專利名稱：基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流控芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流 控芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)90年代初微全分析系統(tǒng)(Miniaturized Total Analysis Systems, n-TAS)概念的提 出在分析儀器和生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，引導(dǎo)化學(xué)分析設(shè)備向著微型化、自動(dòng)化、快 速化、集成化與便攜化的趨勢(shì)發(fā)展。以微機(jī)電加工技術(shù)(MicroElectromechanical Systems, MEMS)為基礎(chǔ)，在芯片上制作微泵、微閥、微管道、微電極、微反應(yīng)器、微流量傳感器、 微檢測(cè)器等功能單元構(gòu)成微型化學(xué)系統(tǒng)，把整個(gè)化驗(yàn)室的功能，包括采樣、稀釋、加試劑、 反應(yīng)、分離、檢測(cè)等全化學(xué)過程集成在方寸大小的芯片上來實(shí)現(xiàn)，可稱之謂"芯片上的實(shí)驗(yàn) 室"(LabonaChip，LOC)。微流控芯片具有分析速度快，分離效率高，減少了樣品和試劑 的消耗量，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通量分析，并易與其他檢測(cè)設(shè)備聯(lián)用。
隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，特別是檢測(cè)靈敏度的提高，微流控芯片對(duì)單個(gè)細(xì)胞及胞內(nèi) 的微量物質(zhì)的分析與檢測(cè)日益受到重視。微流控芯片適合于細(xì)胞分析主要是因?yàn)榫哂幸韵聨?個(gè)重要特征第一，微流控芯片的通道尺寸與典型哺乳類細(xì)胞的直徑大小相適應(yīng)，有利于細(xì) 胞的操縱、分析；其次，芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成相對(duì)封閉的環(huán)境，與生理狀態(tài)下細(xì)胞的空 間環(huán)境接近；第三，芯片通道微尺度下傳熱、傳質(zhì)較快，可以提供有利的細(xì)胞研究環(huán)境；第 閃，芯片可以滿足高通量細(xì)胞分析的需要，可同時(shí)獲取大量的生物學(xué)信息；第五，芯片上多 種單元技術(shù)的靈活組合使集成化的細(xì)胞研究成為可能，諸如細(xì)胞進(jìn)樣、培養(yǎng)、分選、裂解和 分離檢測(cè)等過程可集成在一塊芯片上完成。
細(xì)胞分選的常用技術(shù)以流式細(xì)胞儀(flowcytometry)為主，但其設(shè)備昂貴、體積龐大、 需要專業(yè)人士操作，且細(xì)胞用量大，難以在實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用。微流控芯片技術(shù)在 一定程度上克服了上述局限，可以實(shí)現(xiàn)類似儀器的小型化、集成化、自動(dòng)化和便攜化。目前， 以微流控芯片為平臺(tái)的細(xì)胞分選方法主要可分為兩類，其一是根據(jù)所采集信號(hào)的有無或強(qiáng) 變化進(jìn)行分選，其二是根據(jù)細(xì)胞自身的一些差異在不同的驅(qū)動(dòng)力作用下的特征變化進(jìn)行分選。
熒光激發(fā)細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)是微流控芯片細(xì)胞分選中比 較常用的一種方法，其原理與流式細(xì)胞儀類似。首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過檢測(cè) 器時(shí)，根據(jù)激光激發(fā)出的熒光信號(hào)的有無或強(qiáng)弱來控制細(xì)胞的流向。Wolff等設(shè)計(jì)了集成有 功能性結(jié)構(gòu)的微流控芯片，采用熒光激活分選的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了篩選，當(dāng)檢測(cè)到熒光信號(hào) 時(shí)，廢液通道的閥門關(guān)閉，細(xì)胞流入收集池從而達(dá)到了細(xì)胞分離的目的(Wolff A.等,CA*, 2003,3,22-27)。 Schwille等根據(jù)細(xì)胞光學(xué)特性的不同進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選。使用由雜交的 硅樹脂橡膠玻璃芯片組成的微流控支流通道系統(tǒng)使流體混合，然后共軸聚焦到一個(gè)薄的流動(dòng) 層，在這個(gè)薄的流動(dòng)層進(jìn)行熒光激活細(xì)胞檢測(cè)。(Dittrich R S.等，^4""/. Cte附.2003， 75, 5767-5774.)
