專(zhuān)利名稱：腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR?，F(xiàn)有技術(shù)
RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是指外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double-stranded RNA， dsRNA)進(jìn)入生物體細(xì)胞后在Dicer作用下，被裂解成由正義鏈和反義鏈組成的21 23nt的小分子干擾性RNA (smallinterfering RNA, siRNA)， siRNA作為向?qū)蛄校cRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC)結(jié)合，引起與其同源的mRNA特異性降解，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。其是涉及基因功能、基因治療等領(lǐng)域的重要研究手段。近年來(lái)RNAi技術(shù)被廣泛地應(yīng)用到腫瘤的基因治療研究中。實(shí)施RNAi技術(shù)的小分子有siRNA， shRNA及miRNA。 miRNA是生物體內(nèi)一類(lèi)重要的調(diào)控分子，多具有數(shù)十個(gè)乃至上百個(gè)耙基因。其中一些miRNA具有腫瘤抑制作用。因此，利用miRNA表達(dá)載體抑制腫瘤增殖作用的miRNA,將成為腫瘤基因治療的新方法，具有重要的理論及實(shí)際意義。目前，商品化的miRNA表達(dá)載體多為通用性表達(dá)載體，其所選用的啟動(dòng)子以在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均活性很高，且能被RNAPol II識(shí)別的啟動(dòng)子為準(zhǔn)，如Invitrogen公司產(chǎn)品BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kits ， Ambion公司的pSilencerTM4.1-CMV Expression Vectors,武漢晶賽公司基于microRNAmir-30雙臂結(jié)構(gòu)的shRNAmir質(zhì)粒載體pGenesil-Mir30sh，所用啟動(dòng)子均為pol IIhuman CMV promoter 。因miRNA與shRNA結(jié)構(gòu)相j以，故可以用miRNA的表達(dá)框架來(lái)表達(dá)shRNA。這類(lèi)載體的缺陷在于其雖能保證miRNA或shRNA的正常表達(dá)，但如果將其應(yīng)用于腫瘤基因治療中時(shí)，此類(lèi)載體除了在腫瘤中表達(dá)以外，還可以在正常細(xì)胞中表達(dá)，這樣就可能出現(xiàn)在抑制了腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，還會(huì)抑制正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果能應(yīng)用腫瘤特異性啟動(dòng)子，使得miRNA或shRNA只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，就可提高腫瘤基因治療的特異性和耙向性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體，通過(guò)腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin promoter和厭氧反應(yīng)元件(HRE)的雙調(diào)控，使得該載體在腫瘤組織特異性表達(dá)，避免其對(duì)正常組織的損傷。同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的多靶點(diǎn)或多位點(diǎn)治療，提高腫瘤治療療效。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明以pMD19-T載體為框架載體，分別連接上五個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件HRE5， survivin promoter,及包含GFP的miRNA表達(dá)框架，載體大小為4592bp，載體序列為
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60csgcttgtct gtsagcggst gccgggsgcs gacaagcccg tcagggcgcg tcsgcgggtg 120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcsga gcagattgta ctgagsgtgc 18Qaccatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaatsccgc atcaggcgcc 240attcgccatt caggctgcgc asctgttggg ssgggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctst 300tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt scgcgcggat 420cttccagaga ttactagtcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttggtcgac 480cccacagtgc atacgtgggc tccaacaggt cctcttgcgg ccgcccacag tgcatacgtg 540ggtcctcttccatggccacagtgcatacgtgggctccascaggtcctctt600
cggdtccgccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccggaattgcatgcgcg660
gcagtcgsgggggcgctsggtgtgggcagggacgagctggcgcggcgtcg720
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ccccgcgccgccccgcctctggccgcggggggtggaccgcctasgsgggc840
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3CCCCCC33gttcgggtgasggcccsgggctcgcagccaacgtcggggcggcsggccctg2280
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tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcg2640
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cgcaggasagaacatgtgagceissaggccagca333ggccaassggccgc2760
