIDNo.19HRV-10-FGAGTGGCAGAGGCACTGAACATGACSEQIDNo.20麗-10-RGTATAAAAAAGGTAACAGAGAGGTTCTGAAGSEQIDNo.213、病毒基因組的分段RT-PCR擴(kuò)增以病毒RNA為模版進(jìn)行RT-PCR分析，RT-PCR實驗采用試劑盒SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemkit(invitrogen)來完成。反應(yīng)體系為5u110XRT-PCRBuffer(緩沖齊U)，10"125mMMgC12，5u110mMd證，1u1RNaseInhibitor(核糖核酸酶抑制劑，40U/ul)，lulAMV-OptimizedTaq(優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄聚合酶)，lulAMVRTaseXL(逆轉(zhuǎn)錄酶儀，5U/ul)，lul正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反應(yīng)條件為50。C預(yù)變性15min;之后94°C2min;最后35個循環(huán)為94。C變性30s，58°C退火30s，72。C延伸2min。4、目的基因的回收包括目的DNA的克隆與陽性克隆菌的鑒定，(1)目的DNA的純化用WizardDNA純化試劑盒(Promega公司)從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中純化目的DNA，具體按照試劑盒操作說明進(jìn)行。(2)目的DNA與載體的連接將10條純化后的PCR產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pmdl8-T中，具體操作是在0.2mlPCR管中加入鏈接緩沖液7.5yl，載體lul，PCR純化產(chǎn)物2.5ul，T4DNA連接酶(3U/ul)lul，然后用滅菌雙蒸水將體系定容到15ul，將反應(yīng)液混勻，4"C連接過夜。(3)轉(zhuǎn)化將5u1連接產(chǎn)物加入到200u1感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，冰浴30分鐘，42'C熱擊90秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上3分鐘；加入37。C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基800y1，37。C震蕩培養(yǎng)45分鐘，4000rpm離心2分鐘，棄部分上清，約留200ul，混勻；均勻涂布在加有16ulX-gal(50mg/ul)和4ulIPTG(200mg/ul)LB板上，倒放平皿，37'C過夜。(4)陽性克隆菌的鑒定在涂布有X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色單個菌落，接種于含有AMP(氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，37'C震蕩培養(yǎng)12小時后，提取質(zhì)粒。(5)質(zhì)粒的制備用堿裂解法提取質(zhì)粒。將細(xì)菌培養(yǎng)液倒入離心管中，12000g離心30秒。重復(fù)一次。用1mLSTE懸浮菌體沉淀，再離心回收菌體，重復(fù)一次，去盡上清液。將沉淀懸浮于100ul預(yù)冷的溶液I，強(qiáng)烈振蕩混勻；加入200ul預(yù)冷的溶液II，顛倒5次(不要強(qiáng)烈振蕩)，冰浴放置3分鐘。加入150u1預(yù)冷的溶液III，倒置管溫和振蕩10秒，冰浴放置3—5分鐘。離心5分鐘，上清液加入等體積的酚/氯仿，振蕩混勻。離心2分鐘，上清液加入2倍體積的乙醇(以及1/10體積的3MNaAc)，室溫放置2-10分鐘。離心5分鐘，將沉淀用70%的乙醇漂洗，稍微離心，室溫放置片刻以干燥沉淀。用50ul水溶解沉淀，保存在-2CTC。5、病毒基因組序列測定、序列拼接(1)序列測定采用ABIPRISM3770型核酸序列測定儀進(jìn)行測序，具體操作按照儀器說明書進(jìn)行。(2)序列拼接利用軟件VectorNtisoftware(InforMaxInc.，USA)將測序結(jié)果拼接成完整的病毒基因組序列，基因組長度為11037bp(序列表SEQIDNO.1)，與HIRRV韓國株(GenBankAcc.No.NC—005093)相似。病毒核酸為單鏈RNA，GC含量50.8%。6、基因組序列分析及驗證序歹U分析基因組在DNAStar軟件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.，MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf(ORFfinder)運行分析，驗證所有的開放讀碼框(Openreadingframes,ORFs)。所有的開放閱讀框都由ATG開始，至少編碼40個氨基酸才成為一個假定基因。經(jīng)過分析，病毒包含如下5個基因1)核蛋白基因(N)0RF1位于第170—1348核苷酸，編碼核蛋白。從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含392個氨基酸，分子量為42.4kDa。2)磷蛋白(P)0RF2位于第1448—2131核苷酸，編碼磷蛋白。從起始密碼子到終止密碼子共編碼的磷蛋白包含227個氨基酸，分子量為25.8kDa。3)基質(zhì)蛋白(M)0RF3位于第2237—2818個核苷酸，編碼基質(zhì)蛋白。從起始密碼子到終止密碼子共編碼的基質(zhì)蛋白包含193個氨基酸，分子量為21.5kDa。4)糖蛋白(G)0RF4位于第2927—4453個核苷酸，編碼糖蛋白。從起始密碼子到終止密碼子共編碼的糖蛋白包含508個氨基酸，分子量為56.6kDa。5)RNA聚合酶(L)蛋白0RF5位于第4950—10910個核苷酸，是最大的開放讀碼框，編16碼RNA聚合酶蛋白。從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含1986個氨基酸，分子量為224.6kDa。為了驗證開放讀碼框分析結(jié)果的正確性，分別根據(jù)每個0RF的序列設(shè)計了引物(表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于L基因太長，因此設(shè)計4對引物，將其分成4段擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，并與所預(yù)測的ORF序列進(jìn)行比較。驗證所做的RT—PCR的結(jié)果見圖1，所有擴(kuò)增的片段(箭頭所指)長度和序列與預(yù)期相符，驗證了HRV的五個開放閱讀框的存在和該毒株測序的成功。