專利名稱：表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖化酶，系統(tǒng)名為a-l， 4-葡聚糖葡萄糖水解酶(a-l， 4-glucan-glucohydrolase)， 又名葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),是一種外切型糖苷酶。它能夠從淀粉、糖原或寡 聚麥芽糖的非還原性末端釋放a-D-葡萄糖。糖化酶的底物專一性較低，除了能從非還 原性末端依次水解a-l， 4-糖苷鍵，還口丄以水解a-l， 6-糖苷鍵，因此能將支鏈淀粉全 部水解成葡萄糖。此外，糖化酶還能微弱水解a-l， 3-連接的碳鏈，它一般都能將淀粉 百分百地水解生成葡萄糖。因此糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精、葡萄糖漿的主要酶 類。
現(xiàn)國(guó)內(nèi)外葡萄糖生產(chǎn)大多采用酶法，酶法制糖工藝一般采用兩步法。第一步用a-淀粉酶將淀粉水解成低分子量的糊精，稱為液化；第二步用糖化酶將糊精水解成葡萄 糖，稱為糖化。濃度較高的淀粉液糊化時(shí)，必須迅速液化，否則淀粉液粘度上升使設(shè) 備無(wú)法運(yùn)行，己糊化的淀粉在溫度降低后會(huì)發(fā)生老化而無(wú)法液化，目前制糖工藝廣泛 采用噴射液化，噴射溫度一般在'105 108t;，現(xiàn)在使用的a-淀粉酶主要為來(lái)源于地衣 芽孢桿菌的耐高溫a-淀粉酶，最適作用溫度90。C以上，最適pH為5.5 7.0。但是糖 化酶的最適作用溫度、pH等均與淀粉酶不同，因此需要調(diào)整溫度和pH后才能進(jìn)入糖 化過(guò)程。
糖化酶在微生物中的分布很廣，屬于糖苷水解15 (GH15)蛋白質(zhì)家族，至今已 有近40個(gè)來(lái)源于絲狀真菌、酵母菌、真細(xì)菌和古菌的開放閱讀框被劃分到此家族。 冃前我國(guó)常用的是黑曲霉的糖化酶，最適pH4.5，最適溫度6(TC，因此液化完成后， 需將液化淀粉冷卻至55 60。C， pH調(diào)至4.5 5.0后，加入適量的糖化酶。保持糖化 48h左右，糊精就基本上轉(zhuǎn)化成葡萄糖。有時(shí)為了縮短糖化時(shí)間，在糖化過(guò)程中，常 常采用高溫(88-100°C)，這就要求有耐高溫的酶系來(lái)參與糖化作用。
目前，已從許多微生物中分離出多種類型的耐高溫的糖化酶，有關(guān)糖化酶的熱穩(wěn) 定性報(bào)告很多。Zeikus等發(fā)現(xiàn)Clostridium thermohydro-sulfuricum糖化酶在50%的淀粉 溶液中，7(TC下酶完全穩(wěn)定，而且在10%酒精液中仍很穩(wěn)定，即使在85'C下處理lh 其酶活性仍保持50%，而且這種酶不受Ca2、 EDTA和a-， p-， ？環(huán)狀糊精的影響。 Tomoko. TAKAHASHI等報(bào)道來(lái)自于A.saitoi的糖化酶GLUMI在50°C以上仍保持其
3全部活性，但該酶的活性易受Hg^的抑制。陳冠軍等報(bào)道從黑曲霉As 3.4809變異株 B-ll發(fā)酵液中獲得的3種類型糖化酶GI,Gn,GIII，其最適溫度均為70°C。 a-環(huán)狀糊精 在60'C下可使糖化酶的熱穩(wěn)定性提高。 一般糖化酶都具有較窄的pH值適應(yīng)范圍，但 最適pH —般為4.5 6.5。 Tomoko. TAKAHASHI等報(bào)道來(lái)自于A. saitoi的糖化酶 GLUMI其最適pH范圍為2.5 7.5，最適pH為4.5。 Hyun H H等曾報(bào)道A.niger產(chǎn)生 的糖化酶pH值穩(wěn)定范圍為2 11 。 Mi-Sun Kim等報(bào)道來(lái)自于sulfolobus solfataricus 的糖化酶基因在大腸桿菌中表達(dá)后重組蛋白的最適溫度為9CTC，最適pH5.5 6.0。 Bjarne Ronfeldt Nielsen等發(fā)現(xiàn)在酵母中表達(dá)的重組Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶 的T1/2在7(TC下約為110分鐘。
硫磺礦硫化葉菌( //o/oZn TO//aton'c^)屬于泉古菌中的極端嗜熱菌，首次分離 于意大利的一個(gè)硫磺礦熱泉中，形態(tài)為球狀，有葉狀分裂，嗜熱嗜酸，最佳生長(zhǎng)溫度 為8(TC，最適pH值為3.0，兼性自養(yǎng)，可以硫磺或其他簡(jiǎn)單有機(jī)物為養(yǎng)分。作為研究 古菌的模式菌，sulfolobus solfataricus P2的基因組全序列測(cè)定于2001年已經(jīng)全部完成， 其基因組為2， 992， 245bp，編碼2977個(gè)蛋白。這些蛋白有二分之一是硫磺礦硫化葉 菌所特有，40%是古菌所特有，12%與細(xì)菌有同源性，2%與真菌有同源性。
絲狀真菌作為轉(zhuǎn)化的宿主菌，有許多其他微生物如細(xì)菌、酵母等不可比擬的優(yōu)點(diǎn) 1)絲狀真菌具有很強(qiáng)的分泌胞外蛋白的能力，而細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白往往以無(wú)活性 的、難溶的包含體形式存在；2)當(dāng)細(xì)菌表達(dá)外源真核基因時(shí)，因其翻譯和轉(zhuǎn)錄不同 于真核生物，因此即便真核基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌，也有可能不表達(dá)，但絲狀真菌不存在類似 的情況；3)絲狀真菌能對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工，包括肽鏈的剪切和糖基 化等翻譯后加工；4)絲狀真菌具有像細(xì)菌一樣的快速繁殖能力和短的生活周期，比 動(dòng)植物的細(xì)胞培養(yǎng)要簡(jiǎn)單；5)許多絲狀真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergilluoryzae)等長(zhǎng)期被用在食品工業(yè)，被公認(rèn)是安全的；6)絲狀真菌具有成 熟的發(fā)酵工藝和后處理工藝。由此可以看出，絲狀真菌是一個(gè)具有吸引力的異源基因 表達(dá)系統(tǒng)。尤其是今年來(lái)，隨著絲狀真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多絲狀真菌被應(yīng)用 到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中，生產(chǎn)出了許多真菌或非真菌來(lái)源的重組蛋白，如葡糖淀 粉酶(glucoamylase)、牛凝乳酶原(bovine chymosin)、人體乳鐵蛋白(human lact2 oferrin)、雞蛋清溶菌酶(hen egg隱white lysozyme)禾口人體白細(xì)胞介素6 (human interleukin-6)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌，是將黑曲霉"^e^7/w "/ge。的糖化酶基因滅活，并將表達(dá)硫磺礦硫化葉菌(w//o/o^Wo// to^^)的糖化酶基因的表達(dá) 盒插入到黑曲霉(A/^rg///^m'ger)的基因組中，篩選得到表達(dá)嗜熱糖化酶的重組工 程菌；所述黑曲霉(J5perg/〃M m'ger)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number 為AY250996的5'端1052-4252位核苷酸序列；所述硫磺礦硫化葉菌(^//o/oZms ra/y^fln'cM)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number為AE006718.1的5'端第 6228-8096位核苷酸序列。
所述表達(dá)硫磺礦硫化葉菌( />/0^s50//aton'cM)的糖化酶基因的表達(dá)盒中還含 有乙酰氨酶基因；所述乙酰氨酶基因具有自GENBANK號(hào)為AM270228.1的的5'端第 31228-33207位核苷酸序列。
