專利名稱：一種集成微流控芯片及其用于活細(xì)胞控制與分析的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控芯片，尤其是一種集成微流控芯片，應(yīng)用該集成微流控芯片能夠進(jìn)行時(shí)間與空間控制不同種類細(xì)胞的定位培養(yǎng)及相互作用研究。
背景技術(shù)：
微流控芯片技術(shù)是指把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米或更小的芯片上，由微通道網(wǎng)絡(luò)運(yùn)輸流體貫穿于整個(gè)系統(tǒng)以控制生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。微流控芯片的最大優(yōu)勢在于微小尺寸下各種功能單元技術(shù)的靈活組合和規(guī)模集成，其結(jié)果是實(shí)現(xiàn)最大限度的自動(dòng)化、高通量和
低消耗。與此同時(shí)，微流控芯片的上述特征使得芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)概念向基于微流控芯片平臺的基因診斷、病毒檢測及細(xì)胞分析研究的滲透成為可能。這種從傳統(tǒng)的中心實(shí)驗(yàn)室向芯片實(shí)驗(yàn)室的模式轉(zhuǎn)變將為許多研究工作帶來革命性進(jìn)步， 一些原本無法實(shí)現(xiàn)的工作諸如復(fù)雜生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、微觀生命科學(xué)研究、野外考察、疾病現(xiàn)場檢測等將藉助于芯片實(shí)驗(yàn)室得以完成。
由于在高通量、微型化、集成化、自動(dòng)化和便攜化等方面的巨大發(fā)展?jié)摿Γ畮啄陙?，微流控芯片技術(shù)受到了國內(nèi)外生物化學(xué)、分析化學(xué)、分子毒理學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的高度重視，也成為21世紀(jì)最為重要的前沿技術(shù)之一。目前，基于微流控芯片技術(shù)的基因分析、蛋白質(zhì)(酶)分析、核酸分析、免疫分析等方面的應(yīng)用，已取得很大的進(jìn)展。此外，基于微流控芯片技術(shù)的單細(xì)胞研究也正在有條不紊地進(jìn)行。國外已初步實(shí)現(xiàn)了微米級管道或腔內(nèi)的多種類型活細(xì)胞培養(yǎng)R. Gomez-Sjoberg, A.A. Leyrat, D.M.Pirone， et al., Anal. Chem. 2007， 79(22): 8557-8563.及其實(shí)時(shí)分析；同時(shí)產(chǎn)
生了一批以基于活細(xì)胞的藥物篩選與分析系統(tǒng)、細(xì)胞傳感器等為代表分析設(shè) 備P.J. Lee， RJ. Hung, V.M. Rao, et al.， Biotechnol. Bioeng. 2006， 94(1): 5-14.，其簡單、快捷、高通量和高敏感性優(yōu)勢，在很大程度上促進(jìn)了生命 科學(xué)研究進(jìn)展，同時(shí)也進(jìn)一步加速了該技術(shù)的多元化、市場化，從而服務(wù)于 社會(huì)。
然而，微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，尤其 涉及到細(xì)胞精確控制與定位以及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用方面。針對細(xì)胞的控制 與定位，現(xiàn)多采用表面化學(xué)修飾法來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的黏附與脫離E.E.Hui，S.N. Bhatia, PNAS 2007, 104(14): 5722-5726.，且這種方法具有不可逆性和非重 復(fù)性。關(guān)于細(xì)胞相互作用的微流控芯片，目前也僅實(shí)現(xiàn)了簡單的平行單管道 7jC平A.P. Wong， R. Perez畫Castillejos， L丄Christopher, et al., Biomaterials 2008: 29(12): 1853-1861.。因此，建立一種多功能集成的微流控芯片分析系統(tǒng)與 平臺，實(shí)施細(xì)胞的精確控制與定位，開展細(xì)胞相互作用研究，不僅有利于研 究工作的簡單、高效、快速的展開，同時(shí)也有利于加快所獲得技術(shù)成果的市 場化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種集成微流控芯片以及該集成微流控芯片應(yīng) 用于各種生理和病理情況下的多種細(xì)胞相互作用研究。本發(fā)明的一種集成微 流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)多種細(xì)胞的精確定位、共培養(yǎng)，開展時(shí)間與空間控制的單 細(xì)胞水平的生命科學(xué)研究。同時(shí)，該芯片的應(yīng)用改變了以往慣用的兩種類型 細(xì)胞相互作用研究模式，拓寬了細(xì)胞相互作用研究的范圍，發(fā)揮了其研究系 統(tǒng)全面性的特點(diǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案