表2:HRV0RF序列驗證的RT-PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>孫穎杰、劉葒、岳志芹、吳斌、李葉〈120〉牙鲆彈狀病毒的全基因組序列及其測定方法〈160>37<170〉Patentlnversion3.5〈210>1<211>11037<212>靈<213〉Hir咖erhabdovirus<400>1tacgccaagatgggggc鄉(xiāng)ggacag犯aa60犯3tggC8LCttcagttgtac3Ctg6lt犯Cgtgtt3tagacMgtcta3gt120gatatattctgtttgcgatctctacaacaagaaatcaatatggcgaacct180tttgC3gg3CtCCg鄉(xiāng)3gtgccctcgaag8ctctggcac240gga_gtaitg^tCCC3CC犯g8tcaacttgacgctctacgggtctataccct300ggcgatcatc8卿gggCgLgtcagtcsggtcgg娜gtcccaaaccaaca犯gC3Ct8gg360gatcctttgtgcttttgtcacgtcagsgaBcaaccctgacatgacagatgcagcagtcaa420gctcctggtgg3C3tg犯gttcaaggtggacgtggttcccgtgg3Cg3C3鄉(xiāng)tcggtga480caatctggatgacccc犯ctcaaagctggcggaggtcctgacgg^gag88C3tggtgg3540cctggtgs犯ggccttctgttcacttgtgccctgatggtc犯gt3Cg3tgtggac犯gat600ggccacatactgccagcagaagctggagcgactggccaacagtcagggactc犯cgagct660gaccctgata8gcacg3gtagggC3gttCtggctcggattggggcagcggta卿ccggg720gC3g犯gtt8tctatgggatcattcttatcaacctgstggatcccgccac780tgctgccagggc犯8ggccctttgtgccatg鄉(xiāng)Ctg3gCggaaccggaatgaccatggt840gggtxtattc￡L3tC￡lggCCl:ctaag犯ccttggagctcceicctgcageitctgctgga卿900tctctgcatgaagtccatcatcgactctgcc鄉(xiāng)agg3ttgtc犯gctgatg鄉(xiāng)8tCgt960tgcagacgtcgaggacatgaccgcaaagtatgccatcatgtgcttgggga1020tgggtacttcaagtcctacggg￡Ltcaatga>gaactcacggatcacctgtatcttgatgaa1080C￡LtC3￡LCga<gcagtacgatg鄉(xiāng)ggac犯cCgg鄉(xiāng)3Ctggcaggagtcagggtttcacc1140ccccttccgaaagctggcaaccgagattgctcgccttctgatgacggg犯1200cggatctgccgggccaggtgcctcagatcttgttcgccaggccgagcaggC3gcgcasg31260g謡g3gggCgaggatgatagg3gggCg3gg3g犯Cgg3g1320gggggg卿ggeicg卿3gtactactgagacccggcatctatgtcgccttgggttgcctc1380tattcttag3tggcacgtttgtgt犯asct1440aatcgcaatgtctgataacggttctttgatattcccaagaatgctctgga1500c卿gttgaggC3Cggetcgatgtgtcccag卿gga^tgggi犯ggttgtccggasac肌gc1560g￡lgg￡L3CC￡L￡lgactggsggc卿gC卿3gcggtctccaaag肌gcagg31620ga^accccggaacatgtcccacttgttctg鄉(xiāng)tatgtggaBg3ggac昭1680caccc犯gatgcgctccgag郎ttcgg鄉(xiāng)3Ct犯ttgtCC3g3tC3ggCagtctceitca1740ggccgaratgactcgtcatctgg鄉(xiāng)C3gtggc肌c卿gcaccgggccaatctccaggc1800gctcaccaagtctC8gC3ggagtctc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gtgctgacsatg3tggccagaag25<210>9<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind〈222〉(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第四對引物中的反向引物<400>9cagtgctgac肌tgatggcc3gsag25<210>10<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220>〈221〉prim—bind<222>(1)…(25)〈223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第五對引物中的正向引物〈400>10cggtcttcatggcaacgatactcct25<210>11<211>25〈212〉畫〈213>ArtificialSequence〈220〉<221>prim—bind〈222〉(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第五對引物中的反向引物〈400〉11ctctggaggaggattgtccggagtt25〈210〉12<211>25<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221>prim一bind<222>(l)...(25)223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第六對引物中的正向引物〈400>12cgagacagcaacggatccactacat25<210>13<211>25<212>■〈213〉A(chǔ)rtificialSequence<220〉<221>prim—bind<222>(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第六對引物中的反向引物<400>13gcgatcagtctgtctccttcgttgt25<210>14<211>25<212>腿<213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind〈222>(l)...