上述將黑曲霉(J^e^///^ "&er)的糖化酶基因滅活可通過(guò)基因突變、基因轉(zhuǎn)換(Gene Conversion)、基因破壞(gene desmption)、同源重組等技術(shù)實(shí)現(xiàn)。具體可利用基因敲除的 方法將所述黑曲霉(A^ew///Mmger)的糖化酶基因用潮霉素基因替換；隨后潮霉素 基因又被表達(dá)硫磺礦硫化葉菌的嗜熱糖化酶基因和乙酰胺酶基因的表達(dá)盒替換。
所述黑曲霉(^spergz7/w"/ger)可為黑曲霉"乎erg/〃M m'ger)菌株CICC 2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)。
所述表達(dá)嗜熱糖化酶的專用工程菌優(yōu)選為黑曲霉(A^wg!7/M m'gw) WW1 CGMCCNo.2841。
所述黑曲霉U印wg〃/wm^er) WW1 CGMCCNo.2841，已于2008年12月25 閂保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為 中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2841。
所述黑曲霉(A^erg/〃us m'ge。 WW1 CGMCCNo. 2841在查氏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 為菌落初白色，后變褶皺狀。生長(zhǎng)最適溫度3(TC。
所述黑曲霉C4spe/^7/^"fgw)WWl CGMCC No. 2841最適培養(yǎng)基為査氏培養(yǎng)基； 培養(yǎng)溫度為30 33'C，所表達(dá)糖化酶最適溫度為卯"，最適pH值6.0。
上述工程菌可用于生產(chǎn)嗜熱糖化酶，具體方法是將上述的表達(dá)嗜扭糖化酶的專用 工程菌發(fā)酵得到嗜熱糖化酶。
本發(fā)明的表達(dá)嗜熱糖化酶的專用工程菌，去掉黑曲霉本身的糖化酶a-l,4和a-l,6
葡萄糖苷鍵水解活性，代替以硫磺礦硫化葉菌(^//0/0^5SO的加/C附)糖化酶基因，
使黑曲霉表達(dá)硫磺礦硫化葉菌( //o/o^s >/>tor/Cz^)糖化酶，表達(dá)的糖化酶最適溫 度為卯'C的糖化酶，其最適pH范圍也提高至6.0，表達(dá)量達(dá)到3000U/ml發(fā)酵液(lh 水解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖的酶量，即為一個(gè)酶活力單位)，從而實(shí)現(xiàn)耐熱性能 好且最適pH值提高的糖化效率高的糖化酶在絲狀真菌中的表達(dá)，降低了生產(chǎn)成本，
5并且增加了表達(dá)的糖化酶的安全性。
本發(fā)明表達(dá)嗜熱糖化酶的專用丄程菌用潮霉素置換黑曲霉的糖化酶，隨后潮霉素 基因又被硫磺礦硫化葉菌的嗜熱糖化酶基因及乙酰胺酶基因替換；可在只含有乙酰胺 為碳源供給的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這樣方便了工程菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選和純化，并且不會(huì) 引入過(guò)多的抗生素標(biāo)簽，更提高了本發(fā)明的工程菌的安全性。
本發(fā)明的方法利用上述工程菌發(fā)酵生產(chǎn)嗜熱糖化酶，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)的糖化酶 容易分離和純化等特點(diǎn)。該工程菌生產(chǎn)的嗜熱糖化酶，表達(dá)量高達(dá)3000U/ml發(fā)酵液， 具有較高的最適溫度與最適pH，二者都與目前工業(yè)常用的來(lái)源于地衣芽孢桿菌的耐高 溫淀粉酶相近，如使用該重組酶用于酒精工業(yè)在糖化工藝時(shí)可以不用降溫，節(jié)省了能 源。


圖1為黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除載體pEasy-glaAdir的構(gòu)建過(guò)程. 圖2為pWW的結(jié)構(gòu)示意圖 圖3為重組糖化酶的最適pH檢測(cè)結(jié)果 圖4為重組糖化酶的最適溫度檢測(cè)結(jié)果 圖5為重組糖化酶的熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
本發(fā)明中"葡萄糖化酶"定義葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,EC.3.2丄3)，又稱 ，淀粉酶，簡(jiǎn)稱糖化酶，糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。 糖化酶的主要作用是水解淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的ot-D-1,4葡萄糖苷鍵和a-D-1，6 葡萄糖苷鍵。將葡萄糖一個(gè)一個(gè)水解下來(lái)，而得到終產(chǎn)物卩-D-葡萄糖。糖化酶也能微 弱的水解a-D-1,3葡萄糖苷鍵，但水解a-D-1，4葡萄糖苷鍵的速度最快。
實(shí)施例l、可表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌的構(gòu)建
一、黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204) 的glaA基因敲除工程菌的構(gòu)建
1、黑曲霉糖化酶(glaA)基因5'側(cè)翼序列及3'側(cè)翼序列的克隆
根據(jù)NCBI上公布的糖化酶基因(具有GENBANK Accession Number為 AM270061.1的5'端第94354—92183位核苷酸序列)及其上下游序列設(shè)計(jì)引物
glaA的5'端側(cè)翼序列的引物
G1A5，F(xiàn)R1，F(xiàn): 5' -CAAGTATATGATGCGGTAGTGG-3'; G1A5，F(xiàn)R1，R: 5' - TGCTGAGGTGTAATGATGCTGG-3'。
6glaA的3'端側(cè)翼序列的引物加Xhol及Apal酶切位點(diǎn) Hyg-GlA3 ，F(xiàn)R3 'F: 5 ，-CTCGAGACAATCAATCCATTTCGCTAT-3' Hyg-G1A3，F(xiàn)R3，R: 5，-GGGCCCTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3' 以黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204) 的基因組DNA作為模板，分別以G1A5'FR1，F(xiàn)及G1A5'FR1，R序列為引物； Hyg-G1A3'FR3'F及Hyg-G1A3'FR3'R序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到糖化酶5'側(cè)翼序 列，3'側(cè)翼序列。
上述PCR擴(kuò)增條件均為預(yù)變性94。C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94。C， 30秒、退火56t:， 1分鐘、延伸72。C， 2分，72°C，延伸10分鐘。
上述glaA的5'端側(cè)翼序列的引物(G1A5'FR1，F(xiàn)及G1A5，F(xiàn)R1，R) PCR擴(kuò)增得到 1.5kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序表明該產(chǎn)物即為glaA的5'端側(cè)翼片段(自GENBANK號(hào)為 AM270061.1的5'端第95854-94355位核苷酸)，將該片段命名為glaA5' FR。
上述引物對(duì)Hyg-G1A3，F(xiàn)R3，F(xiàn)及Hyg-G1A3，F(xiàn)R3，R PCR擴(kuò)增得到約1.5kb產(chǎn)物，經(jīng) 測(cè)序表明該擴(kuò)增片段為glaA的3'端側(cè)翼片段，將其命名為glaA3' FR，該產(chǎn)物具有自 GENBANK號(hào)為AM270061.1的5'端第92182-卯683位核苷酸。
2、黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除載體的構(gòu)建
根據(jù)質(zhì)粒pSecTag2/Hygro A (購(gòu)自invitrogen公司)上潮霉素表達(dá)框序列設(shè)計(jì)以 下引物
Hyg序列弓I物兩端加Notl酶切位點(diǎn)
