專利名稱：一種煙草赤星病菌孢子接種體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農業(yè)生物技術，更具體地說，本發(fā)明涉及一種煙草赤星病 菌孢子接種體的制備方法。' 背景技術煙草赤星病(Tobacco Brown Spot Disease)是煙葉成熟后期常見的葉部 病害，在各煙區(qū)普遍發(fā)生，是我國煙草的主要病害，病原是鏈格孢菌 (J/^maWa aten ato)。目前，人工接種赤星病用的病菌接種體，以病菌 孢子液為主。在實驗室、溫室一般采用平板菌絲培養(yǎng)、自然產孢后制備煙草 赤星病菌孢子接種體，僅見個別的研究通過紫外光誘導產孢。由于人工接種 用煙草赤星病菌為較強致病力，其產生孢子的效率往往比較低。僅依靠傳統(tǒng) 的培養(yǎng)產孢，只能滿足離體葉片接種用；要滿足大田人工接種，僅設置誘發(fā) 行接種也需要花費較大的勞動來制備較大量的接種體。用紫外光誘導產孢， 紫外劑量與時間控制不當，容易造成變異，也容易導致培養(yǎng)物污染。因此， 如何更為有效的制備煙草赤星病菌接種體，就成為煙草育種、植保工作中亟 待解決的技術問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種經濟有效的煙 草赤星病菌孢子接種體的制備方法。本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)。 *除非另有說明，本發(fā)明中所釆用的百分數(shù)均為質量百分數(shù)。 本發(fā)明提供了一種煙草赤星病菌孢子接種體的制備方法，所述的方法 關鍵在于采用改進的誘導產孢方法，分離、篩選得到的強致病力菌株4 6 點點接于CA平板，黑暗培養(yǎng)5 7天，封皿置6 1(TC冰箱黑暗誘導產孢3 5 天，1%葡萄糖溶液洗下孢子，'脫脂棉過濾，即可獲得赤星病菌孢子接種體。 本發(fā)明的方法，具體采用以下步驟(1)從發(fā)病田塊中釆集病葉，經過分離、純化、致病力篩選測定，獲得強致病力病菌，將菌種保存于CA斜面，置于4'C條件下恒溫保存，備用。(2)將煙草赤星病菌產生孢子的菌絲4 10點點接到CA平板培養(yǎng)基上， 在25土rC下恒溫培養(yǎng)5 7天，選擇菌絲黑褐色、在平板表面形成一層較致 密菌絲層的培養(yǎng)物，用于誘導產孢。所述的赤星病菌點接物為已經大量產 生孢子的培養(yǎng)物，接種時每點以孢子接種體為主。(3) 密封培養(yǎng)好的平板，置6 10'C冰箱黑暗誘導產孢3 5天。所述 的赤星病菌誘導產孢方法為高濕、低溫誘導，誘導前病菌菌絲已充分生 長。(4) 1%葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌絲，脫脂棉過濾除菌絲， 濾液即為赤星病菌孢子接種體。通常每內皿直徑9cm的平板可獲得孢子 含量為0.1 1.0億個/ml的孢子懸浮液20 25ml，孢子萌發(fā)率90%以上。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下突出優(yōu)點1. 赤星病菌點接物為已經大量產生孢子的培養(yǎng)物，接種時每點以孢 子接種體為主，其菌絲體很少或不能繼續(xù)生長，這種移植方法類似于涂 孢子懸浮液，只是接種位點相對少而已，但與涂孢子懸浮液一樣，由于 接種點相對較多，培養(yǎng)物能夠較快占據(jù)整個平板表面，因此可較快耗盡 營養(yǎng)，促進培養(yǎng)物的大量產生孢子。點接與孢子涂布相比，可顯著減少 后繼培養(yǎng)物的雜菌污染。2. 