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tggtagcggtggtttttttgtttgcsagcsgcsgattacgcgcagaaaaaasggatctca3360
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cttaatcagtgsggcscctatctcagcgatctgtctatttcgttcstccatsgttgcctg3600
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aatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttaaccsgcc3gc3720
cggsagggccgagcgcagaagtggtcctgcasctttstccgcctccstccagtctattaa3780
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catgagcggatacatatttgaatgtatttattccgcgcac4500
atttccccgactgacgtctaagaaaccattattatcatgacattsaccts4560
cgtatcacgaggccctttcgtc4592
載體上各元件位置為HRE5: 439-651Survivin promtor: 658-924GFP: 1055-1774MCS: 1862-1889PolA: 2016-2332Ori: 2774-3362Amp: 3533-4393
SpeI:433-438Sphl: 652-657Fbal: 925-930Sad: 2327-2332EcoRI: 1862-1867Pstl: 1867-1872Nhel: 1872-1877
HindIII: 1884-1889
本發(fā)明構(gòu)建的腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在腫瘤細(xì)胞中可以正常表達(dá)，在原代培養(yǎng)的小鼠正常細(xì)胞不表達(dá)。而且在厭氧條件下該載體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)，說(shuō)明該載體可以實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性和厭氧雙調(diào)控表達(dá)。


圖1 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。
圖2 dsoligo電泳鑒定圖。
圖3 HRE5PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖4 SpPCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖5 MCS位點(diǎn)ds oligo退火后電泳圖。
圖6 miR側(cè)翼片段PCR電泳圖。
圖7 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡圖像。
圖7 (1)為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光照片。
圖7 (2)為小鼠原代培養(yǎng)皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)然后熒光照片。
其中A，B，C分別為正常培養(yǎng)條件下pEGFP-Cl， pMD-SURV/EmGFP-miR:pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光照片。D， E， F分別為厭氧(1.1%02 ) 培養(yǎng)條件下 pEGFP-Cl ， pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光照片。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
參照?qǐng)D1所示，腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR結(jié)構(gòu)圖。載體大小為4592bp。其主要元件為5個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件(HRE5)， survivin promoter及miRNA表達(dá)框架，在miRNA表達(dá)框架上有插入串聯(lián)miRNA或shRNA的多克隆(MCS)位點(diǎn)，其酶切位點(diǎn)為EcoRI， Pstl, Nhel, Kpnl, HindIII.
參照?qǐng)D2所示，連接于pMD19-T載體上，且用于連接HRE5， survivinpromoter及miRNA表達(dá)框架的酶切位點(diǎn)寡核苷酸雙鏈ds oligo電泳鑒定圖。其大小為43bp。 Marker大小依次為25 bp， 50 bp， 75 bp， 100 bp， 150 bp，200 bp， 250 bp， 300 bp， 350 bp, 500 bp， 766bp。從圖中可見(jiàn)該寡核酸雙鏈退火成功，大小正確。
參照?qǐng)D3所示，HRE5 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)225bp。Marker大小分別為50bp, 100bp,150bp, 200bp， 250bp， 300bp， 350bp, 400bp, 500bp。因HREs為5個(gè)相同的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，所以擴(kuò)增出大小不等的5個(gè)片段，膠回收時(shí)只切取225bp產(chǎn)物片段，即最大片段。
參照?qǐng)D4所示，最亮條帶為300bp。該產(chǎn)物片段長(zhǎng)279bp。 Marker大小分別為50bp, 100bp， 150bp,200bp， 250bp， 300bp， 350bp， 400bp， 500bp?？梢?jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小正確。
參照?qǐng)D5所示，該序列長(zhǎng)為33bp。 Marker大小依次為25 bp， 50 bp，75bp， 100 bp， 150 bp， 200 bp， 250 bp， 300 bp， 350 bp， 500 bp， 766bp。從圖中可見(jiàn)該寡核酸雙鏈退火成功，大小正確。
參照?qǐng)D6所示，該產(chǎn)物大小為1408bp。 Marker由下往上兩條帶大小分別為lkb， 2kb。 Marker由下往上兩條帶大小分別為lkb， 2kb， 3kb， 4kb， 5kb，6kb， 7kb, 8kb， 10kb。從圖中可見(jiàn)miRNA表達(dá)框架擴(kuò)增大小正確。