GlA5 ，F(xiàn)R-Hyg2，F(xiàn): 5' -GCGGCCGCGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3' GlA5，F(xiàn)R-Hyg2，R: 5，陽(yáng)GCGGCCGCGCTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3， 以G1A5'FR-Hyg2，F(xiàn)和Gl八5，F(xiàn)R-Hyg2'R為引物，以質(zhì)粒pSecTag2/Hygro A (購(gòu) 自irwitrogen公司)為模板，擴(kuò)增潮霉素基因表達(dá)框。
擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94。C， 30秒、退火 56°C， l分鐘、延伸72'C， 2分，72°C,延伸10分鐘。
PCR擴(kuò)增得到約l.Okb片段，經(jīng)測(cè)序表明其核苷酸序列為序列表中序列1，為潮 霉素基因，將其命名為HYG。
將上述擴(kuò)增得到的1.5kbglaA5' FR克隆到T載體pEasy-Tl (購(gòu)自全式金公司) 上，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確含有1.5kbglaA5' FR的重組載 體命名為pET-5' FR1 。將上述擴(kuò)增得到的l.Okb HYG克隆到T載體pEasy-Tl (購(gòu)自 全式金公司)上，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確含有HYG的重組 載體命名為pET-Hyg。將上述擴(kuò)增得到的1.5kb glaA3' FR克隆到T載體pEasy-Tl(購(gòu)
7自全式金公司)上，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確含有g(shù)laA3' FR 的重組載體命名為pET-3' FR1。
黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除載體的構(gòu)建過(guò)程如圖l所示，將pET-Hyg用Notl 酶切后，回收得到的l.Okb片段，將該片段插入到pET-5' FR1的NotI酶切位點(diǎn)得到 重組載體，進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)驗(yàn)證表明含有Hyg和glaA5' FR片段的重組載 體命名為pET-5' FR1-Hyg。將pET-3 ' FR1用Xhol及Apal酶切，回收1.5kb片段， 插入到pET-5' FR1-Hyg的Xhol和Apal酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，將該重組載 體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)驗(yàn)證表明含有依次連接的glaA5' FR、 Hyg和glaA3' FR片段的重組載體命名為pEasy-glaAdir (圖1)，該載體即為黑曲霉菌株CICC 2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)糖化酶基因敲除載體。
3、黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204) 敲除糖化酶(glaA)基因的菌株668-glaAd'r的構(gòu)建
用HindIII消化10微克的質(zhì)粒pEasy-glaA他，在0.8%的瓊脂糖凝膠上分離線性 DNA，并且通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離出Hindm線性化的pEasy-glaA^質(zhì)粒DNA片段， 膠回收該片段。
將上述分離得到的pEasy-glaAd'r質(zhì)粒線性DNA進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化到黑曲霉菌株 CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)中去。轉(zhuǎn)化方法見 文獻(xiàn)(姚婷婷,王正祥.黑曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化條件.食品與生物技術(shù)學(xué) 報(bào),2006年25巻04期)，具體步驟如下所示
A、 將黑曲霉菌株CICC2204(購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204) 用査氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取包含有培養(yǎng)基的4cn^左右大小的單菌落，和培養(yǎng)基一起 放入內(nèi)含60ml査氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)4天，收集菌絲 體；
B、 用1M山梨醇溶液洗步驟A得到得菌絲體一次，稱取濕重，按照質(zhì)量體積比 為lg: 10ml加酶裂解液，3(TC， 80rpm輕微搖床酶解，血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)原生質(zhì)體的形 成數(shù)量并確定酶解時(shí)間，得到原生質(zhì)體液；
C、 將原生質(zhì)體液過(guò)濾，收集濾液，4T:下3200rpm離心10min，棄上清液，分別 用預(yù)冷的0.6M KC1溶液和S/C溶液洗滌沉淀、離心，原生質(zhì)體沉淀重懸于適量S/C 溶液，使原生質(zhì)體濃度達(dá)到l-3Xl(^個(gè)/ml，置冰浴備用；
D、 取lOOtil步驟C得到的原生質(zhì)體懸液，加入約l-10ug的線性化質(zhì)粒(10ul) pEasy-glaAdk，用槍頭輕輕吹吸混勻，加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分 鐘；
8同時(shí)分別取100ul步驟C得到的原生質(zhì)體，分別加入ddH20 (10ul)，分別用槍 頭輕輕吹吸混勻并加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分鐘；
E、取出后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的與轉(zhuǎn)入ddH20的分別緩緩加入lmlPEG溶液，室溫放置5 分鐘后加入2mlS/C溶液，輕輕顛倒混勻，將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的與轉(zhuǎn)入ddH20的分別鋪在選 擇性平板上(含有200ug/ml潮霉素B的基本培養(yǎng)基)，另外轉(zhuǎn)入ddH20的鋪在對(duì)照 培養(yǎng)基上作為原生質(zhì)體對(duì)照；3(TC培養(yǎng)。
上述步驟中使用的培養(yǎng)基和溶液的配方如下所示
查氏固體培養(yǎng)基含1.6% (質(zhì)量百分含量)的agar，蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)， NaNO30.2% (質(zhì)暈百分含量)，K2HPO40.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 'FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KC10.05% (質(zhì)量百分 含量)，其余為水；pH5.5-6.0的固體培養(yǎng)基
查氏液體培養(yǎng)基含蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)，NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)， K2HPO4 0.P/。(質(zhì)量百分含量)，7H20 *FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 'MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KC10.05% (質(zhì)量百分含量)，其余為水，pH5.5-6.0的液體 土肯養(yǎng)基。