此外，在微流控芯片上集成微電極，細(xì)胞在不均一交變電場(chǎng)中被誘導(dǎo)極化，由于介電特 性、電導(dǎo)率、形狀或大小等不同，極化程度不同的細(xì)胞或顆粒在電場(chǎng)中受到不同的介電力而 分離。Cheng等通過固定于微流控通道表面的細(xì)胞釋放出離子引起周圍介質(zhì)導(dǎo)電性能的變化 來給細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cheng X.等,CA/p, 2007, 7, 746 - 755)。利用低電導(dǎo)、低滲的介質(zhì)使固定 的細(xì)胞溶解，用表面圖案電極檢測(cè)了阻抗的變化情況，從而量化細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞溶解阻抗 光譜的方法比較敏感，檢測(cè)限能達(dá)到20 cells ^L—1。 Li等設(shè)計(jì)了一個(gè)集成有注射、分離區(qū)域 和兩個(gè)出口的微流控設(shè)備，采用連續(xù)介電電泳的方法分離和純化了懸浮的生物細(xì)胞樣品。在 鞘流和樣品注射口，用水力聚焦的方法將細(xì)胞樣品注射到通道中，在不均勻的電場(chǎng)中形成了 介電電泳區(qū)域來分離細(xì)胞并收集到兩個(gè)樣品池中(Li Y.等，丄W CT 取2007， 7， 239-248)。
除上述方法以外，還有通過微機(jī)械加工技術(shù)，在芯片上刻蝕微米級(jí)的網(wǎng)絡(luò)或通道作為細(xì) 胞過濾器來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分選。Wheeler等在T形通道底部制作了一個(gè)超微隔離室，通過水力 聚焦將細(xì)胞引入兩個(gè)緩沖流之間， 一個(gè)細(xì)胞落入超微室后，由于空間限制其他細(xì)胞不能進(jìn)入， 從而在細(xì)胞懸浮液中迅速分離出單個(gè)細(xì)胞(Wheeler A. R.等，j"a/. Oze附.，2003, 75， 3581-3586)。方肇倫研究組在十字形通道芯片上結(jié)合流體重力和電驅(qū)動(dòng)方法對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 操縱和分析。應(yīng)用流體重力驅(qū)動(dòng)將單個(gè)血紅細(xì)胞引入進(jìn)樣通道，并用電驅(qū)動(dòng)把細(xì)胞引入分離 通道。在分離通道上施加高壓，并使用激光誘導(dǎo)熒光對(duì)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽進(jìn)行了分離檢測(cè) (Gao J.等,丄a6 C脈2004,《47-52)。
微流控芯片結(jié)合免疫磁珠法分選細(xì)胞也受到了廣泛的關(guān)注。其原理是特定的細(xì)胞表面抗 原能與包被有抗體的磁珠進(jìn)行免疫反應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下，含有特異性抗原的細(xì)胞被吸 附而滯留在磁場(chǎng)中，而無該種表面抗原的細(xì)胞不能與抗體結(jié)合，沒有磁性，不停留在磁場(chǎng)中，從而使不同的細(xì)胞得到分離。Pamme等在微流控磁性分離設(shè)備中連續(xù)的分離了載有磁性納 米粒子的細(xì)胞(PammeN.等，丄WO^， 2006, 6, 974-980)，細(xì)胞在流經(jīng)微流控室時(shí)在磁場(chǎng)的作用 下發(fā)生偏轉(zhuǎn)從而分離。Inglis等采用連續(xù)流動(dòng)的微流控芯片成功地從人全血中分離了被磁性 微顆粒標(biāo)記的白細(xì)胞(Lnglis D. W.等,v4/j^.尸/z". 2004, 5093-509)。在芯片通道中制 作一排微磁條，當(dāng)細(xì)胞連續(xù)的流過磁條時(shí)，磁條所產(chǎn)生的高磁場(chǎng)梯度捕獲被磁性標(biāo)記的細(xì)胞 并改變細(xì)胞的流動(dòng)方向，從而達(dá)到分離的目的。2003年Harrison研究小組采用免疫磁珠法 將抗體包被在磁珠外，成功的捕獲了細(xì)胞中稀少的細(xì)胞(Furdui V. I.等， / M'c/"o麼c/2. Mr'croeng.， 2003, /3, S164-S170)。 