獲得嗜熱鏈球菌特異性序列的方法及其使用的半隨機(jī)引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種獲得嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)特異性序列的方法及其使用的半隨機(jī)引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 獲得一種細(xì)菌的特異性序列，往往需要對網(wǎng)上大量的已知序列進(jìn)行分析比對；但 有些細(xì)菌已測的序列較少，分析起來非常困難，難以得到特異性序列。當(dāng)然，也可以收集某 一種細(xì)菌的所有菌株，進(jìn)行測序比對，但該方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長、費(fèi)用較高。目前，在網(wǎng)上可 以獲取的嗜熱鏈球菌已經(jīng)經(jīng)過測序的序列較少，因而難以分析得到嗜熱鏈球菌的特異性序 列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是針對目前通過序列比對獲取嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)的特異性序列較難，且無法從未進(jìn)行全基因組測序的現(xiàn)有 嗜熱鏈球菌菌株直接獲取特異性序列的現(xiàn)狀，而提供一種無需對未測序的嗜熱鏈球菌菌株 進(jìn)行測序而可以很方便地獲取嗜熱鏈球菌的特異性序列的方法及其所使用的半隨機(jī)引物。
[0004] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種半隨機(jī)引物，其序列組成如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明中，所述的半隨機(jī)引物為一種寡核苷酸，用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增以捕獲模板菌 株的基因組DNA片段。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種序列組成如序列表中SEQ ID NO. 1所示的半 隨機(jī)引物在基因擴(kuò)增中的應(yīng)用。
[0008] 所述的基因擴(kuò)增較佳地為單引物PCR擴(kuò)增，即擴(kuò)增體系中只加入一條擴(kuò)增引物進(jìn) 行DNA片段的合成。
[0009] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種獲得嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)特異性序列的方法，其包括如下步驟：
[0010] ⑴以兩株以上的嗜熱鏈球菌菌株的基因組DNA分別為模板，以序列組成如序列 表中SEQ ID NO. 1所示的半隨機(jī)引物為擴(kuò)增引物分別進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增；
[0011] (2)對步驟（1)擴(kuò)增獲得的共有DNA片段進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行序列比 對，若比對的結(jié)果為該共有DNA片段的序列僅與序列已知的嗜熱鏈球菌的基因同源性大于 99%，則將該共有DNA片段的序列作為嗜熱鏈球菌的特異性序列。
[0012] 在本發(fā)明中，步驟（1)中所述的嗜熱鏈球菌可以是已經(jīng)經(jīng)過基因組測序的嗜熱鏈 球菌，也可以是未經(jīng)測序的嗜熱鏈球菌；其中，可以使用未經(jīng)測序的嗜熱鏈球菌的基因組 DNA為模板是本發(fā)明的特別優(yōu)勢之一，因此可以作為優(yōu)選方案。
[0013] 其中，步驟（1)中所述的單引物PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)所指的含義，即擴(kuò)增體系中 只加入一條擴(kuò)增引物進(jìn)行DNA片段的合成。
[0014] 較佳地，步驟（1)中所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括如下組分：0.5? 2. 0 μ mol/L 半隨機(jī)引物，0· 2 ?I. Ommol/L dNTP，I. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02 ?0· IOU/ μ LTaq DNA聚合酶，以及0.5?2. Ong/μ L基因組DNA模板。更佳地，所述的單引物PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括如下組分：11^111〇1凡半隨機(jī)引物，0.51111]1〇1/1^(11'013，1.51111]1〇1凡的1% 2+， 0· 05U/ μ LTaq DNA聚合酶，以及L Ong/ μ L基因組DNA模板。
[0015] 較佳地，步驟（1)中所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：①93-96°C，4-6min ; ② 93-96°C，20-40s ;③ 45-58°C，20-40s ;④ 70-72°C，30-120s ;⑤ 70 ?72°C，5 ?IOmin ; 其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為25-40。更佳地，步驟（1)中所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程 序包括：① 95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ;⑤ 72°C，5min ;其中，步驟 ②至④的循環(huán)數(shù)為35。
[0016] 較佳地，步驟（1)所述的嗜熱鏈球菌菌株的數(shù)量為3-10株，更佳地為4-6株。
[0017] 步驟（2)中，所述的共有DNA片段為本領(lǐng)域常規(guī)所指，即指步驟（1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物中大小相同的DNA片段，如可以將步驟（1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，選擇大小相同的電 泳條帶作為所述的共有DNA片段，用于后續(xù)的測序。
[0018] 步驟（2)中，所述的將測序結(jié)果進(jìn)行序列比對的方法為將測序結(jié)果在公共數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行BLAST，更佳地為將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST。
[0019] 步驟（2)中所述的該共有DNA片段的序列僅與序列已知的嗜熱鏈球菌的基因同 源性大于99%為本領(lǐng)域常規(guī)所指，即在進(jìn)行序列比對時(shí)，該共有DNA片段的序列僅僅與序 列已知的嗜熱鏈球菌的基因同源性大于99%，而與其他的物種的同源性都不高（至少低于 99% )，甚至非常低；其中，序列已知的嗜熱鏈球菌如本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的理解，一般指 已經(jīng)經(jīng)過基因組測序的嗜熱鏈球菌，如本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的理解，各類生物信息學(xué)公共 數(shù)據(jù)庫，如NCBI建立的Genbank等就收集有大量菌株的基因組信息，其中就包括本發(fā)明所 述的序列已知的嗜熱鏈球菌。