基本培養(yǎng)基含1M蔗糖，K2HP04 0.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 'MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，7H20 FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，KC1 0.05% (質(zhì)量百分 含量)，NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)，1% (質(zhì)量百分含量)的agar， 200ug/ml潮 霉素B，其余為水的固體培養(yǎng)基。
對(duì)照培養(yǎng)基IM蔗糖，NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)，K2HPO40.1% (質(zhì)量百 分含量)，7H20'FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分 含量)，KC10.05% (質(zhì)量百分含量)，1%瓊脂。
酶裂解液1% (質(zhì)量百分含量)蝸牛酶、1% (質(zhì)量百分含量)纖維素酶、0.1% (質(zhì)量百分含量)溶菌酶，用1M的山梨醇溶液配置后，用0.45um孔徑的膜過(guò)濾滅菌。
S/C溶液含1M山梨醇，50mMCaCl2的溶液。
PEG溶液含25% (質(zhì)量百分含量)PEG8000，50mMCaCl2,10mMTris-HCl,pH7.5
的溶液。
30'C培養(yǎng)9-10天后在選擇性平板上均L(出十余個(gè)轉(zhuǎn)化子，作為對(duì)照的原生質(zhì)體在 對(duì)照培養(yǎng)基上長(zhǎng)大，說(shuō)明原生質(zhì)體的消化沒有問題，而在選擇性培養(yǎng)基上未長(zhǎng)出菌落。 挑取選擇性平板上的轉(zhuǎn)化子單菌落，接種在含潮霉素B (200ug/ml)的査氏液體培養(yǎng) 基中，3(TC培養(yǎng)3-4天后，取200ul液體涂布在査氏固體培養(yǎng)基(含潮霉素B 200ug/ml) 上，連續(xù)分離傳代2次，含有潮霉素B抗性基因的轉(zhuǎn)化子存活下來(lái)。根據(jù)glaA的5'端側(cè)翼片段(自GENBANK號(hào)為AM270061.1的5'端第95854-94355位核苷酸)，結(jié) 合其位置及上游序列，設(shè)計(jì)正向驗(yàn)證引物(該引物位于GENBANK號(hào)為AM270061.1 的5'端第96180-96161位核苷酸)，
Up glaA 5 ，F(xiàn)R F: CTATCGTGTTTGTAGCAATG
根據(jù)潮霉素序列，設(shè)計(jì)反向驗(yàn)證引物
InHyg3 'FRR: CTATTTACCCGCAGGACATA
取存活的菌株提取基因組基因，用Up glaA 5'FR F和In Hyg 3 'FR R進(jìn)行擴(kuò)增檢 測(cè)，擴(kuò)增得到2.0kb片段的菌株為PCR檢測(cè)陽(yáng)性的菌株。將PCR檢測(cè)陽(yáng)性的重組菌 株命名為黑曲霉668-glaAdir。
二、表達(dá)硫磺礦硫化葉菌(sulfolobus solfataricus) SSG (SSG是ssg基因表達(dá)的 蛋白質(zhì))的重組工程菌的獲得
1、硫磺礦硫化葉菌( //o/o^1sra//aton'cw)的糖化酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
1) 黑曲霉amdS基因的克隆
根據(jù)NCBI上公布的米曲霉乙酰胺酶基因序列與黑曲霉基因組DNA比對(duì)選取相
似性最大的序列設(shè)計(jì)引物
Acetamidase引物帶ScaI及NotI酶切位點(diǎn)
PgpdA隱amdS 5F: 5'-AGTACTATGGCCCTCACATCCTGGGAAC-3'; amdS-TrpC 5R: 5'-GCGGCCGCTCAAGCACTAGCCTTCTTGAATT-3';
以黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)
的基因組DNA作為模板，以PgpdA-amdS 5F和amdS-TrpC 5R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94'C， 30秒、退火 56°C， l分鐘、延伸72'C， 2分鐘，72°C，延伸10分鐘。
擴(kuò)增得到約1.9kb的DNA片段，回收該片段連接到pEasy-Tl (購(gòu)于全式金公司) 載體后測(cè)序，經(jīng)測(cè)序表明該擴(kuò)增片段即為乙酰胺酶基因(自GENBANK號(hào)為 AM270228.1的5'端第31228-33207位核苷酸序列)，將其命名為amdS，將含有該amdS 片段的重組載體命名為pET-amdS。
將質(zhì)粒pET-amdS用Sea I及Not I雙酶切后得到1.9kb的amdS片段備用。
2) PgpdA片段的獲得
根據(jù)構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動(dòng)子PgpdA序列設(shè)計(jì)引物以構(gòu) 巢曲霉(購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)2288)基因組DNA為模板PCR 擴(kuò)增得到2049bp的PgpdA片段，其序列為自GENEBANK號(hào)為Z32524.1的5'端第138-2186位核苷酸序列，作為amdS的啟動(dòng)子序列。
弓I物分別帶Bgl II及Sea I酶切位點(diǎn)，引物序列如—卜所示 PgpdA-F: AGATCT AGATCTTTCGACACTGAAATAC; PgpdA-R: AGTACT AGTACTTACTTAGGGGAAATAA。
擴(kuò)增得到約2.0kb的片段，回收擴(kuò)增得到的PgpdA片段后連接到pEASY-Tl載體 上經(jīng)測(cè)序表明正確后，用Bgl II及Sea I雙酶切，得到約2.0kb片段，將其命名為PgpdA。
3) TtrpC片段的獲得
根據(jù)構(gòu)巢曲霉色氨酸合成基因trpC的終止子TtrpC序列設(shè)計(jì)引物以構(gòu)巢曲霉(購(gòu)
自工業(yè)微生物齒種保藏管理中心，目錄號(hào)2288)基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增得到
763bp的TtrpC片段，在NCBI的序列自GENEBANK號(hào)為X02390.1的5 '端第
3406-4168位核苷酸序列，該片段作為amdS的終止子。
引物序列如下所示
amdS-TtrpC 6F: 5 '-GCGGCCGC GGATCCACTTAACGTTACTGA-3'; TtrpC-GlA3，F(xiàn)R 6R: 5'-AAGCTT TCGAGTGGAGATGTGGAGTGG-3';
回收擴(kuò)增得到的TtrpC片段后用Notl及HindIII雙酶切該片段，得到0.76kb片段，
經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的片段命名為TtrpC。
4) 帶不同酶切位點(diǎn)的3' FR序列的擴(kuò)增
以載體pET-3' FR1模板，分別設(shè)計(jì)以下兩對(duì)帶不同酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中帶Apal及BglII酶切位點(diǎn)的引物序列為
Ssg陽(yáng)GlA3，F(xiàn)R 3F: 5'-GGGCCCACAATCAATCCATTTCGCTATA-3'; G1A3，F(xiàn)R -PgpdA 3R: 5'-AGATCTTAACTCCGCGGAGGCTCATGG -3'。 帶HindIII及AatII酶切位點(diǎn)引物序列為
TrpC-GlA3，F(xiàn)R 7F: 5'-AAGCTTACAATCAATCCATTTCGCTA-3';
G1A3，F(xiàn)R 7R: 5'-GACGTCTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3'。