2004年該研究小組采用Y形微流控芯片通道，對(duì)血液中的 T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了分離和濃縮。他們把表面修飾有CD3抗體的蛋白A磁珠引入芯片，通過 CD3抗體蛋白與T淋巴細(xì)胞的特異結(jié)合，T淋巴細(xì)胞被吸附在兩側(cè)帶有磁場(chǎng)的Y形通道中， 使只含有萬分之一的T細(xì)胞被捕獲富集(Furdui V. I.等,丄W C/n>, 2004,《614-618)。本發(fā)明 的芯片是對(duì)上述Y形微流控芯片的改造，本發(fā)明與Furdui設(shè)計(jì)的Y形微流控芯片相比，在 Y形通道上巧妙的設(shè)計(jì)了一個(gè)用于抗原抗體免疫反應(yīng)的反應(yīng)室，通過擴(kuò)大Y形通道的局部 截面積，減小了流體在此區(qū)域的線速度，這樣目標(biāo)細(xì)胞更容易被捕獲，從而提高了細(xì)胞的捕 獲效率，此外還可以增加細(xì)胞分選的通量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流控芯片。 本發(fā)明的另一 目的在于提供上述芯片在富集稀少細(xì)胞方面的應(yīng)用。
一種基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流控芯片，該芯片是在現(xiàn)有Y型微流控芯片 基礎(chǔ)上的改造，包括鍵合在一起的基片和蓋片，所述基片上設(shè)有Y型微通道以及分別位于Y 型微通道上部?jī)蓚€(gè)端點(diǎn)的樣品池(1)和緩沖液池(2)、還有位于Y型微通道下部端點(diǎn)的廢液 池(3)，其特征在于，所述基片上還設(shè)有抗原抗體免疫反應(yīng)室(4),所述抗原抗體免疫反應(yīng) 室(4)位于Y型微通道交叉點(diǎn)(5)和廢液池(3)之間的微通道上，且抗原抗體免疫反應(yīng) 室(4)的寬度為微通道寬度的2-5倍。
所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)為一個(gè)圓角矩形槽，矩形長(zhǎng)度為1.8-2 mm，寬度為 0.2-1.0mm，槽的深度與微通道深度相同。
所述圓角矩形槽的圓角由半徑為0.9-1 mm的圓的四分之一圓弧構(gòu)成。
所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)的中心距離Y型微通道交叉點(diǎn)(5)為10-15mm。
所述微流控芯片的材料為玻璃、石英、和高聚物中的一種或兩種。
5所述高聚物為聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯和聚乙二醇中的一種或兩種。 所述樣品池(1)、緩沖液池(2)、廢液池(3)均為圓柱形。
本發(fā)明芯片在富集稀少細(xì)胞方面的應(yīng)用，其操作步驟如下在抗原抗體免疫反應(yīng)室(4) 的上下兩側(cè)對(duì)稱放上永磁鐵，永磁鐵的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍在280-310 mT，將表面結(jié)合有特定抗 體的磁珠以6-10iaL/min的速度從樣品池(1)進(jìn)樣，以6-10nL/min的速度從緩沖液池(2) 流入緩沖液，將殘留在非免疫反應(yīng)室微通道上的磁珠沖洗到抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)內(nèi)， 而后將待分離樣品以0.1-0.5 pL/min的流速從樣品池(1)通入到芯片微通道中，最后用緩沖 液以6-10nL/min的流速從緩沖液池(2)流入微通道進(jìn)行沖洗3-5次，含有相應(yīng)抗原的細(xì)胞 被吸附在抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)，從而目標(biāo)細(xì)胞得到分離。
在抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)上下兩側(cè)的磁場(chǎng)強(qiáng)度決定了結(jié)合有特定抗體的磁珠的進(jìn)樣 速度，磁場(chǎng)強(qiáng)度大時(shí)，磁珠的進(jìn)樣速度可大，磁場(chǎng)強(qiáng)度小時(shí)，磁珠的進(jìn)樣速度要小，否則， 磁珠不能100%在抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)中被捕獲。