[0020] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0021] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明獲得嗜熱鏈球菌特異性序 列的方法操作簡單、快速、特異性強(qiáng)，而且無需知道目標(biāo)細(xì)菌的核酸序列，也無需依賴大量 的基因數(shù)據(jù)分析，僅需要通過對有限幾株基因序列未知的嗜熱鏈球菌進(jìn)行PCR反應(yīng)以及對 所獲得的共有DNA片段進(jìn)行割膠純化測序，即可獲得嗜熱鏈球菌的特異性序列。本發(fā)明的 方法通用性強(qiáng)，成本低，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的篩選結(jié)果。圖中編號(hào) "M" 為 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd. 1-4" 分別 為：Streptococcus thermophilusTA40、Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364的PCR 結(jié)果。
[0024] 圖2為不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結(jié)果。圖中編號(hào)"Μ" 為 DL2,000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian)Co, Ltd. D "1-6" 分別為： Streptococcus thermophiIusCICC20379、 Streptococcus thermophiIusCICC6222、 Streptococcus thermophiIusCICC6072、 Streptococcus thermophiIusCICC20378、 Streptococcus thermophilusCICC20364、Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 結(jié)果。
[0025] 圖3為嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結(jié)果。圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分別 為：Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 結(jié)果〇
[0026] 圖4為嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結(jié)果。圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分別 為：Streptococcus thermophiIusCICC20379λ Streptococcus thermophiIusCICC6222λ Streptococcus thermophiIusCICC6072λ Streptococcus thermophiIusCICC20378λ Streptococcus thermophiIusCICC20364λ Streptococcus thermophiIusCICC20389λ Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 結(jié)果〇
[0027] 圖5為不同半隨機(jī)引物的效果比較。圖中"M"為DL2,000DNA(Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd)，編號(hào) "1-3" 為半隨機(jī)引物 "AP2-AP4" 分別對應(yīng)的 PCR 結(jié) 果，編號(hào)4為半隨機(jī)引物APl對應(yīng)的PCR結(jié)果，編號(hào)5為半隨機(jī)引物AP5對應(yīng)的PCR結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0029] 下述實(shí)施例中，如非特別說明，所用試劑和材料均為常規(guī)市售可得。
[0030] 下述實(shí)施例中，下述實(shí)驗(yàn)材料的來源為：
[0031] 嗜熱鏈球菌：
[0032] Streptococcus thermophiles TA40 購自丹尼斯克有限公司；
[0033] Streptococcus thermophilus St-body 3 購自丹尼斯克有限公司；
[0034] Streptococcus thermophiles CICC20174購自上海北諾生物科技有限公司；
[0035] Streptococcus thermophilus CICC20364購自上海北諾生物科技有限公司；
[0036] Streptococcus thermophiles CICC20379購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0037] Streptococcus thermophiles CICC6222購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0038] Streptococcus thermophiles CICC6072購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0039] Streptococcus thermophiles CICC20378購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0040] Streptococcus thermophiles CICC20364購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0041] Streptococcus thermophiles CICC20389購自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司D
[0042] 實(shí)施例1不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的篩選
[0043] (1)模板制備
[0044] 將各菌株活化分離培養(yǎng)，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養(yǎng)基，37°C 厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，離心獲得菌體。提取細(xì)菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0045] (2) PCR 擴(kuò)增
[0046] PCR擴(kuò)增的體系組成為：1 μπιοΙ/L半隨機(jī)引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 5mm