擴(kuò)增條件為預(yù)變性94'C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94。C， 30秒、退火
56°C， l分鐘、延伸72。C， 2分鐘，72°C，延伸10分鐘。
擴(kuò)增得到帶有不同酶切位點(diǎn)的1.5kb的3' FR片段。將該擴(kuò)增得到帶有ApaI及 BglII酶切位點(diǎn)的3' FR片段命名為3'flankPl片段；將以上擴(kuò)增得到的帶有HindIII 及AatII酶切位點(diǎn)的3' FR片段命名為3'flank P2片段。
5) 硫磺礦硫化葉菌(w//o/ok ^//aton'ci )的糖化酶基因的克隆
根據(jù)NCBI公布的硫磺礦硫化葉菌P2的ssg基因序列，分析黑曲霉菌株CICC 2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)中糖化酶基因啟動(dòng)子序列，運(yùn) 用融合PCR技術(shù)合成含有黑曲霉菌株CICC 2204(購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心， 目錄號(hào)為2204)中糖化酶5'端序列(自GENBANK號(hào)為AM270061.1的5'端第95854-94355位核苷酸)和硫磺礦硫化葉菌P2的ssg基因序列(具有GENBANK Accession Number為AE006718的5'端第6228 — 8096位核苷酸序列)的片段，將其命
名為5' FR-SSG。其具體獲得方法如下所述
設(shè)計(jì)Overlap PCR引物序列如下，其中，G1A 5'FR 1F帶AatII酶切位點(diǎn)，Ssg2R 帶Apal酶切位點(diǎn)
G1A 5，F(xiàn)R 1F: 5'- GACGTCCAAGTATATGATGCGGTAGTG-3';
GlA5，F(xiàn)R-ssglR:
GlA5,FR-ssg2F:
Ssg2R: 5'-GGGCCCTTATATATGGTTTAAGAGCT-3'。
以pET-5'FRl為模板，以上述序列(G1A5，F(xiàn)R 1F和GlA5'FR-ssglR)為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94'C5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94'C， 30秒、 退火56i:， 1分鐘、延伸72。C， 2分鐘，72°C，延伸10分鐘。得到1.5kb的G1A 5' FR片段。
以嗜熱古菌硫磺礦硫化葉菌P2 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào) 1.23711)基因組DNA為模板，上述GlA5，F(xiàn)R-ssg2F和Ssg2R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94。C， 30秒、退火56'C， l分鐘、延伸72'C， 2分鐘，72°C，延伸10分鐘。PCR得到1.8kb的ssg片段片段。
以上述PCR得到的G1A 5' FR及ssg片段為模板，用引物G1A 5'FR 1F及Ssg2R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94。C 5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94'C， 30秒、退火56'C， l分鐘、延伸72。C， 3分鐘，72°C，延伸10分鐘。
將PCR擴(kuò)增得到的3.3kb片段，即為5' FR-ssg，將5' FR-ssg連接至pEasy-Tl 上經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定正確，命名為pET-5' FR-ssg。經(jīng)測(cè)序表明該P(yáng)CR擴(kuò)增得到的約 3. 3kb片段5' FR-ssg具有序列表中序列2的核苷酸序列，自序列表中序列2的5'端 第1一1500位為上述黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目 錄號(hào)為2204)中糖化酶5'端序列，自序列2的5'端第1501 —3369位為上述硫磺礦 硫化葉菌P2的SSG基因序列。
6)表達(dá)硫磺礦硫化葉菌GwZ/o/o^wo//atoWcw)的糖化酶基因的重組載體的構(gòu)
建
將上述得到的PgpdA片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的amdS片段連接后得到4034bp片段，與 經(jīng)過(guò)湯fl及州mim雙酶切獲得的TtrpC 763p片段連接后得到4797bp片段。該片段與 用々fll和Bg/H雙酶切后的1.5kb的3'flank Pl片段連接后得到6297bp片段，與經(jīng)
12///mini和y^J/酶切后的3'flank P2片段(1510bp)連接后得到7797bp片段。
將pET-5' FR-ssg用J""/及Apal酶切后，與上述得到的7,8kb的片段連接(選 擇二者在ApaI端連接的方式)，得到ll.lkb片段。
將該片段與經(jīng)過(guò)^""/酶切后回收的pGEM-T Vector(購(gòu)自promega)載體片段連接 后得到新的重組表達(dá)載體，將該載體進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的含有上述 ll.lkb片段的重組載體命名為pWW (其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)。
2、重組黑曲霉表達(dá)載體pWW的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選
1)重組黑曲霉表達(dá)載體pWW的轉(zhuǎn)化
重組黑曲霉表達(dá)載體pWW經(jīng)^^//完全酶切線性化后，以步驟一的步驟3)制備 的菌株黑曲霉668-glaAd"為出發(fā)菌株制備原生質(zhì)體，進(jìn)行PEG-原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方 法見文獻(xiàn)(姚婷婷,王正祥.黑曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化條件.食品與生物技術(shù) 學(xué)報(bào),2006年25巻04期)，具體步驟如下所示
A、 將黑曲霉668-glaAd'r用查氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取包含有培養(yǎng)基的4cr^左右 大小的單菌落，和培養(yǎng)基一起放入內(nèi)含60ml査氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)4天，收集菌絲體；
B、 用1M山梨醇溶液洗步驟A得到得菌絲體一次，稱取濕重，按照質(zhì)量體積比 為lg: 10ml加酶裂解液，3CTC， 80rpm輕微搖床酶解，血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)原生質(zhì)體的形 成數(shù)量并確定酶解吋間，得到原生質(zhì)體液；
C、 將原生質(zhì)體液過(guò)濾，收集濾液，4"C下3200rpm離心10min，棄上清液，分別 用預(yù)冷的0.6MKC1溶液和S/C溶液洗滌沉淀、離心，原生質(zhì)體沉淀重懸于適量S/C 溶液，使原生質(zhì)體濃度達(dá)到l-3Xl(^個(gè)/ml，置冰浴備用；
D、 取100ul步驟C得到的原生質(zhì)體懸液，加入約l-10ug的線性化質(zhì)粒(10ul) pWW，用槍頭輕輕吹吸混勻，加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分鐘；
同時(shí)分別取100ul步驟C得到的原生質(zhì)體，分別加入ddH20 (10ul),分別用槍 頭輕輕吹吸混勻并加入50ulPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20分鐘；