參照?qǐng)D7(1)、 (2)所示，其中A， B， C分別為正常培養(yǎng)條件下pEGFP-Cl，pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光照片。D ， E ， F分別為厭氧(1.1% 02 )培養(yǎng)條件下pEGFP-Cl,pMD-SURV/EmGFP-miR, PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光照片。從 圖 中 可 見(jiàn) ， pEGFP-Cl, pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在HepG2細(xì)胞中無(wú)論在正常培養(yǎng)還是厭氧培養(yǎng)都有表達(dá)，但是pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在厭氧條件下的表達(dá)高于正常培養(yǎng)條件下 。pEGFP-Cl， pMD-SURV/EmGFP-miR，PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR三個(gè)載體在小鼠正常培養(yǎng)皮膚細(xì)胞中，無(wú)論在正常培養(yǎng)還是厭氧培養(yǎng)，只有pEGFP-Cl表達(dá)，而pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 兩個(gè)載體均無(wú)表達(dá)。說(shuō)明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表達(dá)具有腫瘤特異性及低氧調(diào)控性。本發(fā)明解決了有關(guān)腫瘤基因治療存在的兩個(gè)問(wèn)題
(1)腫瘤特異性表達(dá)問(wèn)題。首先選用在腫瘤中高表達(dá)的腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin promoter。近年研究發(fā)現(xiàn)Survivin在正常分化成熟的組織中幾無(wú)表達(dá)，僅見(jiàn)于胚胎細(xì)胞、胸腺、睪丸和分泌期子宮內(nèi)膜，而在幾乎所有人類(lèi)腫瘤中高表達(dá)，且表達(dá)具有腫瘤細(xì)胞依賴性。由于survivin啟動(dòng)子調(diào)控的基因能在部分正常細(xì)胞中表達(dá)，因此以其為調(diào)控序列的基因治療將會(huì)影響胸腺、睪丸和分泌期子宮內(nèi)膜。為了降低其在正常組織中表達(dá)治療性基因，可以在survivin啟動(dòng)子上游增加低氧調(diào)控的增強(qiáng)子即低氧反應(yīng)元件(hypoxia responseelement, HRE)，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的腫瘤特異性改造。大多數(shù)惡性腫瘤都存在組織缺氧現(xiàn)象，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，不但能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管再建，而且可以使腫瘤血管通透性增加，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò) 程中具有重要的作用。其在幾乎所有的實(shí)體瘤細(xì)胞中都有過(guò)量的表達(dá)，而在
正常組織中不表達(dá)或極少表達(dá)。VEGF表達(dá)水平的高低與VEGF啟動(dòng)子 (VEGFP)的HRE有關(guān)。該元件在低氧的誘導(dǎo)下可以增強(qiáng)VEGF表達(dá)，并 作為腫瘤靶向基因治療的重要增強(qiáng)子。因此，應(yīng)用HRE與survivin啟動(dòng)子聯(lián) 合構(gòu)建HRE-survivin啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的miRNA或shRNA表達(dá)載體，具有成功的 可能性。該載體將有助于提髙腫瘤基因治療的特異性，同時(shí)避免對(duì)正常組織 殺傷作用，增加腫瘤基因治療的安全性。
(2)多靶點(diǎn)基因治療問(wèn)題。腫瘤的發(fā)生是多基因共同作用的結(jié)果。單純 針對(duì)某一靶基因的治療效果往往不是十分理想，如果能同時(shí)作用與腫瘤相關(guān) 的多個(gè)靶基因，實(shí)現(xiàn)多途徑，多靶點(diǎn)的治療，就可明顯提高療效。本發(fā)明在 載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 5個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，這樣就可實(shí)現(xiàn)隨意插入不同 miRNA或shRNA，使得串聯(lián)的miRNA或shRNA同時(shí)表達(dá)，達(dá)到多耙點(diǎn)治 療的目的。
本發(fā)明的腫瘤特異性表達(dá)載體是以pMD19-T載體為框架載體，分別連 接上5個(gè)串聯(lián)的HRE (5HRE)， survivin promoter,及miRNA表達(dá)框架三個(gè) 主體元件，構(gòu)建成為新的腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表 達(dá)載體pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，其中在miRNA表達(dá)框架中有EmGFP 作為報(bào)告基因，EmGFP下游為插入miRNA或shRNA的多克隆位點(diǎn)，及PolA 尾。
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖及MCS內(nèi)切酶位點(diǎn)詳細(xì) 序列如圖l所示。1. pMD19-T載體的改造
1)化學(xué)合成包含SpeI, Sphl， Fbal, Sacl四個(gè)酶切位點(diǎn)的寡核苷酸 鏈。其序列為
sense oligo - 5，-actagtatcagcgcatgccaagattgatcagaatcggagctca- 3， anti-sense oligo s 5' -gagctccgattctgatcaatcttggcatgcgctgatactagta-3，
2) 雙鏈寡核苷酸的合成將合成好的sence oligo和antisence oligo 在95。C 4min,常溫5 10min下退火形成雙鏈。
3) 鑒定退火雙鏈:取lul退火液，加99ulH20，稀釋為500nM。用4%的瓊 脂糖凝膠電泳鑒定退火雙鏈。退火后雙鏈長(zhǎng)43bp.如圖2。電泳證實(shí)dsoligo 退火成功。
4) 用500nM ds雙鏈與P隨9-T載體相連，轉(zhuǎn)化PMD19-T與ds Oligo 的連接產(chǎn)物pMD-ds。
5) 挑單菌落，過(guò)夜搖菌。
6) 提取質(zhì)粒酶切鑒定后，送測(cè)序。測(cè)序正確，將此載體作為框架載體， 將HREs， Survivin promoter及miRNA表達(dá)框架依次連接到pMD-ds載體上。
