專利名稱：一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測基因的分子標記方法，特別是涉及一種檢測葡萄抗黑痘病 基因的分子標記方法，和脫氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作為檢測葡萄抗黑痘病基 因探針的寡聚核苷酸序列，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄是一種世界性水果，其面積和產(chǎn)量均居各類水果的第二位，葡萄黑痘病是 一種嚴重危害葡萄的真菌病害，尤其是在葡萄生長季節(jié)雨水較多、濕度較大的地區(qū)，危 害嚴重，常造成葡萄落花落果，葉片穿孔脫落，果粒上有鳥眼狀黑斑等，嚴重影響葡萄 的生長及果實品質(zhì)與產(chǎn)量。傳統(tǒng)防治葡萄黑痘病的方法是對葡萄進行多次噴藥防病，但 化學(xué)防治會造成果實殘毒、污染環(huán)境，不利于人們的身體健康。利用葡萄資源自身的抗 病性，通過雜交育種是培育抗黑痘病葡萄新品種的根本途徑，但通過雜交育種的方法， 選育出抗黑痘病新品種的周期較長， 一般鑒定雜種抗黑痘病性能需3-5年，這種人力、物 力、時間耗費多而效率低的育種方法遠遠不能滿足生產(chǎn)的實際需要。
隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)是一項分子標記技術(shù)，具有快速、簡便、 成本低、多態(tài)性檢測豐富、不需同位素示蹤和安全可靠的特點，可以用于檢測目標基因 的存在與否，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域及農(nóng)作物育種方面得到廣泛的應(yīng)用，并取得明顯成 效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決傳統(tǒng)雜交育種中，葡萄抗黑痘病育種周期長、效率低的難 題，而公開一種用于葡萄抗黑痘病育種中檢測抗黑痘病基因的分子標記方法。
本發(fā)明采用隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)技術(shù)，對葡萄抗黑痘病育種而 獲得的種間雜交R、 &代幼苗進行研究，尋找與葡萄抗黑痘病基因連鎖的DNA分子標 記，用于抗黑痘病育種的早期篩選鑒定，對分子標記研究它的DNA序列組成，合成寡聚 核苷酸，發(fā)展應(yīng)用成檢測葡萄抗黑痘病性狀的探針。 本發(fā)明采用隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)技術(shù)，獲得了葡萄抗黑痘病育 種的基因標記與脫氧核糖核酸(DNA)序列，基因標記為1354堿基對組成及其序列，由此 序列為模板，利用人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC3'作引物，具 有檢測葡萄抗黑痘病基因存在與表達的功能。
本發(fā)明技術(shù)操作步驟如下 a.以葡萄抗黑痘病育種的種間雜交組合白河-35-lX佳利釀的雙親、F工代及&代 為試材，提取、分離、純化脫氧核糖核酸(DNA); b.采用隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)技術(shù)，用Operon公司的隨機引物 196個，分別進行脫氧核糖核酸(DNA)的擴增，其中序列為5' CAGAGGTCCC3'的隨 機引物OPS03可以擴增區(qū)分抗黑痘病與感黑痘病的雜種、親本，獲得了大小約為1300對堿基的脫氧核糖核酸(DNA)片段，該DNA片段是與葡萄抗黑痘病基因相連鎖的分子標 記； c.用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取純化該脫氧核糖核酸 (DNA)片段； d.以pGEM-T載體連接脫氧核糖核酸片段，4"下保持16小時；e.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，提取質(zhì)粒DNA，并于37。C水浴中2小時進行酶切； f.將鑒定為陽性克隆的菌液測定該DNA片段的堿基構(gòu)成及其序列； g.獲得了該脫氧核糖核酸(DNA)片段的實際大小為1354堿基對的序列，即獲得
了基因標記為1354堿基對的序列； h.進一步依據(jù)1354堿基對的全部堿基組成及其序列； i.人工合成4個寡聚核苷酸，其中的l個寡聚核苷酸 5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'可用作引物； j.對原雜交組合雙親及其R代、&代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡 萄，以及雜交組合廣西-lX京可晶的親本及其F工代的脫氧核糖核酸(DNA)作模板進行 PCR擴增； k.獲得特異性脫氧核糖核酸(DNA)片段；