E、 取出后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的與轉(zhuǎn)入ddH20的分別緩緩加入lml PEG溶液，室溫放置5 分鐘后加入2mlS/C溶液，輕輕顛倒混勻，將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的與轉(zhuǎn)入ddH20的分別鋪在選 擇平板上(含有10mM乙酰胺和20mMCsCl的基本培養(yǎng)基)，另外轉(zhuǎn)入ddH20的 鋪在對(duì)照培養(yǎng)基上作為原生質(zhì)體對(duì)照；3(TC培養(yǎng)5-6天。
上述步驟中使用的培養(yǎng)基和溶液的配方如下所示
查氏固體培養(yǎng)基含1.6% (質(zhì)量百分含量)的agar,蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)， NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)，K2HPO40.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 'FeS04 0.001%
13(質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，其余為水；pH5.5-6.0的固體培養(yǎng)基。
査氏液休培養(yǎng)基含蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)，NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)，1(211 040.1%(質(zhì)量百分含量)，7H20 'FeSC)4 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 *MgS040.05% (質(zhì)量百分含量)，KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，其余為水，pH5.5-6.0的液體i肯養(yǎng)基。
基本培養(yǎng)基含1M蔗糖，K2HP04 0.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 'FeS04 0.001%(質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，10mM乙酰胺，20mMCsCl和1。/。(質(zhì)量百分含量)瓊脂的固體培養(yǎng)基。
對(duì)照培養(yǎng)基1M蔗糖，NaNO30.2% (質(zhì)量百分含量)，K2HPO40.1% (質(zhì)量百分含量)，7H20 FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)，KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，1%瓊脂。
酶裂解液1% (質(zhì)量百分含量)蝸牛酶、1% (質(zhì)量百分含量)纖維素酶、0.1%(質(zhì)量百分含量)溶菌酶，用1M的山梨醇溶液配置后，用0.45um孔徑的膜過(guò)濾火菌。S/C溶液含1M山梨醇，50mMCaCl2的溶液。
PEG溶液含25% (質(zhì)量百分含量)PEG8000,50mMCaCl2,10mMTris-HCl,pH7.5
的溶液。
2)轉(zhuǎn)化子的篩選
AmdS基因編碼乙酰胺酶基因，該酶能夠作用于乙酰胺，分解乙酰胺為乙酸及銨，作為細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源。該基因在黑曲霉菌株CICC2204 (購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，目錄號(hào)為2204)內(nèi)微弱表達(dá)，同時(shí)內(nèi)源性的乙酰胺酶的微弱表達(dá)可以通過(guò)加入20mMCsCl得到抑制。通過(guò)在只含有乙酰胺為碳源供給的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)從而篩選出發(fā)生同源重組的陽(yáng)性克隆，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)且菌落逐漸增大。黑曲霉菌株CICC 2204原生質(zhì)體在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)作為對(duì)照，對(duì)照能夠長(zhǎng)大說(shuō)明原生質(zhì)體的消化沒有問題，而黑曲霉菌株CICC 2204原生質(zhì)體在選擇性培養(yǎng)基上(含有10mM乙酰胺和20mMCsCl的基本培養(yǎng)基)未長(zhǎng)出或長(zhǎng)出較小的菌落但不能繼續(xù)生長(zhǎng)，在選擇培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的上述得到的轉(zhuǎn)化子即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取步驟l)獲得的轉(zhuǎn)化子，在含有10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本培養(yǎng)基(含1M蔗糖，K2HP04 0.1%(質(zhì)量百分含量)，7H20 'FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 ,8040.05% (質(zhì)量百分含量)，KC10.05°/。(質(zhì)量百分含量)，10mM乙酰胺，20mM CsCl和1% (質(zhì)量百分含量)瓊脂的固體培養(yǎng)基)，3CTC培養(yǎng)篩選2次，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
為了將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，根據(jù)glaA的5'端側(cè)翼片段(自GENBANK號(hào)為
14AM270061.1的5'端第95854-94355位核苷酸)，結(jié)合其位置及上游序列，設(shè)計(jì)正向驗(yàn) 證引物(該引物位于GENBANK號(hào)為AM270061.1的5'端第96180-96161位核苷酸)， Up glaA 5'FR F: 5'- CTATCGTGTTTGTAGCAATG-3' 根據(jù)硫磺礦硫化葉菌的糖化酶基因(具有GENBANK Accession Number為 AE006718的5'端第6228 — 8096位核苷酸序列)合成反向驗(yàn)證引物， In SsgR: 5'-CTATATATAATACAGTAGTTTC-3'
提取菌株黑曲霉668-glaAdir及轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，進(jìn)行PCR分子鑒定，用引 物Up glaA 5'FR F和In Ssg R進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增得到2047bp片段的菌株為PCR檢 測(cè)陽(yáng)性的菌株，結(jié)果篩選得到PCR檢測(cè)陽(yáng)性的正確的轉(zhuǎn)pWW菌株。而對(duì)照菌未擴(kuò)增 到目的條帶。
3)轉(zhuǎn)化子嗜熱糖化酶酶活測(cè)定
分別挑取上述轉(zhuǎn)化子的單克隆包含有培養(yǎng)基的4cr^左右大小的單菌落，和培養(yǎng)基 起放入分別轉(zhuǎn)接至裝有100ml搖瓶培養(yǎng)基(豆餅粉2% (質(zhì)量百分含量)，玉米漿 2% (質(zhì)量百分含量)，玉米淀粉12% (質(zhì)量百分含量)，其余為水)的500ml三角瓶 中，同時(shí)取原始菌菌株黑曲霉668-glaAdir作為對(duì)照，3(TC下?lián)u培4天，取發(fā)酵液上清 液分別測(cè)試糖化酶活性。
嗜熱糖化酶酶活測(cè)定方法如下所述
分別吸取lml發(fā)酵液上清液，移入容量瓶中，分別用緩沖液稀釋至10ml刻度， 100ml刻度，1000ml刻度(稀釋程度根據(jù)酶活的高低而定，濃度越高，稀釋倍數(shù)應(yīng)越 大)充分搖勻，作為樣品待測(cè)。制備待測(cè)酶液時(shí)，樣液濃度應(yīng)控制在滴定空白和樣品 時(shí)消耗0.05mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的差值在4.5ml 5.5ml，范圍內(nèi)(酶活力約 為120U/ml 150U/ml)。
