專利名稱：快速鑒定梨自花結(jié)實性植株的分子標(biāo)記法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了早期鑒定梨自花結(jié)實性植株的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域， 建立了高效、簡捷、快速的鑒定梨品種后代中自花結(jié)實性株系的技術(shù)體系，用于果樹自 花結(jié)實性品種(株系)的鑒定、育種親本的選擇及授粉品種的配置等。
二背景技術(shù)：
梨是我國乃至世界主要水果之一，我國現(xiàn)有栽培面積108.74萬公頃(2007年中國 農(nóng)業(yè)年鑒的數(shù)據(jù))。梨是典型的配子體型自交不親和性(自花不結(jié)實性)果樹，在生產(chǎn) 中必須合理配置授粉樹或進行人工輔助授粉，才有可能獲得應(yīng)有的產(chǎn)量，也常常因授粉 樹配置不當(dāng)、花期不良?xì)庀髼l件影響昆蟲傳粉或人工授粉不及時等原因造成減產(chǎn)。如果 自花授粉能結(jié)實的話，就能避免或減少因坐果率低而減產(chǎn)的問題，尤其是對于保護地栽 培的果樹來說更為重要。為此，許多果樹工作者孜孜以求，尋找良策，以擺脫自花不結(jié) 實性在果樹生產(chǎn)上的負(fù)面影響。而且有一些國家，如日本、美國、加拿大等已把選育自 花結(jié)實性品種作為梨、蘋果、甜櫻桃等果樹的育種目標(biāo)之一。通過研究揭示果樹自花不 結(jié)實性與自花結(jié)實性突變的機理，采取相應(yīng)技術(shù)手段，創(chuàng)新自花結(jié)實性種質(zhì)，逐步培育 出綜合經(jīng)濟性狀優(yōu)良的梨、蘋果等果樹的自花結(jié)實性品種。梨品種"奧嗄二十世紀(jì)"(S 基因型為S2S4sm)為"二十世紀(jì)"(S基因型為S2S4)的自花結(jié)實性芽變品種，由于其 S4單元型表現(xiàn)為雌蕊自花不結(jié)實性功能喪失(style-part mutant, SM)，但花粉功能正 常(吳華清，齊永杰，張紹鈴.'奧嗄二十世紀(jì)'梨自交親和性分子機制及遺傳特性研 究[J ].園藝學(xué)報，2008， 35 (8) : 1109 -1116)。"奧嗄二十世紀(jì)"已經(jīng)被用于自花結(jié) 實性品種的種質(zhì)創(chuàng)新，日本已經(jīng)培育出自花結(jié)實性品種"秋榮"(S4smS5)。正是由于自 花結(jié)實性品種在栽培上有著良好應(yīng)用前景，所以尋找一種快速準(zhǔn)確標(biāo)記自花結(jié)實性后代 株系(品種等)的方法顯得尤為重要。
三、
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求
本發(fā)明的目的是提供了早期鑒定梨自花結(jié)實性株系的分子標(biāo)記方法。通過擴增后 代基因組的DNA，從而可以建立了快速準(zhǔn)確鑒定突變品種后代中自花結(jié)實性株系的技術(shù) 體系，加快了選育自花結(jié)實性梨品種的進程。
技術(shù)方案
快速鑒定梨自花結(jié)實性株系的分子標(biāo)記方法，其特征在于-用梨自花結(jié)實性S/"-i 7Va^基因特異正反向引物
3S4sm F: 5 ， -TCGTCTTAGGGATTTCC AATGC-3' S4sm R: 5 ， -GCCTTAAGGGTTC ATTGGGC-3'
擴增自花結(jié)實性品種'奧嗄二十世紀(jì)'與其他品種雜交的后代基因組DNA或^奧嗄二十 世紀(jì)'自花授粉的后代基因組DNA，若能擴增出666bp片段的，表明該植株中含有自花 結(jié)實S/ i iVa^基因，除基因型為&S/"的植株外，均表現(xiàn)自花結(jié)實。 用梨自花結(jié)實性&-i A^^特異反向引物 PR4 5'-TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3' 擴增用上述的分子標(biāo)記方法鑒定出的含自花結(jié)實S/w-i iVaw基因植株的基因組DNA，若 能擴增出若能擴增出一條333bp的條帶，表明該植株中含有&^她^基因，該植株基因 型為&S/"，表現(xiàn)自花不結(jié)實。 有益效果
本發(fā)明所提供的早期鑒定梨自花結(jié)實性株系的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點
(1) 本發(fā)明的分子標(biāo)記鑒定方法簡便、快速。用于鑒別果樹自花結(jié)實的傳統(tǒng)方法是 通過自花授粉后坐果率的調(diào)査。這一方法周期長，需要花費很多勞力，而且常因授粉樹 配置不當(dāng)、花期不良?xì)庀髼l件影響結(jié)果。本標(biāo)記的鑒定只涉及基因組DNA的PCR擴增，
可以在幼苗期進行，不受環(huán)境條件的影響，并可在短時間內(nèi)進行大量樣品的檢測，節(jié)約 生產(chǎn)成本。
(2) 本發(fā)明的分子標(biāo)記檢測準(zhǔn)確性高。該標(biāo)記與控制花粉自花不結(jié)實基因的遺傳距 離為0，沒有遺傳重組，檢測的準(zhǔn)確性為100%。