l.用上述方法回收、克隆、測序該DNA片斷； m.獲得該特異性脫氧核糖核酸(DNA)序列大小為lllO堿基對，即獲得了基因標 記為1110堿基對的序列；n.人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'用作引物，對原雜
交組合雙親及其F工代、&代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡萄，以及雜交組合
廣西-lX京可晶的親本及其R代的抗黑痘病性狀可以檢測出來，并以1110對堿基的脫氧
核糖核酸(DNA)片段表現(xiàn)了擁有葡萄抗黑痘病性狀和抗黑痘病基因；o.確定人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'作為檢測葡萄
抗黑痘病基因的DNA探針。 本發(fā)明葡萄抗黑痘病基因標記OPS03-1354對抗黑痘病育種雜交組合廣西-1X 京可晶F工代339株檢測與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為98.53 % ，對組合白河-35-1 X 佳利釀&代207株檢測與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為96.17% ;人工合成的寡聚核苷 酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'作為檢測葡萄抗黑痘病基因的DNA探針對雜交組 合廣西-IX京可晶F工代339株檢測與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為83.57%，對組合白 河-35-1 X佳利釀F2代207株檢測與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為87% 。
具體實施例方式
本發(fā)明其中用脫氧核糖核酸(DNA)作模板進行RAPD擴增的具體步驟為 b.l采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) b丄1混合液體積為25微升 b丄2含有IOXPCR緩沖液2.5微升 b丄3氯化鎂1.5毫摩爾/升 b丄4 dNTP 200微摩爾/升
7
b丄5 Taq DNA聚合酶1個單位 b丄6序列為5' CAGAGGTCCC3'的隨機引物OPS03 1微升 b丄7 45毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA); b.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液 b.2.1 PCR儀為Eppendorf-AG22331型 b.2.2聚合酶鏈反應(yīng)9fC下解鏈5分鐘； b.3進行45個循環(huán) b.3.1每一個循環(huán)包括9fC下解鏈1分鐘 b.3.2 36t:下引物附著模板脫氧核糖核酸1分鐘 b.3.3 72t:下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的延伸2分鐘 b.3.4最后一個循環(huán)是72t:下延伸10分鐘后； b.4將擴增產(chǎn)物在4t:下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳 b.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2% b.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升 b.4.3電泳的電壓為110伏 b.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時； b.5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。 i.依據(jù)獲得的葡萄抗黑痘病基因標記1354堿基對序列，人工合成的寡聚核苷酸
5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'作引物，進行PCR擴增，其具體步驟如下 i.l采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) i丄1混合液體積為25微升 i丄2含有IOXPCR緩沖液2.5微升 i丄3氯化鎂1.5毫摩爾/升 i丄4 dNTP 200微摩爾/升 i丄5 Taq DNA聚合酶1個單位 i丄6人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3' 1微升(10毫摩