一種集成微流控芯片，其特征在于，該集成微流控芯片自上而下設(shè)有流動(dòng)層、控制層和覆蓋虔，其中，流動(dòng)層主要由一個(gè)微米級管道網(wǎng)絡(luò)和四個(gè)圓 形細(xì)胞培養(yǎng)腔組成，流動(dòng)層周邊設(shè)有八個(gè)進(jìn)樣口和兩個(gè)出樣口，中間設(shè)有四
個(gè)圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔，圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔之間通過細(xì)管道相連；控制層設(shè)有二十 八個(gè)進(jìn)氣口，進(jìn)氣口上分別連接單個(gè)管道末端封閉的微闊開關(guān)；覆蓋層則是 對控制層的管道進(jìn)行封裝。
上述集成微流控芯片的制備方法，其特征在于，采用軟光刻技術(shù)，首先 將流動(dòng)層和控制層的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)制成光掩膜;然后進(jìn)行光刻膠涂膜、紫外曝光、 顯影，制備芯片模子；最后將聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已知的彈性 高分子材料覆蓋于芯片模子表面，烘烤固化，顯微鏡下將流動(dòng)層和控制層校 對粘合，再將控制層與覆蓋層粘合封裝，制成集成微流控芯片。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 本發(fā)明的集成微流控芯片選用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已 知的彈性高分子材料，相對于以往芯片材料(如硅、玻璃和石英等)而言， 具有更好的生物兼容性、電絕緣隔離性、熱隔離性等性能，且具有優(yōu)異的透 光性。以上優(yōu)點(diǎn)便于開展活細(xì)胞為基礎(chǔ)的相關(guān)研究。
2、 本發(fā)明的集成微流控芯片的控制層微閥開關(guān)結(jié)構(gòu)，可以在特定時(shí)間 對流動(dòng)層特定區(qū)域進(jìn)行流體的進(jìn)樣和出樣，以及時(shí)間和空間控制各種不同類 型細(xì)胞在各自培養(yǎng)區(qū)的定位以及共培養(yǎng)。
3、 本發(fā)明的集成微流控芯片具有兩兩連接相鄰微型細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的微米 級管道設(shè)計(jì)。相鄰細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的連通，便于研究不同培養(yǎng)區(qū)的同型和異型細(xì) 胞相互作用。
4、 本發(fā)明的集成微流控芯片可開展兩種以上不同類型細(xì)胞的相互作用 研究，突破了以往的兩種細(xì)胞相互作用研究模式，有利于探索生理或病理情 況下各種生物體和組織器官內(nèi)不同種類細(xì)胞的協(xié)作與拮抗。


圖l是集成微流控芯片的流動(dòng)層和控制層平面結(jié)構(gòu)示意圖，其中標(biāo)號分別表示1、 2為流動(dòng)層管道進(jìn)樣口， 3、 4為流動(dòng)層管道出樣口， 5、 6、 7和8 為控制層微閥開關(guān)的進(jìn)氣口， 9、 10、 11和12為微型細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，13為相鄰 培養(yǎng)區(qū)的連接管道，14為控制層的微閥開關(guān)。
圖2是微閥開關(guān)關(guān)閉狀態(tài)的微流控芯片截面圖，其中標(biāo)號分別表示21 為流動(dòng)層單個(gè)管道，22為關(guān)閉狀態(tài)的控制層微閥開關(guān)，23為控制層微閥開關(guān) 的進(jìn)氣管道，24為控制層微閥開關(guān)的進(jìn)氣口。
圖3是流動(dòng)層管道半關(guān)閉狀態(tài)的微流控芯片截面圖，其中標(biāo)號分別表示: 31為半開啟狀態(tài)的微閥開關(guān)，32為低氣壓氣體進(jìn)入微閥開關(guān)管道。
圖4是流動(dòng)層管道完全關(guān)閉狀態(tài)的微流控芯片截面圖，其中標(biāo)號分別表 示41為完全開啟狀態(tài)的微闊開關(guān)，42為較高氣壓氣體進(jìn)入微閥開關(guān)管道。
圖5是集成微流控芯片內(nèi)定位接種第一種細(xì)胞的示意圖，其中51為關(guān)閉 狀態(tài)的微閥開關(guān)，52為完全開啟狀態(tài)的微閥開關(guān)，53為第一種細(xì)胞。
圖6是集成微流控芯片內(nèi)定位接種第一種細(xì)胞后清洗的示意圖，其中61 為清洗液進(jìn)入路線。
圖7是集成微流控芯片內(nèi)定位接種第二種細(xì)胞的示意圖，其中71為第二 種細(xì)胞。
圖8是集成微流控芯片內(nèi)定位接種第二種細(xì)胞后清洗的示意圖，其中81 為清洗液進(jìn)入路線。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
如圖1所示，本實(shí)施例制備的集成微流控芯片，由流動(dòng)層、控制層和覆 蓋層(自上而下)三層組成。其中，流動(dòng)層周邊設(shè)有八個(gè)進(jìn)樣口 (如圖標(biāo)號 1、 2處，每處4個(gè))以及兩個(gè)出樣口 (如圖標(biāo)號3、 4處)，中間設(shè)有四個(gè)圓形 細(xì)胞培養(yǎng)腔(如圖標(biāo)號9、 10、 11、 12)，通過細(xì)管道13將相鄰的腔體兩兩連 接以進(jìn)行細(xì)胞相互作用研究?？刂茖釉O(shè)有共二十八個(gè)進(jìn)氣口 (如圖標(biāo)號5、 6、 7、 8處，每處7個(gè))，分 別連接單個(gè)管道末端封閉的微閥開關(guān)。