(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第七對引物中的正向引物<400>14gcagcstggatcg3ag朋ggtceict25<210>15<211>25<212>廳<213>ArtificialSequence<220><221〉prim_bind<222>(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第七對引物中的反向引物〈400〉15cacgcttctctaggtcgatcggagt25<210>16<211>25<212>DNA〈213>ArtificialSequence〈220><221〉prim—bind<222>(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第八對引物中的正向引物<400>16cggcaatcatctccagtgaacaata25<210〉17<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind〈222>(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第八對引物中的反向引物<400〉17gcatgattagttcgtcaagattgct25<210>18<211>25〈212〉DNA<213>ArtificialSequence〈220〉<221>prim—bind<222>(l)...(25)〈223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第九對引物中的正向引物<400>18aagacaggasgc肌tcttgscgasc25<210>19<211>25<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence<220><221〉prim—bind〈222>(1)…(25)〈223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第九對引物中的反向引物<400>19cctccaatcacgaccaataggtcag25<210>20〈211〉25<212〉DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222〉(1)…(25)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第十對引物中的正向引物〈400>20gagtggcagaggcactgaacatgac25<210>21〈211〉31<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222>(l)...(31)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于測定牙鲆彈狀病毒序列的第十對引物中的反向引物<400〉21gtat33a犯3ggtaacagagaggttctg肪g31〈210〉22〈211〉19<212>■<213〉A(chǔ)rtificialSequence<220>〈221>prim—bind〈222〉(1)…(19)<223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒N基因序列的正向引物<400>22<210>23<211〉19<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialSequence<220><221>prim一bind<222>(1)…(19)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒N基因序列的反向引物<400>23tcagtagtactcttcgtcc19<210>24〈211〉21<212>謹(jǐn)<213>ArtificialSequence〈220〉<221>prim—bind〈222〉(l)...(21)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒P基因序列的正向引物〈400〉24ggatgtctgstascgaaggag21<210>25<211>19<212>薩〈213>ArtificialSequence<220〉<221〉prim—bind〈222〉(l)...(19)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒P基因序列的反向引物〈400〉25ctacctcatggtcttcttg19〈210>26<211>20〈212〉DNA<213>ArtificialSequence<220〉<221>prim—bind<222>(1)…(20)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒M基因序列的正向引物〈400>26atgtctctcttcaagcgaac20<210>27〈211〉20<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim一bind〈222〉(1)…(20)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鄉(xiāng)彈狀病毒M基因序列的反向引物<400>27ctatttcccctttttggttg20<210〉28<211〉20<212>腿<213>ArtificialSequence〈220><221>prim—bind〈222〉(1)…咖〈223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙軤彈狀病毒G基因序列的正向引物〈400〉28ggatggatcctcgaataatg20<210>29〈211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220>〈221〉prim—bind〈222>(1)…(19)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒G基因序列的反向引物<400>29atattaccctcgactggcg19〈210〉30<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence〈220><221>prim—bind<222>(l)...(24)〈223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第一對引物中的正向引物<400>30gcgcgatggatttctttgatttag24<210>31<211〉24〈212〉DNA<213>ArtificialSequence〈220>〈221>prim—bind<222>(l)...