爾/升) i丄7 45毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA); i.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液 i.2.1 PCR儀為Eppendorf-AG22331型 i.2.2聚合酶鏈反應(yīng)94t:下解鏈5分鐘； i.3進行40個循環(huán) i.3.1每一個循環(huán)包括9fC下解鏈30秒 i.3.2 50.rC下引物附著模板脫氧核糖核酸30秒 i.3.3 72t:下脫氧核糖核酸(DNA)聚 鏈的延伸1分鐘 i.3.4最后一個循環(huán)是72t:下延伸5分鐘后； i.4將擴增產(chǎn)物在4t:下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳 i.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2% i.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升
i.4.3電泳的電壓為110伏 i.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時； i.5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。 用該特定的基因標記OPS03-1354序列，可以檢測葡萄抗黑痘病基因的存在與 否，以加速育種進程和提高抗黑痘病育種的準確性；進一步以O(shè)PS03-1354的序列為基 礎(chǔ)，人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'作引物進行PCR擴增， 能在抗黑痘病葡萄材料中擴增出1110堿基對的的脫氧核糖核酸(DNA)片段，也具有檢測 葡萄抗黑痘病基因存在與表達的功能。
本發(fā)明具有如下用途 1.本發(fā)明獲得的分子標記OPS03-1354的脫氧核糖核酸(DNA)序列，用途在于
(1)用于葡萄抗黑痘病育種的早期篩選鑒定的DNA分子依據(jù)； [OO74] (2)用作脫氧核糖核酸(DNA)探針； [OO75](3)用作核糖核酸(RNA)探針； [OO76](4)用于分子標記連鎖遺傳作圖； (5)用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中合成寡聚核苷酸的模板； (6)用作抗黑痘病葡萄品種和株系的脫氧核酸核酸(DNA)指紋。 2.本發(fā)明在分子標記OPS03-1354脫氧核糖核酸(DNA)序列基礎(chǔ)上，人工合成的
寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'，用途在于 (1)用作檢測葡萄抗黑痘病性狀或抗黑痘病基因的探針； (2)用作引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，在葡萄抗黑痘病育種的幼苗期， 擴增出1110堿基對的脫氧核糖核酸(DNA)片段即為檢測到抗黑痘病基因，作為抗黑痘病 雜種的早期鑒定與篩選的分子依據(jù)。 本發(fā)明的葡萄抗黑痘病基因分子標記為葡萄雜交育種提供了幼苗期鑒定的DNA 依據(jù)，將會加速抗黑痘病育種的進程和提高育種效率，為快速選育抗黑痘病葡萄新品 種，進一步克隆抗黑痘病基因和基因轉(zhuǎn)移提供了方法和物質(zhì)基礎(chǔ)，也為葡萄抗黑痘病的 遺傳規(guī)律研究和分子標記連鎖遺傳作圖提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明檢測葡萄抗黑痘病基因的 脫氧核糖核酸(DNA)的序列和人工合成的寡聚核苷酸序列，從根本上解決和加速了葡萄 抗黑痘病育種進程。 本發(fā)明對以下葡萄品種或株系具有檢測抗黑痘病基因的功效 (1)西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源葡萄種間雜交組合白河-35-lX佳利釀的親本
及其F工代25株、^代207株；種間雜交組合廣西-lX京可晶的親本及其F工代339株雜
種群體。 (2)世界栽培葡萄品種佳利釀、五月紫、小白玫瑰、雷司令、先索、白玉霓、白
詩南、玫瑰香、大粒紅無核、京可晶、黑玫瑰、法國蘭、紅臉無核、粉紅玫瑰、紅地球等。 (3)原產(chǎn)中國的野生葡萄華東葡萄白河-35-1、白河-35-2、白河-13、白
河-13-1、廣西-1、廣西-2、商南-1、商南-2、湖南-l;剌葡萄雪峰、福建-4、塘尾；
秋葡萄平利-2、江西-2、留壩-1、平利-7;毛葡萄丹鳳-2、泰山-12、 83-4-96、商
南-24;復(fù)葉葡萄留壩-9、甘肅-91、蘗奧葡萄泰山-l;燕山葡萄燕山-l;秦嶺葡萄平利-5 ;桑葉葡萄渭南-3 ;菱葉葡萄菱葉(早)；山葡萄通化-3、左山-2、
黑龍江實生等。
(4)原產(chǎn)北美洲的野生葡萄甜冬葡萄、美洲葡萄、加州葡萄G0ldHil說l、沙地
葡萄A.De Serres、河岸葡萄、山平氏葡萄、圓葉葡萄Alachua和Conquister。