(3) 本發(fā)明能大大加快自花結(jié)實性梨品種的選育進度，具有良好的應(yīng)用價值，可在 品種選育的早期鑒定上直接應(yīng)用。
四

圖l通用引物和特異引物分別擴增OA， XSJ，以及OAXXSJ21株后代
圖2通用引物和特異引物分別擴增OA， F，以及OAXF45株后代
A:通用引物擴增結(jié)果 B: S4""-RNase特異引物擴增結(jié)果
C:S4-RNase特異引物擴增結(jié)果 SC:自花結(jié)實 SI:自花不結(jié)實
OA:'奧嗄二十世紀(jì)，(S2S4sm) XSJ:'新世紀(jì)，(S3S4) F:'豐水，(S3S5)
五具體實施例方式
(一)實驗方法 1.篩選標(biāo)記引物的過程如下 (1)梨通用引物的設(shè)計
根據(jù)梨S-i Atoe基因的保守序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計通用正反向通用PF 5'-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3' PR 5'-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3'
(2) S/，i Atee特異引物的設(shè)計
通過梨S4和S4sm單元型的比較，可以發(fā)現(xiàn)S4sm單元型較S4單元型存在一個236 kb 片段的缺失，在缺失的區(qū)域中，包括了 &-7 ]\^^基因的缺失，但控制花粉的S基因正常， 故設(shè)計&，i M^基因特異正反向引物，以方便鑒定&，i Atoe基因的存在。用引物
S4sm F 5'-TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3'
S4sm R 5，-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3， 擴增自花結(jié)實性品種'奧嗄二十世紀(jì)'雜交授粉后代基因組的DNA，若能擴增出666 bp 的片段，則標(biāo)志著植株中含有自花結(jié)實S/"-i iV"w基因。除基因型為5VS7"的植株外， 均表現(xiàn)自花結(jié)實。
(3) 基因型為&S/"的植株的鑒定(&-^ ^0^特異反向引物的設(shè)計) 對于基因型為&S/"的植株，雖然含有S/w-i iVaw，但其&花粉功能正常，故表型
依然為自花授粉不結(jié)實，所以需根據(jù)5V-i iV"^基因的序列設(shè)計特異反向引物PR4，用 PF和PR4這套引物鑒定出含有&-i iV"w基因的植株。若能擴增出一條333bp的條帶， 則可以方便鑒定出植株中有&-7 JVo^基因的存在 PR4 5'-TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3'
(4) 供試組合共2個(均為生產(chǎn)上常用品種)'奧嗄二十世紀(jì)'X '新世紀(jì)'(S3S4) 的雜交后代21株；'奧嗄二十世紀(jì)'X '豐水'(S3S5)的雜交后代45株；共66個株系。
(5) CTAB法(張妤艷，黃紹西，張紹鈴，等.京白梨等品種S基因型鑒定及新基因&8、 S3o的核苷酸序列分析[J].園藝學(xué)報，2006， 33 (3): 496- 500)提取各后代株系幼葉的 基因組DNA。
(6) 用梨通用引物PF、 PR和設(shè)計的特異引物S4smF、 S4smR分別對后代基因組DNA 進行擴增。
(7) 利用設(shè)計的引物對基因組DNA進行擴增
反應(yīng)體系總體積均為25nL: 10XPCR Buffer 2.5|nL3.0mMMgCl2， 0.2mMdNTP，各 引物0.1[aM，20-50ng模板，Taq酶l.OU ;
通用引物和S4-RNase特異引物PCR所用程序為94。C預(yù)變性2min,94°C 15s， 48 。C30s, 72。C3min,10個循環(huán)后，94。C變性15S, 48。C退火30S, 72。C3.5min， 25個循環(huán)后 72"C延伸7min;
S/"-iWa化基因的特異引物PCR所用程序為9fC預(yù)變性2min，94'C， 15s， 65°C， 30s, 72。C3min，10個循環(huán)后，94。C變性15S, 65。C退火30S, 72°C， 3.5min， 25個循環(huán)后 72r延伸7min;
應(yīng)用PTC-200擴增儀(BIO-RAD)進行擴增；(8)反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5^1，用1.5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳45 分鐘，檢測PCR產(chǎn)物。EB染色，在紫外燈下觀測，拍照。
(二)結(jié)果與分析-
通用引物PF和PR不能擴增出S/"-i A^w基因，特異引物S4^F和S/mR若能擴 增出666bp的片段，則標(biāo)志著植株中含有S/"-i A^^基因的存在，表現(xiàn)為自花授粉能結(jié)
實，但S4S4^"的植株除外，仍然自花授粉不結(jié)實。
1. 從圖l中可以看出，21株OA X XSJ后代中，S2S3: S2S4: S4S4sm: S3S4sm=5: 7:
4: 5^1: 1: 1: 1，符合基因分離規(guī)律。用S/" F/S/"R和PF/PR4這兩套引物均能擴增
出條帶的植株即為&5"/"的植株，表現(xiàn)自花不結(jié)實。
2. 從圖2中可以看出，45株OAXF后代中，用S4sm-RNaSe特異引物可以擴增出21株
自花結(jié)實后代，SC: SI=21: 24"1: 1，符合基因分離規(guī)律。序列表
〈110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
快速鑒定梨自花結(jié)實性植株的分子標(biāo)記法 說明書
00
2009-6-03 5
Patentln version 3. 1
1
22 DNA
人工合成
梨自花結(jié)實性-必Vase基因特異正向引物S4" F (l).. (22)
〈120> 〈130> <140> 〈141> <歸 <170> 〈210> 〈211〉 〈212〉 <213> <220> <221〉 〈222〉 <223〉 〈400> 1
tcgtcttagg gatttccaat gc 22
<210> 2
<211> 20
〈212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221〉梨自花結(jié)實性S4"-RNase基因特異反向引物S4s" R 〈222〉 (1).. (20) 〈223〉 〈400〉 2
gccttaaggg ttcattgggc 20
<210〉 3
<211> 22
<212> DNA
<213>人工合成
〈220>
〈221>通用正向通用引物PF <222> (1)..(22) 〈223〉 〈400〉 3
gttgtttacg gttcacggtt tg 22
<210> 4
<211> 22
<212> 腿
<213>人工合成
<220>
〈221>通用反向通用引物PR 〈222〉 (l)..咖 <223〉 <400> 4
cttttggcac ttgarttttg gt 22 210> 5
<211> <212> <213> 〈220〉 <221> <222> 〈223> 〈400>
21 腿
人工合成
特異反向引物PR4 (l).. (21)
5
tcccagaagc ctacatgatc g 21
權(quán)利要求
1.快速鑒定梨自花結(jié)實性株系的分子標(biāo)記方法，其特征在于用梨自花結(jié)實性S4sm-RNase基因特異正反向引物S4smF5’-TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’S4smR5’-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’擴增自花結(jié)實性品種‘奧嗄二十世紀(jì)’與其他品種雜交的后代基因組DNA，若能擴增出666bp片段的，表明該植株中含有自花結(jié)實S4sm-RNase基因，除基因型為S4S4sm的植株外，均表現(xiàn)自花結(jié)實。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記方法，其特征在于用梨自花結(jié)實性5V-i iV"w特異正反向引物 PF 5'-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG隱3' PR4 5'陽TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3'擴增權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記方法鑒定出的含S/"-及iVa^基因植株的基因組DNA，若 能擴增出一條333bp的條帶，表明該植株中含有基因，該植株基因型為&S/W， 表現(xiàn)自花不結(jié)實。
全文摘要
本發(fā)明提供了早期快速鑒定梨自花結(jié)實性株系的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。通過設(shè)計的梨自花結(jié)實性S₄^sm-RNase基因特異正反向引物S₄^smF與S₄^sm R分別對自花結(jié)實性品種‘奧嗄二十世紀(jì)’的雜交授粉后代基因組DNA的進行擴增，凡是能擴增得到666bp特異條帶的梨植株，表明該植株中含有S₄^sm-RNase基因，就是自花結(jié)實性株系。本發(fā)明標(biāo)記的鑒定方法簡便快捷，只涉及基因組DNA的PCR擴增，提高了自花結(jié)實性基因型的檢測效率?？稍谥仓甑挠酌缙谶M行，并不受環(huán)境條件的影響，在短時間內(nèi)可進行大量群體后代的檢測，節(jié)約生產(chǎn)成本，縮短育種進程，具有良好的應(yīng)用價值和產(chǎn)業(yè)化前景。
文檔編號C12Q1/68GK101565748SQ20091003289
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日 公開號200910032896.0
發(fā)明者俊 吳, 吳華清, 張紹鈴, 肖家欣, 陶書田, 齊開杰, 齊永杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)