專利名稱：一種用pcr鑒定刀鱭和鳳鱭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種定性刀鱭和鳳鱭的準確檢測方法,具體地說是利用分子生物學技術(shù) 對鱭屬刀鱭、鳳鱭物種的定性的檢測方法。自20世紀60年代，線粒體DNA (mtDNA)得到證實以來，目前很多種動物的mtDNA 的全序列已經(jīng)全部測定。mtDNA為細胞核外遺傳物質(zhì)，以母系單性遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、在世代遺 傳中不發(fā)生重組、進化速度快為特點。mtDNA在種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài) 性,線粒體DNA因其種屬特異性強,在分子進化中有許多獨特的優(yōu)越性,是研究動物種間進 化、進行種屬鑒定、特異的遺傳標記，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在分子分類學等領(lǐng)域。發(fā)明人根據(jù)mtDNA的基本特性，設(shè)計出特異的引物，利用分子分類學方法找到刀 鱭和鳳鱭mtDNA上的種屬特異性片段，從而定性檢測鱭屬魚類中的刀鱭和鳳鱭。與其他分 子生物學方法相比，這種方法具有其優(yōu)越性,在水產(chǎn)捕撈魚種鑒定,法醫(yī)學鑒定以及食品檢 測等方面都可以應(yīng)用。本研究方法方便、快捷、可靠,可以快速檢測大量個體,結(jié)果穩(wěn)定性 好，重現(xiàn)性高，填補了目前國內(nèi)將分子生物學標準用于鱭屬魚類物種鑒別方面的空白。本專利尋找出一種新的可以快速可靠的將鱭屬魚類中不同發(fā)育時期的刀鱭(包 括太湖湖鱭、短頜鱭))、鳳鱭進行鑒定的分子標記。結(jié)果，在部分測序基礎(chǔ)上，本研究篩選出 了利用控制區(qū)D-loop序列和cytochrome b基因序列設(shè)計的兩對引物(P1F/P1R、P2F/P2R) 通過一次PCR,瓊脂糖凝膠電泳顯示特征條帶的有無，即可將從形態(tài)學上鑒定出的刀鱭(包 括太湖湖鱭、短頌鱭))、鳳鱭進行鑒定。與其他分子生物學方法相比，這種方法具有其優(yōu)越性，在水產(chǎn)捕撈魚種鑒定，法醫(yī) 學鑒定以及食品檢測等方面都可以應(yīng)用。本研究方法方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量 個體，結(jié)果穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性高，填補了目前國內(nèi)將分子生物學標準用于鱭屬魚類物種鑒別 方面的空白。本發(fā)明的目的是為了公布一種基于分子分類學基礎(chǔ)上刀鱭和鳳鱭魚苗定性的檢 測方法。其檢測方法為1、DKA 的提取取鱭屬魚類的刀鱭(包括太湖湖鱭、短頌鱭)及鳳鱭背部肌肉取約200mg裝入 1. 5ml的Eppendorf管中，總DNA提取用苯酚-氯仿法，參照分子克隆第三版(J.薩姆布魯 克，D.W.拉塞爾)。2、DNA樣品濃度的測定DNA樣品的濃度通過核酸蛋白分析儀(型號:Eppendorf AG 22331 Hamburg)和電 泳-EB染色的熒光強度雙重測定。3、引物設(shè)計
根據(jù)Genbank公布鱭屬魚類線粒體DNA序列，經(jīng)同源性比對后,利用Primer 5. 0 軟件輔助設(shè)計引物。3.1擴增引物(1)刀鱭(包括太湖湖鱭及短頌鱭)擴增引物名稱及序列P1F :5’ -CACATCGCCCGAGGACTA-3，P1R 5，-ACTCCTGCAATGACGAATG-3，刀鱭(包括太湖湖鱭及短頌鱭)擴增片段長度約1220bp(2)鳳鱭擴增引物名稱及序列P2F 5' -gccatatactctccttggtgaca-3，P2R :5，-gtaggcttgggaatagtacga-3’鳳鱭擴增片段長度約280bp4、PCR 反應(yīng)4. 1P1F/P1R PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件總反應(yīng)體系為30ul，其中含 DNA 模板 lul (lOOng)，dNTPs 2ul (各 2. 5mM)，10 XPCR 緩沖液3ul,外部正反向引物各lul (10uM)，Taq DNA聚合酶0. 2ul (1U)，無菌超純水補足至 30ul。擴增反應(yīng)條件為:94°C 5min,94°C 40s,5(TC 35s,72°C 60s,共 30 個循環(huán)，最后 72°C 延伸8min。4. 2P2F/P2R PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件總反應(yīng)體系為30ul，其中含 DNA 模板 lul (lOOng)，dNTPs 2ul (各 2. 