以下為基因標記為1354堿基對的序列 5 ' CAGAGGTCCC TAGCTAATAG ATGTTTCCTT TGTTGTGCTG AAGAAGAGTA GATTGATCAT ATTCTAATCC ATTGTACCAA GGCTAAGGTT TTGTGGGAGT TATTATTTGC TCTTTTTGGT GTAACATGGG TCCTCCCATT GTCGGTTAGA GAGACCCTTG GTTGGCATGG TTCTTTGTGG GCAAGAAGTA TAAAAAGACG TGGATGACAA CTCCCTTATG TCTCTTTTGG ATGGTTTTGG AAGGAAGAAA ATAGGATTGC CTTTGATAAT GATGAACTTT TGATTCAAAA GATGAAAAAT TCTTTTATTT GTAATTTTCG GTCTTGGACT AAGTTATTTA TAGCTAAAGG ACCTTTACCT TTAATCAATT TTTTTTTTTT TATTGGTTGG GTTCTAGATG AGGGTGGGTA AGTTTTTTAT TTCCCTTGTT CTTTTTTGCT CTTGCCTTTA GGCGTCTATT GTATATTCCT TGTATGCTTT GGGTTGGCCT TTGGGTGCCT CATTGTGTAA ACTATCTTTT TGTGCTTCTA CCTATCAATA TATATATTGC AATTATGATA ACAAGGGCAT TTTTGACTTG GTGGTAGATGCTTTATATTT TTCAATTTGG TGATGAACTA GGATATGGCA TGATGAAGCG TGCACCCATG TGCGTGTATT GGATATTGGC ATGGAGGATA AAACTGAAGA AATTGGGAAA ACTCCAAAAT ATCGGAGAAT CTCAAAGATA AATCCGATAA AGTTGAGAAA AATCTTGGGA TCAAAATTTC CTCTTGAATA TTGCATTGGA TCCCACCGAA ACATGATTTT TTGCTGATAT ATCGACAATA AATCTTGACA TTTTTGTCCT TGGTGGTGGG TACAATAGGG CTGGGCATCA ATTGGCTTTT AATGTTAGGG CTCCATTAGT GGTTTTAGAC AAGTTGAAGT GGGAGAGCCA CAATTGTCTT CTTGTGGTCC TAACCATCTT CCTATGCTTT GACTAGGCTG GTGCTTTATG AAGCCCTATT CCATTGCTTT CATTATAGGG AAGTTGAATG CTTGTATTTG AAGGATGGAA CTAACTTTCC CTCCCATTTT GGACTTTGAG TCCTTAGTCC TGAGGAGTTG GGTGATTGTG GTTCACGGTG CTGATGTATG CCTATGACAC ATTCATCTTC TACGAGAAAG GGTGATGGGG GGTGCTTTCA TTGTAAGGAA GTTGAATATG AAGTAGTTGG AACCAATTTT GTCTCCTAGT TTGGATGTTG ATTTCCTAGT ACCAATGAGT TAGGTAATTG TGGTTCATAG TGCTCATATA CGCTTTTGGT TCATTCCTCT TCTTTCTAGG GAGGGTGATG AGTGGGGACC TCTG 3; 以下為基因標記為1110堿基對的序列 5 ' CTAGCTAATA GATGTTTCCT TTGTTGTGCT GAAGAAGAGT AGATTGATCA TATTCTAATC CATTGTACCA AGGCTAAGGT TTTGTGGGAG TTATTATTTG CTCTTTTTGG TGTAACATGG GTCCTCCCAT TGTCGGTTAG AGAGACCCTT GGTTGGCATG GTTCTTTGTG GGCAAGAAGT ATAAAAAGAC GTGGATGACA ACTCCCTTAT GTCTCTTTTG GATGGTTTTG GAAGGAAGAA
10AATAGGATTG CCTTTGATAA TGATGAACTT TTGATTCAAA AGATGAAAAA TTCTTTTATT TGTAATTTTC GGTCTTGGAC TAAGTTATTT ATAGCTAAAG GACCTTTACC TTTAATCAAT TTTTTTTTTT TTATTGGTTG GGTTCTAGAT GAGGGTGGGT AAGTTTTTTA TTTCCCTTGT TCTTTTTTGC TCTTGCCTTT AGGCGTCTAT TGTATATTCC TTGTATGCTTTGGGTTGGCC TTTGGGTGCC
AACAAGGGCA TTTTTGACTT GGTGGTAGAT GCTTTATATT TTTCAATTTG GTGATGAACT AGGATATGGC ATGATGAAGC GTGCACCCAT GTGCGTGTAT TGGATATTGG CATGGAGGAT AAAACTGAAG AAATTGGGAA AACTCCAAAA TATCGGAGAA TCTCAAAGAT AAATCCGATA AAGTTGAGAA AAATCTTGGG ATCAAAATTT CCTCTTGAAT ATTGCATTGG ATCCCACCGA AACATGATTT TTTGCTGATA TATCGACAAT AAATCTTGAC ATTTTTGTCC TTGGTGGTGG GTACAATAGG GCTGGGCATC AATTGGCTTT TAATGTTAGG GCTCCATTAG TGGTTTTAGA CAAGTTGAAG TGGGAGAGCC ACAATTGTCT TCTTGTGGTC CTAACCATCT TCCTATGCTT TGACTAGGCT GGTGCTTTAT GAAGCCCTAT TCCATTGCTT TCATTATAGG GAAGTTGAAT GCTTGTATTT GAAGGATGGA ACTAACTTTC CCTCCCATTT TGGACTTTGA GTCCTTAGTC CTGAGGAGTT GGGTGATTGT 3'