取A、B兩支50ml比色管，分別加入25ml 20g/L可溶性淀粉溶液和5ml 0.05mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH6.0)，搖勻。于80±0. 2。C的恒溫水浴中預(yù)熱5min 10min。 在B管中加入2.0ml上述待測(cè)液，搖勻，立即記時(shí)。在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min后， 立即向A、 B兩管中各加0.2ml 200g/L氫氧化鈉溶液，搖勻，同時(shí)將兩管取出，迅速 用水冷卻，并于A管中補(bǔ)加2. Oml上述待測(cè)液(作為空白對(duì)照)。
吸取上述A、B兩管中的反應(yīng)液各5. Oml，分別于兩個(gè)碘量瓶中，準(zhǔn)確加入O.lmol/L 碘標(biāo)準(zhǔn)液(按GB/T601配制與標(biāo)定)10. Oml，再加15ml O.lmol/L氫氧化鈉溶液，邊 加邊搖勻，并于暗處放置15min，取出。用水淋洗瓶蓋，加入2mol/L硫酸溶液2ml， 用0.05mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(按GB/T601配制與標(biāo)定)滴定藍(lán)紫色溶液， 直至剛好無(wú)色為其終點(diǎn)，分別記錄空白和樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(VA、 VB)。
嗜熱糖化酶活力單位1ml酶液或lg酶粉在80°C、 pH6.0的條件下，lh水解可
溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖，即為一個(gè)酶活力單位，符號(hào)為U/ml (或U/g)。
酶活力單位按式(1)計(jì)算 X= (VA-VB) XcX90.05X32.2/5X l/2XnX2=579.9X (VA-VB) cXn...........(1)
式中
X——樣品的酶活力單位，單位為酶活力單位每毫升(U/ml)或酶活力單位每克 (U/.g);
VA——滴定空白時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升(mL); VB——滴定樣品時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升(mL); c——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確濃度，單位為摩爾每升(mol/L); 90.05——葡萄糖的摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾(g/mol); 32.2——反應(yīng)液的總體積，單位為毫升(mL); 5——吸取反應(yīng)液的體積，單位為毫升(mL); 1/2——折算成lmL酶液的量； n——稀釋倍數(shù)；
2——反應(yīng)30min，換算成lh的酶活力系數(shù)。 以樣品測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，修約至三位有效數(shù)字。
結(jié)果的允許差在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩 個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的10%，以大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值10%的情況下不超 過(guò)5%為前提。
結(jié)果表明，原始菌菌株黑曲霉668-glaAdir的嗜熱糖化酶酶活為零，因?yàn)樵季N 不存在硫磺礦硫化葉菌的嗜熱糖化酶基因，而其自身的糖化酶也被敲除。這與我們預(yù) 期的一致。所測(cè)定的IO個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子活力各有不同，其中一個(gè)菌株產(chǎn)生的酶活最高， 酶活為3000U/ml。
將該菌株命名為黑曲霉(^perg///ra"/ger) WW1。該黑曲霉(As^rgz'〃^m'gw) WW1，已于2008年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中 心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京巿朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2841。
上述酶活測(cè)定使用的試劑的配制方法如下所述
0.05mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH6.0):稱取乙酸鈉(CH3COONa'3H20) 6,7g， 用水溶解并定容至1000ml。上述緩沖液的pH值應(yīng)吸取冰乙酸(約0.5ml-lml)使用酸 度計(jì)加以校正。20g/L可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉(2±0.001) g，然后用少量水調(diào)勻，緩 緩傾入已沸騰的水中，煮沸、攪拌直至透明，冷卻，用水定容至100tnl。此溶液需當(dāng) 天配制。
實(shí)施例2、大量制備嗜熱糖化酶
1、 培養(yǎng)基配制
菌種活化培養(yǎng)基蔗糖3.0% (質(zhì)量百分含量)，K2HPO40.1% (質(zhì)量百分含量)， 7H20 FeS04 0.001% (質(zhì)量百分含量)，7H20 MgS04 0.05% (質(zhì)量百分含量)， KCIO.05% (質(zhì)量百分含量)，10mM乙酰胺和20mMCsCl，其余為水，調(diào)節(jié)pH至 5.5-6.0， 121。C滅菌30min。
一級(jí)種子培養(yǎng)基豆餅粉3% (質(zhì)量百分含量)，玉米漿2.5% (質(zhì)量百分含量)， 玉米淀粉15°/。(質(zhì)量百分含量)，高溫淀粉酶(諾維信⑧利可來(lái)耐高溫淀粉酶Supm (Liq腿yme⑧Supm)批號(hào)NBSG4213) 12 U/克玉米淀粉80。C處理30min，聚氧乙烯 聚氧丙烯季戊四醇醚(Polyoxyethylene Polyoxypropylene Pentaerythritol Ether-PPE) 0.05% (質(zhì)量百分含量)，其余為水，121。C滅菌30min。
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉20% (質(zhì)量百分含量)，豆餅粉5% (質(zhì)量百分含量)， 玉米漿3% (質(zhì)量百分含量)，硫銨0.8% (質(zhì)量百分含量)，氯化鈣0.05% (質(zhì)量百 分含量)，高溫淀粉酶(諾維信⑧利可來(lái)耐高溫淀粉酶Supra (Liquozyme Supra) 批號(hào)NBSG4213) 12U/克玉米淀粉80。C處理30min，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚 (Polyoxyethylene Polyoxypropylene Pentaerythritol Ether-PPE) 0.05% (質(zhì)量 百分含量)，其余為水，12rC滅菌30min。
2、 發(fā)酵制備嗜熱糖化酶
種子培養(yǎng)將黑曲霉C^^g///w"fger) WW1接種到菌種活化培養(yǎng)基(查氏培 養(yǎng)基)活化，從平板上挑單菌落，接入到一級(jí)種子培養(yǎng)基(100ml/500ml三角瓶)中， 30°C， 150r/min培養(yǎng)2d，鏡檢并涂平板檢測(cè)是否污染。