微流控芯片的制作(以PDMS微流控芯片的制作為例)
1、 采用軟光刻技術(shù)制備芯片模子，首先將流動(dòng)層和控制層的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu) 制成光掩膜；然后進(jìn)行光刻膠(SU-8)涂膜、使用曝光機(jī)進(jìn)行紫外曝光， 隨后用顯影劑進(jìn)行顯影，從而制備出芯片模子，其中流動(dòng)層模子的厚度為40
控制層模子的厚度為25iim。
2、 微流控芯片的制備將聚二甲基硅氧垸(PDMS)預(yù)聚物分別覆蓋 于流動(dòng)層和控制層模子表面，其中流動(dòng)層所用PDMS預(yù)聚物(合成橡膠:交聯(lián) 劑，比例為5:1)，控制層所用PDMS預(yù)聚物(合成橡膠:交聯(lián)劑，比例為20:1), 分別烘烤固化，然后將流動(dòng)層和控制層在顯微鏡下校對粘合。將該雙層以控 制層表面粘合于涂有均勻PDMS預(yù)聚物(合成橡膠:交聯(lián)劑，比例為5:1)的 覆蓋層的玻片上封裝。最后放入烘箱內(nèi)烘烤，加速層層粘合，從而制備出 PDMS集成微流控芯片。
實(shí)施例2:
控制層進(jìn)氣口上的微閥開關(guān)對流動(dòng)層管道的控制如圖2所示，進(jìn)氣口24 未進(jìn)氣時(shí)，微閥開關(guān)管道23內(nèi)處于大氣壓狀態(tài)，微閥開關(guān)22則處于關(guān)閉狀態(tài)， 此時(shí)流動(dòng)層管道21暢通，管道內(nèi)樣品可任意出入；當(dāng)較低壓強(qiáng)(20 psi)氣 體32進(jìn)入微閥開關(guān)管道時(shí)(圖3所示)，微閥開關(guān)31膨脹而呈現(xiàn)凸起，使流動(dòng) 層管道處于半關(guān)閉狀態(tài)；進(jìn)一步，如圖4所示，當(dāng)較高壓強(qiáng)(40psi)氣體42 進(jìn)入微閥開關(guān)管道時(shí)，微閥開關(guān)41與流動(dòng)層管道完全緊貼，封閉了流動(dòng)層管 道，從而達(dá)到控制流動(dòng)層管道內(nèi)樣品出入的目的。 實(shí)施例3:
本實(shí)施例以微流控芯片內(nèi)進(jìn)行肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞定位培養(yǎng)為例。 1、首先將制備的實(shí)施例l中的微流控芯片進(jìn)行高壓滅菌，然后對流動(dòng)層 管道和腔體進(jìn)行清洗(采用微量注射泵進(jìn)樣，清洗液選用0.01M的PBS，pH=7.4，流速25nL/min，時(shí)間15min)，再對流動(dòng)層管道和腔體的表面進(jìn)行 包被修飾(包被修飾物選用多聚-L-賴氨酸，10(Hig/mL， 37°C， 2h)，再清洗 (同樣采用微量注射泵進(jìn)樣，清洗液選用0.01M的PBS， pH=7.4，流速 25nL/min，時(shí)間15min)，無菌氣體吹干，待用。
2、 制備肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞懸液，本實(shí)施例中選用肝癌細(xì)胞系細(xì)胞 (HepG2細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞系細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)，通過常規(guī)體外細(xì)胞培
養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)增。臨用時(shí)將細(xì)胞分別消化，離心，重懸，細(xì)胞密度 調(diào)整為l(^個(gè)細(xì)胞/mL。
3、 細(xì)胞進(jìn)樣，首先對肝癌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)樣(如圖5所示)，將肝癌細(xì)胞培 養(yǎng)區(qū)和細(xì)胞進(jìn)樣路線的微閥開關(guān)關(guān)閉，其它細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)和管道的微閥開關(guān)開 啟，形成單一通路，配合微量注射泵，將肝癌細(xì)胞接種于特定的培養(yǎng)區(qū)內(nèi)； 開啟肝癌細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)微閥開關(guān)(如圖6所示)，使肝癌細(xì)胞定位于該區(qū)域，然 后對進(jìn)樣路線中的周邊管道進(jìn)行清洗(DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，以便于進(jìn)行下 一種細(xì)胞的進(jìn)樣，防止不同種類細(xì)胞的交叉污染。靜置20min，促進(jìn)細(xì)胞貼 壁。第二步，成纖維細(xì)胞進(jìn)樣(如圖7所示)，將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)和細(xì)胞進(jìn) 樣路線的微閥開關(guān)關(guān)閉，其它細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)和相關(guān)管道的微閥開關(guān)開啟，配合 微量注射泵，將成纖維細(xì)胞接種于特定的培養(yǎng)區(qū)內(nèi)；開啟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)區(qū) 微閥開關(guān)(如圖8所示)，關(guān)閉該培養(yǎng)區(qū)，然后對進(jìn)樣路線中的周邊管道進(jìn)行 清洗，并靜置10min。