本發(fā)明芯片的檢測(cè)原理先將兩塊永磁鐵對(duì)稱地放在微流控芯片反應(yīng)室的上下兩側(cè)，然 后將表面結(jié)合有單克隆抗體的磁性微珠以稍大的流速通入到通道中，結(jié)合有單克隆抗體的磁 性微珠在外加磁場(chǎng)的作用下被固定在反應(yīng)室內(nèi)，接著將細(xì)胞懸液以較小的流速通入到通道 中，通過細(xì)胞表面的抗原與磁珠表面的抗體間的特異性免疫反應(yīng)，含有特異性抗原的細(xì)胞被 吸附而滯留在磁場(chǎng)中，而無該種表面抗原的細(xì)胞不能與抗體結(jié)合，沒有磁性，不停留在磁場(chǎng) 中，從而使不同的細(xì)胞得到分離，最后采用裝備有CCD的倒置顯微鏡對(duì)分離出來的細(xì)胞進(jìn) 行拍照計(jì)數(shù)，如圖4所示。
本發(fā)明芯片的制作方法
1) 芯片設(shè)計(jì)在基片上設(shè)計(jì)掩膜，比如，以玻璃為基片制作芯片采用濕法刻蝕技術(shù)，
以聚二甲基硅氧垸(PDMS)為基片制作芯片采用光刻法，由于玻璃各向同性會(huì)使 通道向兩側(cè)擴(kuò)展，而PDMS通道的尺寸與設(shè)計(jì)的掩膜相比變化不大，因此前者設(shè)計(jì) 的掩膜尺寸比后者稍小。
2) 芯片的制作方法
A)以玻璃為基片、PDMS為蓋片的芯片制作方法
a.將設(shè)計(jì)的微流控芯片圖形制成掩膜，圖形區(qū)為透明區(qū)，可透射光，非圖形區(qū)為黑色區(qū)， 吸光而不能透射光。b. 將掩膜覆蓋在63mmx63mmxl.5mm的勻膠鉻板(鉻型LRC;鉻厚T: 145nm膠類 正性感光膠；膠厚570nm)上，在紫外線照射下曝光，感光膠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。
c. 曝光后的鉻板在0.5。/。的NaOH溶液中顯影，以除去被曝光的正性感光膠，掩膜上的圖形 被復(fù)制到光膠層上。
d. 室溫下將曝光后的膠鉻板放入鉻膜刻蝕液(硫酸鈰高氯酸水-50g: 15 mL: 300 mL) 中腐蝕裸露的絡(luò)膜，同時(shí)保證非圖形區(qū)的光膠層和鉻膜不被破壞。高純水沖洗干凈后， 烘干。光膠層上的微圖形結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)移到了玻璃基片上。
e. 濕法刻蝕微通道。以0.5 M HF/0.5 M NH4F為刻蝕劑刻蝕微通道，速率約為10 pm h—、 得橫截面為梯形的凹微通道。再依次用丙酮和鉻膜刻蝕液除去殘存的光膠層和鉻膜，用 高純水沖洗干凈即得干凈透明的基片。
f. 在基片的進(jìn)樣口位置用微型臺(tái)鉆處打孔，作為芯片樣品池。
g. 將基片在丙酮和去離子水中超聲5-10min后，放入H2S(VH202 (3/1， V/V)的混合溶液 中加熱煮沸半小時(shí)。待冷卻后，將基片取出并用去離子水沖洗至玻璃片表面呈中性。
h. 截取與基片同樣尺寸的固化好的PDMS蓋片，并與將玻璃基片一起放入氧等離子體真空 管中，抽真空3分鐘，打開高頻電源，90秒后取出基片和蓋片，立即鍵合。
B)以PDMS為基片，為玻璃蓋片的制作方法
a. 設(shè)計(jì)制作陽模板掩膜的基片掩膜上黑色圖形區(qū)為微流體通道，不透光。
b. 在干凈的硅片上甩涂一薄層SU-8光刻膠，采用不同類型、粘度的SU-8，膠層厚度可控 制在1 300罔之間。紫外線通過光掩膜使光刻膠曝光，未曝光區(qū)域用顯影液溶解。硅 片及表面上剩下的凸起SL'-8結(jié)構(gòu)用作制作PDMS基片的陽模。
c. PDMS基片的制作將PDMS單體(二甲基硅氧垸)與引發(fā)劑以10 : 1的重量比例混合， 脫氣后澆鑄于基片陽模板上，在80。C聚合1.5小時(shí)，冷卻至室溫，剝離模板，得無色透 明PDMS基片。
d. 將基片和干凈的玻璃蓋片裁剪成相同的尺寸(誤差0.2 ^m)。在基片的儲(chǔ)液池位置處打 孑L，作為芯片儲(chǔ)液池。