1權(quán)利要求
一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，其特征是采用以下技術(shù)操作步驟進行1.a以葡萄抗黑痘病育種的種間雜交組合白河-35-1×佳利釀的雙親、F1代及F2代為試材，提取、分離、純化脫氧核糖核酸(DNA)1.b采用隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)技術(shù)，用Operon公司的隨機引物196個，分別進行脫氧核糖核酸(DNA)的擴增，其中序列為5’CAGAGGTCCC 3’的隨機引物OPS03可以擴增區(qū)分抗黑痘病與感黑痘病的雜種、親本，獲得了大小約為1300對堿基的脫氧核糖核酸(DNA)片段，該DNA片段是與葡萄抗黑痘病基因相連鎖的分子標記；1.c用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取純化該脫氧核糖核酸(DNA)片段；1.d以pGEM-T載體連接脫氧核糖核酸片段，4℃下保持16小時；1.e轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA，并于37℃水浴中2小時進行酶切；1.f將鑒定為陽性克隆的菌液測定該DNA片段的堿基構(gòu)成及其序列；1.g獲得了該脫氧核糖核酸(DNA)片段的實際大小為1354堿基對的全部堿基組成及其序列，即獲得了基因標記為1354堿基對的全部堿基組成及其序列；1.h進一步依據(jù)1354堿基對的全部堿基組成及其序列；1.i人工合成4個寡聚核苷酸，其中的1個寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′可用作引物；1.j對原雜交組合雙親及其F1代、F2代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡萄，以及雜交組合廣西-1×京可晶的親本及其F1代的脫氧核糖核酸(DNA)作模板進行PCR擴增；1.k獲得特異性脫氧核糖核酸(DNA)片段；1.l用上述方法回收、克隆、測序該DNA片斷；1.m獲得該特異性脫氧核糖核酸(DNA)序列大小為1110堿基對，即獲得了基因標記為1110堿基對的序列；1.n人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′用作引物，對原雜交組合雙親及其F1代、F2代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡萄，以及雜交組合廣西-1×京可晶的親本及其F1代的抗黑痘病性狀可以檢測出來，并以1110對堿基的脫氧核糖核酸(DNA)片段表現(xiàn)了擁有葡萄抗黑痘病性狀和抗黑痘病基因；1.o確定人工合成的寡聚核苷酸5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′作為檢測葡萄抗黑痘病基因的DNA探針。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，其特征是用脫 氧核糖核酸(DNA)作模板進行RAPD擴增的具體步驟為2.b.l采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 2.b丄l混合液體積為25微升 2.b丄2含有10XPCR緩沖液2.5微升 2.b丄3氯化鎂1.5毫摩爾/升 2.b丄4dNTP 200微摩爾/升 2.b丄5Taq DNA聚合酶1個單位2.b丄6序列為5' CAGAGGTCCC 3'的隨機引物OPS031微升2.b丄745毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA);2.b.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液2.b.2.1PCR儀為Eppendorf-AG22331型2.b.2.2聚合酶鏈反應(yīng)9fC下解鏈5分鐘；2.b.3進行45個循環(huán)2.b.3.1每一個循環(huán)包括94t:下解鏈1分鐘 2.b.3.236t:下引物附著模板脫氧核糖核酸1分鐘 2.b.3.372t:下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的延伸2分鐘2.b.3.4最后一個循環(huán)是72t:下延伸10分鐘后； 2.b.4將擴增產(chǎn)物在4t:下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳 2.b.