(24)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第一對引物中的反向引物〈400〉31gcgcgctatttttaactccatctc24<210>32〈211>17<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind<222>(1)…(17)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第二對引物中的正向引物<400>32tta鄉(xiāng)gacggggattc17<210〉33<211>17<212〉腿<213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222>(l)...(17)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第二對引物中的反向引物〈400〉33attaggtctgcgtccag17<210>34<211>20〈212〉DNA<213>ArtificialSequence<220>〈221>prim一bind<222〉(1)…(20)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第三對引物中的正向引物〈400>34atgccggggcagagacaatc20<210>35<211>21〈212〉薩〈213>ArtificialSequence<220>〈221〉prim—bind〈222>(21)<223>根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第三對引物中的反向引物<400>35atctggactggcatcagagcg21<210〉36〈211〉18〈212〉腿<213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind〈222〉(1)…(18)<223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙軤彈狀病毒L基因序列的第四對引物中的正向引物<400>36atgcaatcgacgagaccg18<210〉37〈211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>prim一bind<222>(l)...(18)<223〉根據(jù)測序要求設(shè)計，用于驗證牙鲆彈狀病毒L基因序列的第四對引物中的反向引物<400>37tctactgcctgccaagag18權(quán)利要求1、一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全長包括11037個核苷酸。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白核蛋白基因(N)，0RF1位于第170_1348核苷酸，編碼核蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含392個氨基酸，分子量為42.4kDa。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白磷蛋白(P)，0RF2位于第1448—2131核苷酸，編碼磷蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的磷蛋白包含227個氨基酸，分子量為25.8kDa。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是:牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白基質(zhì)蛋白(M)，0RF3位于第2237—2818個核苷酸，編碼基質(zhì)蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的基質(zhì)蛋白包含193個氨基酸，分子量為21.5kDa。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白糖蛋白(G)，0RF4位于第2927—4453個核苷酸，編碼糖蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的糖蛋白包含508個氨基酸，分子量為56.6kDa。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是牙鲆彈狀病毒的全基因組序列表編碼蛋白RNA聚合酶(L)蛋白，0RF5位于第4950—10910個核苷酸，是最大的開放讀碼框，編碼RNA聚合酶蛋白，從起始密碼子到終止密碼子共編碼的核蛋白包含1986個氨基酸，分子量為224.6kDa。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，其特征是:牙鲆彈狀病毒的全基因組序列擴(kuò)增引物序列如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示，共10個引物對。8、一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列的測序方法，其特征是具體工藝是1)病毒分離與PNA的提?。?)合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，對病毒的全基因組序列分段為10段；3)對病毒基因組的分段進(jìn)行RT—PCR擴(kuò)增；4)目的基因片段的回收；5)目的基因序列測定、拼接；6)目的基因組序列驗證。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列的測序方法，其特征是病毒的分離用HRV病毒懸液感染24h內(nèi)培養(yǎng)的鯉魚上皮瘤細(xì)胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，2(TC培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)90%時，收集500mL細(xì)胞和培養(yǎng)液，4°C3，000Xg離心30min，取上清(SNl)，4°C保存，沉淀用2mLSN1重懸，快速反復(fù)凍溶3次，超聲波降解，重懸沉淀細(xì)胞，4°C4，000Xg離心20min，收集上清(SN2)，與SN1混合，4°C過夜，4°C15，000Xg離心8h，2mLTN緩沖液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)重懸，上清液裝入15—60%(重量/體積)的蔗糖梯度離心管，4。