e. 將玻璃基片一起放入氧等離子體真空管中，抽真空3分鐘，打開高頻電源，90秒后取出 基片和蓋片，立即鍵合。本發(fā)明芯片的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用免疫磁性分離的技術(shù)，在Y型微流控芯片上設(shè)計(jì)抗原 抗體免疫反應(yīng)室(4)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的簡(jiǎn)便、快速、高通量分離和檢測(cè)。根據(jù)流體力學(xué)連續(xù) 性原理可知，流管中截面積大處流速小，截面積小處流速大，將反應(yīng)室(4)截面積設(shè)計(jì)成 大于通道截面積，從而使磁珠高效、快速的被固定，同時(shí)細(xì)胞的進(jìn)樣速度增大，提高了分析 通量，減少進(jìn)樣的死體積、減少滯留和交叉感染的幾率。目標(biāo)細(xì)胞通過抗原抗體免疫反應(yīng)在 反應(yīng)室被捕獲富集，從而與其他非目標(biāo)細(xì)胞分離開來，整個(gè)分離檢測(cè)過程中不需要使用昂貴 的儀器，并且試劑的消耗量非常的小，該芯片不僅適用于富集稀少細(xì)胞達(dá)到快速高通量的細(xì) 胞分離，而且還可利用免疫細(xì)胞化學(xué)分析與磁性細(xì)胞分選相結(jié)合進(jìn)行癌細(xì)胞的臨床檢測(cè)，該 微流控芯片制造成本低，易于批量生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分離檢測(cè)的微型化、集成化和簡(jiǎn)單化。


圖1為實(shí)施例2制作的以玻璃為基片，PDMS為蓋片的微流控芯片的微通道的尺寸設(shè)計(jì)圖； 圖2為實(shí)施例3制作的以PDMS為基片，玻璃為蓋片的微流控芯片的微通道的尺寸設(shè)計(jì)圖； 圖3為Y型PDMS微流控芯片示意圖； "A"為芯片PDMS基片，"B"為芯片玻璃蓋片；
1:樣品池，2:緩沖液池，3:廢液池，4:抗原抗體免疫反應(yīng)室，5: Y型微通道交叉點(diǎn) 圖4為芯片上免疫磁性分離的步驟和原理；
圖5為現(xiàn)有技術(shù)Y型微流控芯片的掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計(jì)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明芯片的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明芯片包括鍵合在一起的基片和蓋片，基片上設(shè)有Y型微通道以及分別位于Y型 微通道上部?jī)蓚€(gè)端點(diǎn)的樣品池(1)和緩沖液池(2)、還有位于Y型微通道下部端點(diǎn)的廢液池
(3) ,在距離Y型微通道交叉點(diǎn)(5) 10mm的微通道上設(shè)計(jì)有抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)， 反應(yīng)室(4)為一圓角矩形槽，寬度為微通道寬度的4倍，長(zhǎng)度為2mm。在抗原抗體免疫 反應(yīng)室(4)的上下兩側(cè)對(duì)稱放上永磁鐵，將表面結(jié)合有特定抗體的磁珠從樣品池(1)進(jìn)樣， 然后緩沖液從緩沖液池(2)流入，將殘留在非免疫反應(yīng)室微通道上的磁珠沖洗到抗原抗體 免疫反應(yīng)室(4)內(nèi)，而后將待分離樣品從樣品池(1)通入到芯片微通道中，最后用緩沖液 從緩沖液池(2)流入微通道進(jìn)行沖洗，含有相應(yīng)抗原的細(xì)胞被吸附在抗原抗體免疫反應(yīng)室
(4) ，廢液流入廢液池(3)，從而目標(biāo)細(xì)胞得到分離。實(shí)施例2以玻璃為基片，PDMS為蓋片的本發(fā)明芯片制作
(1) 玻璃基片的制作掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計(jì)見圖1。將掩膜膠片置于63 mmx63 mmxl.5 mm的勻膠鉻板上，紫外線曝光7分鐘(波長(zhǎng)365nm)，顯影液中顯影100秒后， 100。C下烘干半小時(shí)。在室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰高氯酸水=50克15毫升 300毫升)腐蝕鉻膜，然后用高純水沖洗干凈，烘干。通過數(shù)碼顯微鏡攝像，測(cè)得鉻板 上的通道尺寸均增大了大約30 (am。用0.5 M HF/0.5 M NH4F刻蝕劑腐蝕裸露的硼硅玻 璃，速率約為lOpmmin—1,刻蝕10分鐘后，再依次用丙酮、鉻膜刻蝕液除去殘余光膠 層和鉻膜，即得基片。用微型臺(tái)鉆打孔，鉆頭為2mm的金剛鉆頭，孔的直徑即為液池 直徑2mm。顯微鏡下測(cè)定微通道尺寸微流體通道，上部寬110pm,下部寬60 nm, 深度20 pm，抗原抗體免疫反應(yīng)室的尺寸上部寬440 pm，下部寬24(Vm,深度20 pm。
(2) 蓋片的制作截取與基片同樣尺寸的PDMS作為蓋片。