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2% 2.b.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升 2.b.4.3電泳的電壓為110伏 2.b.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時；2. b.5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，其特 征是依據(jù)獲得的葡萄抗黑痘病基因標記1354堿基對序列，人工合成的寡聚核苷酸 5' ACAATCACCCAACTCCTC 3'作引物，進行PCR擴增的具體步驟如下3丄1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 3.U.1混合液體積為25微升 3.U.2含有10XPCR緩沖液2.5微升 3.U.3氯化鎂1.5毫摩爾/升 3丄1.4dNTP 200微摩爾/升 3丄1.5Taq DNA聚合酶1個單位3丄1.6人工合成的寡聚核苷酸5' ACAATCACCCAACTCCTC 3' 1微升(10毫摩爾/升)3丄1.745毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA); 3丄2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液 3丄2.1PCR儀為Eppendorf-AG22331型 3丄2.2聚合酶鏈反應(yīng)94t:下解鏈5分鐘； 3丄3進行40個循環(huán)3丄3.1每一個循環(huán)包括94t:下解鏈30秒3丄3.250.rC下引物附著模板脫氧核糖核酸30秒3丄3.372t:下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的延伸1分鐘3丄3.4最后一個循環(huán)是72t:下延伸5分鐘后；3丄4將擴增產(chǎn)物在4t:下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳3丄4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2%3丄4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升3．i．4．3電泳的電壓為110伏3．i．4．4用水平板電泳槽電泳l—1．5小時；3．i．5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，其特征是獲得了基因標記為1354堿基對的序列為5 ’ CAGAGGTCCC TAGCTAATAG ATGTTTCCTT TGTTGTGCTGAAGAAGAGTA GATTGATCAT ATTCTAATCC ATTGTACCAA GGCTAAGGTTTTGTGGGAGT TATTATTTGC TCTTTTTGGT GTAACATGGG TCCTCCCATTGTCGGTTAGA GAGACCCTTG GTTGGCATGG TTCTTTGTGG GCAAGAAGTATAAAAAGACG TGGATGACAA CTCCCTTATG TCTCTTTTGG ATGGTTTTGGAAGGAAGAAA ATAGGATTGC CTTTGATAAT GATGAACTTT TGATTCAAAAGATGAAAAAT TCTTTTATTT GTAATTTTCG GTCTTGGACT AAGTTATTTATAGCTAAAGG ACCTTTACCT TTAATCAATT TTTTTTTTTT TATTGGTTGGGTTCTAGATGAGGGTGGGTA AGTTTTTTAT TTCCCTTGTT CTTTTTTGCTCTTGCCTTTA GGCGTCTATT GTATATTCCT TGTATGCTTT GGGTTGGCCTTTGGGTGCCT CATTGTGTAA ACTATCTTTT TGTGCTTCTA CCTATCAATATATATATTGC AATTATGATA ACAAGGGCAT TTTTGACTTG GTGGTAGATGCTTTATATTT TTCAATTTGG TGATGAACTA GGATATGGCA TGATGAAGCGTGCACCCATG TGCGTGTATT GGATATTGGC ATGGAGGATA AAACTGAAGAAATTGGGAAA ACTCCAAAAT ATCGGAGAAT CTCAAAGATA AATCCGATAAAGTTGAGAAA AATCTTGGGA TCAAAATTTC CTCTTGAATA TTGCATTGGATCCCACCGAA ACATGATTTT TTGCTGATAT ATCGACAATA AATCTTGACATTTTTGTCCT TGGTGGTGGG TACAATAGGG CTGGGCATCA ATTGGCTTTTAATGTTAGGG CTCCATTAGT GGTTTTAGAC