C200，000Xg離心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用針刺破離心管，收集病毒相，用TN緩沖液稀釋，2Q0，000xg離心lh，用200WTN緩沖液重懸后-20°C保存。所述病毒RNA的提取上述分離后的病毒用RNA提取試劑盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒總RNA。所述合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，對病毒的全基因組序列分段為10段；引物序列見表1，其中F代表正向引物，R代表反向引物，l-10分別代表10對引物的編號，每對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在lOOObp左右。所述病毒基因組的分段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以病毒RNA為模版進(jìn)行RT-PCR分析，RT-PCR實驗采用試劑盒SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemkit(invitrogerO來完成。反應(yīng)體系為5u110XRT-PCRBuffer,10u125mMMgC12,5ull0mMdNTP,1u1RnaseInhibitor(40U/u1)，1u1AMV-OptimizedTaq，lul腦VRtaseXL(5U/ul)，lul正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反應(yīng)條件為5(TC預(yù)變性15min;之后94°C2min;最后35個循環(huán)為94。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min。所述目的基因的回收如下述a-e，a)目的DNA的純化用WizardDNA純化試劑盒(Promega公司)從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中純化目的DNA，具體按照試劑盒操作說明進(jìn)行；b)目的DNA與載體的連接將10條純化后的PCR產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pmdl8-T中，具體操作是在0.2mlPCR管中加入鏈接緩沖液7.5u1，載體1P1，PCR純化產(chǎn)物2.5u1，T4DNA連接酶(3U/yl)1p1，然后用滅菌雙蒸水將體系定容到15p1，將反應(yīng)液混勻，4'C連接過夜；c)轉(zhuǎn)化將5ul連接產(chǎn)物加入到200ul感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，冰浴30分鐘，42"C熱擊90秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上3分鐘；加入37'C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基800U1，37"C震蕩培養(yǎng)45分鐘，4000rpm離心2分鐘，棄部分上清，約留200ii1，混勻；均勻涂布在加有16p1X-gal(50mg/pl)和4ulIPTG(200mg/ul)LB板上，倒放平皿，37。C過夜；d)陽性克隆菌的鑒定在涂布有X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色單個菌落，接種于含有AMP(氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，37'C震蕩培養(yǎng)12小時后，提取質(zhì)粒；e)質(zhì)粒的制備:用堿裂解法提取質(zhì)粒。用50ul水溶解質(zhì)粒DNA，保存在-2(TC。所述病毒全基因組序列測定、拼接如下述a-c，a)序列測定采用ABIPRISM3770型核酸序列測定儀進(jìn)行測序，具體操作按照儀器說明書進(jìn)行；b)序列拼接利用軟件VectorNtisoftware(InforMaxInc.,USA)將測序結(jié)果拼接成完整的病毒基因組序列，基因組長度為11037bp(序列表SEQIDN0.1)，與HIRRV韓國株(GenBankAcc.No.NC—005093)相似，病毒核酸為單鏈RNA，GC含量50.8%。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列的測序方法，其特征是基因組序列驗證序列分析基因組在DNAStar軟件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.,MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.riih.gov/projects/gorf(ORFfinder)運行分析，驗證所有的開放讀碼框(Openreadingframes,ORFs)，所有的開放閱讀框都由ATG開始，至少編碼40個氨基酸才成為一個假定基因；序列驗證分別根據(jù)每個0RF的序列設(shè)計了引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于L基因太長，因此設(shè)計4對引物，將其分成4段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與所預(yù)測的ORF序列進(jìn)行比較，驗證HRV的五個開放閱讀框的存在和序列。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。一種牙鲆彈狀病毒的全基因組序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全長包括11037個核苷酸。本發(fā)明是采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列測定技術(shù)，對牙鲆彈狀病毒進(jìn)行了分段擴(kuò)增、克隆、序列測定及分析。牙鲆彈狀病毒基因組由11037個核苷酸組成，包括5個開放讀碼框(ORF)，病毒核酸為單鏈RNA，GC含量50.8％，其中的部分核苷酸序列可以用于牙鲆彈狀病毒的分子學(xué)診斷和相關(guān)核酸疫苗的開發(fā)。該基因組為中國首次在石鰈魚中分離出的牙鲆彈狀病毒的基因組序列進(jìn)行測定，對進(jìn)一步研究該病毒的致病機(jī)理和檢測方法有著重要的意義。文檔編號C12N15/40GK101629179SQ20091001317公開日2010年1月20日申請日期2009年8月13日優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日發(fā)明者葒劉,斌吳,孫穎杰,岳志芹,葉李申請人:孫穎杰;劉葒;岳志芹;吳斌;李葉