(3) 將基片與蓋片依次在丙酮和去離子水中超聲5分鐘，在H2SCVH202 (3/1)溶液煮微沸 30分鐘，待冷卻后用高純水中沖洗至玻璃表面呈電中性，在超凈臺(tái)中吹干。然后將玻 璃基片和PDMS蓋片放入氧等離子體真空管中，抽真空3分鐘，打開高頻電源，90秒 后取出基片和蓋片，立即鍵合。
實(shí)施例3以PDMS為基片，玻璃為蓋片的本發(fā)明芯片制作
(1) PDMS基片的制作:掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計(jì)見圖2。將硅片放入到濃H2SCVH202
(3/1)溶液煮微沸30分鐘，待冷卻后取出用去離子水沖洗至中性，丙酮超聲5分鐘 后在加熱板上加熱30分鐘。
(2) 在硅片上甩涂一薄層SU-8光刻膠，通過控制甩膠速度使膠層厚度大約為50 pm。紫 外線通過光掩膜使光刻膠曝光，未曝光的部分用顯影液溶解。硅片表面上凸起的SU-8 結(jié)構(gòu)作為PDMS基片的陽模。然后將硅陽模進(jìn)行硅烷化1小時(shí)。
(3) PDMS預(yù)聚體(單體/固化劑=10/1混合)澆注在硅陽模上并真空脫氣，然后放入70 。C 烘箱中固化l小時(shí)左右，然后將PDMS從陽模剝離，作為微通道的基片。
(4) 將PDMS基片與干凈的玻璃蓋片一起放到氧等離子體真空管中，抽真空3分鐘，打 開高頻電源，90秒后取出基片和蓋片，立即鍵合。
實(shí)施例4利用實(shí)施例2制得的芯片分離與檢測(cè)艾滋病感染者CD4+T淋巴細(xì)胞
(1)將磁場(chǎng)強(qiáng)度為2卯mT的兩塊永磁鐵對(duì)稱地放在微流控芯片免疫反應(yīng)室的上下兩側(cè)。(2) 將2 ^L、濃度為1.5xl08 beads/mL的抗CD4+免疫磁珠(購自美國(guó)Invi加gen公司)以 6 ^L/min的速度從樣品池(1)進(jìn)樣。
(3) 然后用5 pL含0.1%BSA的PBS緩沖溶液從緩沖液池(2)以6 pL/min的速度通入， 將殘留在非免疫反應(yīng)室微通道上的抗CD4+免疫磁珠沖洗到免疫反應(yīng)室內(nèi)。
(4) 將1 pL的細(xì)胞懸液以0.2 nL/min的流速從樣品池(1)通入到芯片微通道中。
(5) 用含0.1%BSA的PBS緩沖溶液以6 nL/min的流速從緩沖液池(2)流入微通道進(jìn)行 沖洗3次，含有。04+的T淋巴細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，從而使目標(biāo)細(xì)胞得到分 離。 '
(6) 采用裝備有CCD的倒置顯微鏡對(duì)分離出來的細(xì)胞進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。
上述細(xì)胞懸液的制備方法無菌取出小鼠脾臟將其放入有PBS緩沖溶液的平皿中，用 注射器芯研磨脾臟至脾呈白色絮狀，然后置于300目無菌細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，沖洗，以1000rpm 離心5min，棄其上清，以RPMI-1640重懸細(xì)胞。
實(shí)施例5本發(fā)明實(shí)施例2制備的芯片與現(xiàn)有技術(shù)Y型微流控芯片在細(xì)胞分選方面的比較試 驗(yàn)
現(xiàn)有技術(shù)中Y型微流控芯片的制作按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行制作，其中，掩膜膠片 上微通道的尺寸設(shè)計(jì)見圖5。
按照實(shí)施例4的方法分別使用實(shí)施例2制得的芯片和上述現(xiàn)有技術(shù)Y型微流控芯片進(jìn) 行艾滋病感染者CD4+T淋巴細(xì)胞的分離，現(xiàn)有技術(shù)Y型微流控芯片對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的捕獲效率 為20%，而本發(fā)明的芯片對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的捕獲率為90%。
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權(quán)利要求