AAGTTGAAGT GGGAGAGCCACAATTGTCTT CTTGTGGTCC TAACCATCTT CCTATGCTTT GACTAGGCTGGTGCTTTATG AAGCCCTATT CCATTGCTTT CATTATAGGG AAGTTGAATGCTTGTATTTG AAGGATGGAA CTAACTTTCC CTCCCATTTT GGACTTTGAGTCCTTAGTCC TGAGGAGTTG GGTGATTGTG GTTCACGGTG CTGATGTATGCCTATGACAC ATTCATCTTC TACGAGAAAG GGTGATGGGG GGTGCTTTCATTGTAAGGAA GTTGAATATG AAGTAGTTGG AACCAATTTT GTCTCCTAGTTTGGATGTTG ATTTCCTAGT ACCAATGAGT TAGGTAATTG TGGTTCATAGTGCTCATATA CGCTTTTGGT TCATTCCTCT TCTTTCTAGG GAGGGTGATGAGTGGGGACC TCTG3’
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，其特征是獲得基因標記為1110堿基對的序列為5 ’ C TAGCTAATAG ATGTTTCCTT TGTTGTGCTG AAGAAGAGTAGATTGATCAT ATTCTAATCC ATTGTACCAA GGCTAAGGTT TTGTGGGAGTTATTATTTGC TCTTTTTGGT GTAACATGGG TCCTCCCATT GTCGGTTAGAGAGACCCTTGGTTGGCATGG TTCTTTGTGG GCAAGAAGTA TAAAAAGACGTGGATGACAA CTCCCTTATG TCTCTTTTGG ATGGTTTTGG AAGGAAGAAAATAGGATTGC CTTTGATAAT GATGAACTTT TGATTCAAAA GATGAAAAATTCTTTTATTT GTAATTTTCG GTCTTGGACT AAGTTATTTA TAGCTAAAGGACCTTTACCT TTAATCAATT TTTTTTTTTT TATTGGTTGG GTTCTAGATGAGGGTGGGTA AGTTTTTTAT TTCCCTTGTT CTTTTTTGCT CTTGCCTTTAGGCGTCTATT GTATATTCCT TGTATGCTTT GGGTTGGCCT TTGGGTGCCTACAAGGGCAT TTTTGACTTG GTGGTAGATG CTTTATATTT TTCAATTTGGTGATGAACTA GGATATGGCA TGATGAAGCG TGCACCCATG TGCGTGTATTGGATATTGGC ATGGAGGATA AAACTGAAGA AATTGGGAAA ACTCCAAAATATCGGAGAAT CTCAAAGATA AATCCGATAA AGTTGAGAAA AATCTTGGGATCAAAATTTC CTCTTGAATA TTGCATTGGA TCCCACCGAA ACATGATTTTTTGCTGATAT ATCGACAATA AATCTTGACA TTTTTGTCCT TGGTGGTGGGTACAATAGGG CTGGGCATCA ATTGGCTTTT AATGTTAGGG CTCCATTAGTGGTTTTAGAC AAGTTGAAGT GGGAGAGCCA CAATTGTCTT CTTGTGGTCCTAACCATCTT CCTATGCTTT GACTAGGCTG GTGCTTTATG AAGCCCTATTCCATTGCTTT CATTATAGGG AAGTTGAATG CTTGTATTTG AAGGATGGAACTAACTTTCC CTCCCATTTT GGACTTTGAG TCCTTAGTCC TGAGGAGTTGGGTGATTGT3'
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測葡萄抗黑痘病基因的分子標記方法，是以種間雜交組合白河-35-1×佳利釀的雙親及F1代、F2代為試材，用隨機引物OPS03進行擴增，獲得約1300對堿基的脫氧核糖核酸片段，對該片段用pGEM-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，克隆該片段。經(jīng)測序，該片段為1365對堿基。按照該序列，人工合成的一個寡聚核苷酸能檢測親本、雜種、歐洲葡萄及野生葡萄抗黑痘病基因的存在與抗黑痘病性狀的表達，用作檢測葡萄抗黑痘病基因的探針。本發(fā)明的分子標記可用作葡萄抗黑痘病育種的早期篩選鑒定；其堿基序列為研究葡萄抗黑痘病基因提供了依據(jù)；人工合成的寡聚核苷酸序列具檢測葡萄抗黑痘病基因存在與表達的功能。
文檔編號C12N15/11GK101691604SQ20091002371
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者張劍俠, 王躍進 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)