2. 低氧反應(yīng)元件HRE5的獲得包含5個(gè)HRE串聯(lián)片段的載體 pEGFP-5HR (石秦東，張蓬勃，康前雁等，以五Gi^為叛普基厲游潛蔬f鑒 ^^/i載謬y^/l6^^^"定。南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007， 27 (12))的獲得是由 西安交大醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究所石秦東惠贈(zèng)。設(shè)計(jì)HRE5引物，以pEGFP-5HR 載體為模板擴(kuò)增HREs，產(chǎn)物長(zhǎng)225bp。引物5'端加Spel酶切位點(diǎn)，3，端加 Sphl酶切位點(diǎn)。引物序列如下HRE5 forward primer: 5'-AGTAGTCCAGAGTGGATACGTGG-3， HRE5 reverse primer : 5，-GGATGGAATTCCGGAAGAGGACCTGTT-3'
1) PCR擴(kuò)增獲得HRE5片段，經(jīng)電泳證實(shí)擴(kuò)增片段大小正確，如圖3。 因有相同的串聯(lián)片段，故擴(kuò)出了大小不等的5條片段，膠回收時(shí)只切割200bp 以上條帶即可。
2) 膠回收HREs片段，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化后，挑菌，提取質(zhì) 粒酶切鑒定，送測(cè)序。該載體記為T(mén)-HRE5。
3. survivin promoter的獲得
1) 提取培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞基因組DNA。
2) 以上述DNA為模板擴(kuò)增survivinpromoter,引物序列如下 Sp forward primer: 5'-GGATGGGGGTTGTTTGAAAGGAGTG-3，
Sp reverse primer: 5'-TGATCAGCCGCCGCCGCGAGGTCTGGGAACGGG-3' 引物5，端加SphI酶切位點(diǎn)，3'端加Fbal酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)279bp。 PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖4:
3) 膠回收Survivin promoter片段，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化后，挑 菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測(cè)序。該載體記為T(mén)-SP。
4. miRNA表達(dá)框架的獲得
1)改造商品化miR載體pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR。 a.在插入pre-miRNAdsoligo的位置插入包含有EcoRI， Pstl， Nhel ， Kpnl， Hind III五個(gè)酶切位點(diǎn)的MCSdsoligo?；瘜W(xué)合成oligo DNA序列； Sense: 5' -TGCTGGAATTCTGCAGCTAGCGGTACCAAGCTT-3' Antise脆5' -CCTGAAGCTTGGTACCGCTAGCTGCAGAATTCC畫(huà)3，鑒定如圖5。
c. 將dsoligoDNA與pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR連接，轉(zhuǎn)化，挑菌， 提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測(cè)序。該載體記為pcDNA6.2-GW/EmGFP-ds。
2) 以pcDNA 6.2-GW/EmGFP-ds為模板，擴(kuò)增包含有EmGFP及polA 的miRNA表達(dá)框架。引物序列如下
miR forward primer: 5'-TGATCATCTGGCTAACTAGAGAACCCAC- 3' miR reverse primer: 5'-GAGCTCAACAGCTATGACCATGTAATAC-3' 擴(kuò)出的片段長(zhǎng)1408bp。引物5，端加入FbaI酶切位點(diǎn)，3，端加入Sacl酶切 位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定如圖6:
3) 膠回收miRNA表達(dá)框架，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，提 取質(zhì)粒酶切鑒定，送測(cè)序。該載體記為T(mén)-miR。
5. pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表達(dá)載體的連接
1) 用Spel和Sacl雙酶切PMD-ds，膠回收大片段。
2) 用Spel和Sphl雙酶切T-HRE5,用Sphl和Fbal雙酶切T-Sp,用Fbal 和Sacl雙酶切T-miR，分別將每個(gè)酶切產(chǎn)物的小片段膠回收。
3) 將pMD-ds膠回收的大片段與回收的HRE5, SP, miRNA表達(dá)框架一起 連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，提質(zhì)粒酶切鑒定，送測(cè)序。此次構(gòu)建好本發(fā)明的腫瘤特 異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或 shRNA表達(dá)載體 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR0
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表達(dá)載體表達(dá)功能的驗(yàn)證
實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在腫瘤細(xì)胞中的正常表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)步驟1. 將測(cè)序正確的pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒， 同時(shí)亦將本發(fā)明過(guò)程中構(gòu)建的測(cè)序正確且無(wú)HRE5的載體 pMD-SURV/EmGFP-miR菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。同時(shí)提取pEGFP-Cl 質(zhì)粒，作為陽(yáng)性對(duì)照組。
2. 培養(yǎng)不同的腫瘤細(xì)胞，包括肝癌細(xì)胞SSCM7721， H印G2,Hep3B，胃 癌細(xì)胞7901，肺癌細(xì)胞A549，宮頸癌細(xì)胞HeLa,乳腺癌MCF-7，胰 腺癌BXPC-3，黑色素瘤細(xì)胞EH。
3. 原代培養(yǎng)小鼠腦細(xì)胞，胃細(xì)胞及皮膚細(xì)胞。