1、一種基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流控芯片，包括鍵合在一起的基片和蓋片，所述基片上設(shè)有Y型微通道以及分別位于Y型微通道上部?jī)蓚€(gè)端點(diǎn)的樣品池(1)和緩沖液池(2)、還有位于Y型微通道下部端點(diǎn)的廢液池(3)，其特征在于，所述基片上還設(shè)有抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)，所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)位于Y型微通道交叉點(diǎn)(5)和廢液池(3)之間的微通道上，且抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)的寬度為微通道寬度的2-5倍。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的微流控芯片，其特征在于，所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)為一個(gè) 圓角矩形槽，矩形長(zhǎng)度為1.8-2mm，寬度為0.2-1.0mm，槽的深度與微通道深度相同。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述圓角矩形槽的圓角由半徑為0.9-1 mm的圓的四分之一圓弧構(gòu)成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的微流控芯片，其特征在于，所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)的中心 距離Y型微通道交叉點(diǎn)(5)為10-15mm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的材料為玻璃、石英、 和高聚物中的一種或兩種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述高聚物為聚二甲基硅氧烷、聚苯 乙烯和聚乙二醇中的一種或兩種。
7、 權(quán)利要求l所述芯片在富集稀少細(xì)胞方面的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，在抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)的上下兩側(cè)對(duì)稱 放上永磁鐵，永磁鐵的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍在280-310 mT，將表面結(jié)合有特定抗體的磁珠以6-10 nL/min的速度從樣品池(1)進(jìn)樣，以6-10nL/min的速度從緩沖液池(2)流入緩沖液，將 殘留在非免疫反應(yīng)室微通道上的磁珠沖洗到抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)內(nèi)，而后將待分離樣 品以0.1-0.5 pL/min的流速從樣品池(1)通入到芯片微通道中，最后用緩沖液以6-10pL/min 的流速從緩沖液池(2)流入微通道進(jìn)行沖洗3-5次，含有相應(yīng)抗原的細(xì)胞被吸附在抗原抗 體免疫反應(yīng)室(4)，從而目標(biāo)細(xì)胞得到分離。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域的基于免疫磁性分離技術(shù)的細(xì)胞分選微流控芯片及其在富集稀少細(xì)胞方面的應(yīng)用。該芯片是在現(xiàn)有Y型微流控芯片基礎(chǔ)上的改造，包括鍵合在一起的基片和蓋片，所述基片上設(shè)有Y型微通道以及分別位于Y型微通道上部?jī)蓚€(gè)端點(diǎn)的樣品池(1)和緩沖液池(2)、還有位于Y型微通道下部端點(diǎn)的廢液池(3)，所述基片上還設(shè)有抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)，所述抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)位于Y型微通道交叉點(diǎn)(5)和廢液池(3)之間的微通道上，且抗原抗體免疫反應(yīng)室(4)的寬度為微通道寬度的2-5倍。本發(fā)明的芯片可使磁珠高效、快速的被固定，增大細(xì)胞的進(jìn)樣量，提高了分析通量，減少進(jìn)樣死體積、減少滯留和交叉感染。
文檔編號(hào)C12M1/42GK101643701SQ20091008958
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者林金明, 丹 高 申請(qǐng)人:清華大學(xué)