高密度發(fā)酵種子在一級(jí)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按體積比為10%的接種量接到裝有 2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，3(TC, 200轉(zhuǎn)/分(發(fā)酵罐為上海保興生物設(shè)備工程 有限公司,型號(hào)BIOTECH-5BG)的攪拌速度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，約16小時(shí)后，開始用質(zhì) 量百分濃度為25。/。的氨水調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液的pH控制在4.2-4.5。通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐 壓和空氣流量，速度使溶氧大于20%，培養(yǎng)120小時(shí)左右。培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣觀察 細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及酶活。酶活測(cè)定方法按照實(shí)施例1的步驟二中步驟2的步驟3)所 述的嗜熱糖化酶活性測(cè)定方法進(jìn)行。結(jié)果表明，黑曲霉WW1 CGMCCNo.2841嗜熱糖化酶酶活為3000U/ml。
17實(shí)施例3、糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
1、 最適pH的檢測(cè)
用工程菌黑曲霉(As/7wgz'〃M"/ger) WW1 CGMCCNo.2841的發(fā)酵上清液進(jìn)一步 、初歩研究重組酶活性與pH的關(guān)系，取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵140h的培養(yǎng)液上清液，改變緩 沖液的pH值(pI12.3 pH7.0)，測(cè)定酶活，酶活測(cè)定其余條件按照實(shí)施例1的歩驟 二中步驟2的步驟3)所述的嗜熱糖化酶活性測(cè)定方法進(jìn)行，將酶活最高者的相對(duì)酶 活定為100%，其余的酶活與最高酶活比值為其相對(duì)酶活。
結(jié)果如圖3所示，由圖3可見重組酶的最適pH為6.0。目前酒精工業(yè)生產(chǎn)中淀粉 液化時(shí)使用的高溫淀粉酶的最適pH值也為pH6.0，如在糖化時(shí)使用該酶可省去調(diào)pH 一步，節(jié)省了成本。
2、 酶反應(yīng)溫度的檢測(cè)
將搖瓶培養(yǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子140h的培養(yǎng)上清液，在不同的反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活，酶活測(cè) 定其余條件按照實(shí)施例1的步驟二中歩驟2的步驟3)所述的嗜熱糖化酶活性測(cè)定方 法進(jìn)行，將酶活最高者的相對(duì)酶活定為100%，其余的酶活與最高酶活比值為其相對(duì)酶活。 結(jié)果如圖4所示，重組酶最適溫度的檢測(cè)結(jié)果表明(圖4):重組酶的最適溫度為9(TC， IO(TC時(shí)仍有活性。其最適溫度與目前工業(yè)常用的來(lái)源于地衣芽孢桿菌的耐高溫淀粉酶相近， 如使用該重組酶用于酒精工業(yè)在糖化工藝時(shí)可以不用降溫，節(jié)省了能源。
3、 酶穩(wěn)定性檢測(cè)
取搖瓶培養(yǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子i40h的培養(yǎng)卜.清液，在6crc、 8crc和io(rc下分別保溫o、
10、 20、 30、 60min，迅速冷卻到室溫，按照實(shí)施例1的步驟二中步驟2的步驟3)所述 的嗜熱糖化酶活性測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定殘余酶的活性，以未保溫的酶液的酶活為100%。其 余的酶活與以未保溫的酶液的酶活的比值為相對(duì)酶活。
重組酶最適溫度的檢測(cè)結(jié)果表明如圖5所示重組酶在8(TC時(shí)，酶活力半衰期在60min 以上；IOO'C酶活降低較快，保溫10min后酶活力仍高于60。/。,保溫60min后殘余酶活力為28%。 從該糖化酶基因上來(lái)看，該酶存在有糖基化位點(diǎn)，而且在該古生菌中存在有糖基化酶，因此 該酶可能存在糖基化。故而更適于在真菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)優(yōu)J七。
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gttacacctttggtatggtctcatgctgaattcataataggctcttaaac3360
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權(quán)利要求
1、表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌，是將黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因滅活，并將表達(dá)硫磺礦硫化葉菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的表達(dá)盒導(dǎo)入到黑曲霉(Aspergillus niger)的基因組中，篩選得到表達(dá)嗜熱糖化酶的重組工程菌；所述黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number為AM270061.1的5′端第94354—92183位核苷酸序列；所述硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number為AE006718的5′端第6228—8096位核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求i所述的工程菌，其特征在于所述表達(dá)硫磺礦硫化葉齒( //0/o6w >//aton'cz )的糖化酶基因的表達(dá)盒中還含有乙酰氨酶基因；所述乙酰氨酶基因具有自GENBANK號(hào)為AM270228.1的的5'端第31228-33207位核苷酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述將黑曲霉(A/^g///M&ger)的糖化酶基因火活的方法是基因敲除的方法。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述可表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌為黑曲霉(A/7ct^'〃w "/gtr) WW1 CGMCCNo.2841。
5、 權(quán)利要求1-4中任意所述的可表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌在生產(chǎn)嗜熱糖化酶中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述生產(chǎn)嗜熱糖化酶的方法，是將權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的工程菌發(fā)酵得到嗜熱糖化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)嗜熱糖化酶的工程菌及其應(yīng)用。該工程菌是是將黑曲霉的糖化酶基因滅活，并將硫磺礦硫化葉菌的糖化酶基因插入到黑曲霉的基因組中，篩選得到表達(dá)嗜熱糖化酶的重組工程菌；黑曲霉的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number為AM270061.1的5′端第92183-94360位核苷酸序列；所述硫磺礦硫化葉菌的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number為AE006718的5′端第6228-8096位核苷酸序列。利用該工程菌株可直接發(fā)酵得到嗜熱糖化酶，表達(dá)量高達(dá)3000U/ml發(fā)酵液，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)的糖化酶容易分離和純化。
文檔編號(hào)C12N9/26GK101503660SQ20091007764
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者楊建國(guó), 兵 汪, 王小娟 申請(qǐng)人:北京中天諾亞體育科技有限公司