4. 將培養(yǎng)細(xì)胞按5X107孔接種于24孔板中，每種細(xì)胞接種3孔，分別 用于轉(zhuǎn)染pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR, pMD-SURV/EmGFP-miR 及pEGFP-Cl三個(gè)不同的質(zhì)粒。重復(fù)種兩塊相同的24孔培養(yǎng)板，待 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后一塊置于正常氧濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 一塊置于厭氧培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)(1.1%02)。
5. 用lipofectam 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，24 h后在熒光顯微鏡下通過(guò)觀察GFP 的表達(dá)來(lái)判斷 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR ， pMD-SURV/EmGFP-miR載體在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在不同的腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)， 且在低氧培養(yǎng)下pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表達(dá)高于正常培養(yǎng)組，亦 高于低氧培養(yǎng)下轉(zhuǎn)染的pMD-SURV/EmGFP-miR載體組。在上述腫瘤細(xì)胞中 表達(dá)最高的為HepG2，表達(dá)較高的為Bxpc-3， MCF-7。在小鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞 中，pMD-SURV/EmGFP-miR和pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR無(wú)論在正常 培養(yǎng)下，還是厭氧培養(yǎng)均無(wú)表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出很好的缺氧誘導(dǎo)作 用和高水平的表達(dá)，且在正常細(xì)胞不表達(dá)。說(shuō)明 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在腫瘤細(xì)胞中能夠有效地進(jìn)行缺氧誘導(dǎo) 和調(diào)控工作，為后期在該載體中插入miRNA或shRNA串聯(lián)序列，進(jìn)行miRNA 或shRNA功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。熒光照片見(jiàn)圖7。
權(quán)利要求
1、腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體，其特征在于，以pMD19-T載體為框架載體，分別連接上五個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件HRE5，survivin promoter，及包含GFP的miRNA表達(dá)框架，載體大小為4592bp，載體序列為tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca60cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc180accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc240attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat300tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt360tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat420cttccagaga ttactagtcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttggtcgac480cccacagtgc atacgtgggc tccaacaggt cctcttgcgg ccgcccacag tgcatacgtg540ggctccaaca ggtcctcttc catggccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt600cggatccgcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttccggaat tgcatgcgcg660ttctttgaaa gcagtcgagg gggcgctagg tgtgggcagg gacgagctgg cgcggcgtcg720ctgggtgcac 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2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，載體上各元件位置為:HRE5: 439-651Survivin promtor: 658-924GFP: 1055-1774MCS: 1862-1889PolA; 2016-2332Ori:2774-3362Amp:3533-4393SpeI:433-438 Sphl:652畫(huà)657 Fbal:925-930 Sacl:2327誦2332 EcoRI: 1862-1867 Pstl: 1867-1872 Nhel: 1872-1877HindIII: 1884-1889
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體，該載體以pMD19-T為框架載體，包括5個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件HRE₅，survivin promoter及miRNA表達(dá)框架反應(yīng)元件。在miRNA表達(dá)框架中包含有EmGFP元件，及MCS多克隆位點(diǎn)。MCS位點(diǎn)可以插入多個(gè)不同的miRNA或shRNA序列，實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)或多位點(diǎn)干預(yù)。載體大小為4592bp，載體命名為pMD-HRE₅-SURV/EmGFP-miR。本發(fā)明通過(guò)HRE₅及survivin promoter實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療，避免對(duì)正常組織的損傷。同時(shí)結(jié)合多串聯(lián)miRNA或shRNA，達(dá)到多靶點(diǎn)治療，提高腫瘤治療的特異性和靶向性。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101597622SQ200910022879
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者劉利英, 宋土生, 許德輝, 辰 黃 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)