5mM)，10 XPCR 緩沖液2. 5ul,外部正反向引物各lul (lOuM)，Taq DNA聚合酶0. 2ul (1U)，無菌超純水補足 至 30ul。擴增反應(yīng)條件為:94°C 5min，94°C 30s，45°C 30s，72°C 30s,共 30 個循環(huán)，最后 72°C 延伸8min。5、擴增產(chǎn)物鑒定PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠濃度為1%，加入終濃度為0. 5ug/ml的 溴化乙錠。電泳緩沖液為0. 5XTBE,以DL2000DNA Marker作為DNA分子量標準。電泳條件 為lOV/cm電壓，電泳lh后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。PCR結(jié)束后根據(jù)記錄結(jié)果直接分析。6、結(jié)果6. 1DNA 提取分別利用-20°C凍存的刀鱭(包括湖鱭和短頜鱭)、鳳鱭肌肉，抽提獲得總DNA。核 酸蛋白分析儀測量所提取DNA樣品的0D260/0D280的值不小于1. 5,并進行電泳檢測后，根 據(jù)測得的濃度將DNA樣品濃度稀釋到50ng/ul,4°C保存。再以稀釋的DNA為模板進行PCR 擴增。6. 2引物P1F/P1R特異性擴增分析以刀鱭(包括湖鱭和短頌鱭)、鳳鱭DNA為模板，分別用兩對引物對線粒體基因進 行擴增，結(jié)果只有刀鱭(包括湖鱭和短頜鱭)、鳳鱭擴增出1220bp左右的片段,鳳鱭無條帶， 引物P1F/P1R的擴增結(jié)果見

圖1。6. 3引物P2F/P2R特異性擴增分析以刀鱭(包括湖鱭和短頜鱭)、鳳鱭DNA為模板，分別用兩對引物對線粒體基因進行擴增,結(jié)果只有鳳鱭擴增出280bp左右的片段,其他魚類無條帶，引物P2F/P2R的擴增結(jié) 果見圖2。6. 4擴大樣本量驗證引物P1 刀鱭類群(包括刀鱭40、湖鱭10、短頌鱭16)出現(xiàn)1200bp左右的特征條 帶,刀鱭66尾,其中57尾有特征條帶，即出現(xiàn)率86.4%。鳳鱭24尾，24尾全無條帶，即出現(xiàn)率為0 % ；引物p2 刀鱭類群(包括刀鱭36、湖鱭10、短頜鱭16) 62尾，有52尾未出現(xiàn)280bp
左右o
權(quán)利要求
PCR鑒定刀鱭和鳳鱭的方法，其特征在于用苯酚-氯仿法提取總DNA，進行巢式PCR擴增種特異性DNA序列基因，最后電泳鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述方法，其特征為根據(jù)刀鱭與鳳鱭線粒體DNA控制區(qū)(D-Ioop) 和細胞色素b (Cytochrome b)基因的保守序列，設(shè)計出兩對特異引物，制定了便捷的鑒別 刀鱭與鳳鱭的PCR反應(yīng)體系。特異性引物具體如下P1F 5 ’ -cacatcgcccgaggacta-3，， PlR 5 , -actcctgcaatgacgaatg-3 :P2F 5 , -gccatatactctccttggtgaca_3P2R 5' -gtaggcttgggaatagtacga-3‘
3.一種鑒定刀鱭和鳳鱭的PCR方法，其特征在于它含有本發(fā)明的特異性引物和PCR反 應(yīng)體系。
4.一種檢測產(chǎn)品中刀鱭和鳳鱭成分來源的方法,其特征在于該檢測方法是基于權(quán)利要 求書2和/或權(quán)利要求書3的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性鑒別刀鱭與鳳鱭的PCR技術(shù)。根據(jù)刀鱭與鳳鱭線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)和細胞色素b(Cytochrome b)基因的保守序列，設(shè)計出兩對特異引物，制定了便捷的鑒別刀鱭與鳳鱭的PCR反應(yīng)體系。提取魚肌肉DNA進行PCR擴增，取擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測，如P1F/R引物對擴增產(chǎn)物存在1220bp DNA條帶，P2F/R引物對無擴增，則確定所檢鱭魚為刀鱭；如P1F/R引物對無擴增，P2F/R引物對產(chǎn)物存在280bp DNA條帶，則可確定為鳳鱭。本方法為形態(tài)學上無法鑒別的不同發(fā)育時期刀鱭與鳳鱭的定性檢測提供了快速、可靠的分子生物學鑒定技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK101864476SQ20091003077
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者丁淑燕, 潘建林, 竇紅霞, 葛家春, 許志強, 黃亞紅 申請人:江蘇省淡水水產(chǎn)研究所;南京大學