4、 芯片內(nèi)細(xì)胞的培養(yǎng)，參照生物體體內(nèi)狀態(tài)，盡量保障相對靜態(tài)的細(xì) 胞生長環(huán)境，采用隔時(shí)微量進(jìn)樣方式，配合微量注射泵進(jìn)樣功能，對芯片內(nèi) 細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)的供給(細(xì)胞培養(yǎng)液)，每2小時(shí)進(jìn)樣一次，每次lmin，進(jìn)樣速 率為5pL/min，此時(shí)4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的微闊開關(guān)均為關(guān)閉狀態(tài)。細(xì)胞生長和細(xì) 胞行為則通過倒置顯微鏡進(jìn)行定時(shí)觀察、記錄。
權(quán)利要求
1、一種集成微流控芯片，其特征在于，該集成微流控芯片自上而下設(shè)有流動(dòng)層、控制層和覆蓋層，其中，流動(dòng)層主要由一個(gè)微米級管道網(wǎng)絡(luò)和四個(gè)圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔組成，流動(dòng)層周邊設(shè)有八個(gè)進(jìn)樣口和兩個(gè)出樣口，中間設(shè)有四個(gè)圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔，圓形細(xì)胞培養(yǎng)腔之間通過細(xì)管道相連；控制層設(shè)有二十八個(gè)進(jìn)氣口，進(jìn)氣口上分別連接單個(gè)管道末端封閉的微閥開關(guān)；覆蓋層則是對控制層的管道進(jìn)行封裝。
2、 如權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述集成微流 控芯片的材料為聚二甲基硅氧垸，或者是已知的彈性高分子材料、玻璃及其 硅相結(jié)合的芯片材料。
3、 如權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述的控制層 進(jìn)氣口上的微閥開關(guān)，分別用于對流動(dòng)層不同管道位置的樣品輸入和輸出進(jìn) 行時(shí)間和空間的控制。
4、 權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片的制備方法，其特征在于該方 法首先將流動(dòng)層和控制層的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)制成光掩膜；然后進(jìn)行光刻膠涂膜、紫 外曝光、顯影，制備芯片模子；最后將聚二甲基硅氧垸或其他已知的彈性高 分子材料覆蓋于芯片模子表面，烘烤固化，顯微鏡下將流動(dòng)層和控制層校對 粘合，再將控制層與覆蓋層粘合封裝，制成集成微流控芯片。
5、 權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片用于活細(xì)胞控制與分析的應(yīng)用。
6、 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，對兩種以上不同種類的細(xì) 胞在集成微流控芯片的不同區(qū)域進(jìn)行定位接種和共培養(yǎng)以及開展多種細(xì)胞 的相互作用研究。
7、 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，通過細(xì)管道將相鄰的圓形 細(xì)胞培養(yǎng)腔直接兩兩連接，便于不同區(qū)域培養(yǎng)的不同種類細(xì)胞的相互作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于不同種類細(xì)胞定位、培養(yǎng)和相互作用的集成微流控芯片，由流動(dòng)層、控制層和覆蓋層(自上而下)三層組成。其中，流動(dòng)層主要由一個(gè)微米級管道網(wǎng)絡(luò)和四個(gè)圓形腔組成，通過細(xì)管道將相鄰的腔體兩兩連接，該層總共有十個(gè)進(jìn)出樣口。控制層由數(shù)個(gè)單管道末端封閉的微閥開關(guān)組成，可以分別對流動(dòng)層不同管道位置的樣品輸入和輸出進(jìn)行時(shí)間和空間的控制。本發(fā)明的集成微流控芯片具有制備材料優(yōu)質(zhì)、制備方法重復(fù)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。可開展對多種類細(xì)胞的定位共培養(yǎng)及相互作用研究。
文檔編號C12M3/00GK101597568SQ20091002316
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者麗 任, 任莉莉, 劉文明, 鵬 宋, 立 李, 王旭明, 王進(jìn)義, 王雪琴 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)