赤星病菌誘導產孢方法為高濕、低溫誘導。病菌在前期的適溫培 養(yǎng)時，菌絲已充分生長。密封平板置6 1(TC黑暗冰箱中，為潛在的產孢 菌絲創(chuàng)造了一個高濕、低溫、黑暗的環(huán)境，這種環(huán)境可刺激菌絲大量產 生孢子。3. 制備的赤星病菌孢子接種體，每內皿直徑9cm的平板可獲得孢子 含量為0.1 1.0億個/ml的孢子懸浮液20 25ml，孢子萌發(fā)率90°/。以上。這 種方法制備的孢子量是常規(guī)的50 100倍，可減少50 100倍制備孢子接種 體的工作量。4. 獲得的孢子生活力強，如不加1%葡萄糖溶液洗皿，在6 1(TC黑 暗冰箱內平板可保存3 6月，盡管孢子萌發(fā)率略有降低，但孢子總量增加，有效接種體基本維持不變。
具體實施方式
通過下面給出的實施例和應用實施例，可以進一 步清楚地了解本發(fā)明, 但它們不是對本發(fā)明保護范圍的限定。 實施例制備煙草赤星病菌接種體，首先需要通過分離、培養(yǎng)、致病力測定獲 得強致病力病菌。通?？刹捎面咦討业畏ń臃N離體葉片，測定發(fā)病情況， 發(fā)病嚴重的菌株致病力強一些，以保證接種的有效性、可比性。然后培養(yǎng) 制備接種體，點接、黑暗培養(yǎng)，低溫、高濕、黑暗誘導產孢，洗孢子，即 可獲得赤星病菌孢子接種體。本例釆用孢子懸滴法接種離體葉片篩選獲得的強致病力菌株97Aa003實施，具體如下(1) 將保存的強致病力菌株97Aa003, 4~5點點接到CA平板培養(yǎng)基， 選擇生產較快的菌落，再轉接到CA平板培養(yǎng)基，在25土1。C下恒溫培養(yǎng)至大量產生孢子，作為擴大培養(yǎng)的菌種，備用。(2) 將煙草赤星病菌產生孢子的菌絲7 9點點接到CA平板培養(yǎng)基上， 在25土1。C下恒溫培養(yǎng)5 7天，選擇菌絲黑褐色、在平板表面形成一層較致 密菌絲層的培養(yǎng)物，用于誘導產孢。(3) 用封口膜密封培養(yǎng)好的平板，置6 1(TC冰箱黑暗誘導產孢3 5天。(4) 1%葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌絲，脫脂棉過濾除菌絲， 濾液即為赤星病菌孢子接種體。通常每內皿直徑9cm的平板可獲得孢子 含量為0.1 1.0億個/ml的孢子懸浮液20 25ml，孢子萌發(fā)率90%以上。應用實施例l品種抗性評價 1.材料與方法 1.1材料供試接種病原為強致病力煙草赤星病菌97Aa003菌株。供試品種為G28、 凈葉黃、K326、云煙97、云煙98、 NC89共6個品種。 1.2方法1.2.1供試病原接種體的制備煙草赤星病菌孢子接種體的制備強致病力赤星病菌97Aa003菌株孢子 接種體的制備按照本發(fā)明方法進行。1.2.2抗性測定品種的小區(qū)布置試驗處理為6個處理，待測定的6個品種，每個品種為l個處理。每處理植煙30株，4次重復。小區(qū)隨機排列。管理與種植同優(yōu)質烤煙模式。試驗用 地約1.5畝。本試驗在云南省煙草科學研究所研和試驗基地進行。 1.2.3病菌人工接種封頂去2片腳葉后，將制備的煙草赤星病菌孢子接種體用1°/。的葡萄糖稀 釋50 100倍，至10 100萬個孢子/ml，按0.2%的質量比加入吐溫80、過325目 標準篩的硅藻土，攪拌均勻，噴霧每處理中下部葉，至葉片布滿均勻一層細 小水珠為止，接種后在試驗田灌注水至半溝，保濕24 48小時。1.2.4病情調査在煙草赤星病菌接種前一天，進行一次病情基數(shù)調查，接種后每7天調 查一次病情。調查各處理的葉片，調查記載采用YC/T39-1996 "煙草病害分 級及調查方法"中煙草赤星病害的行業(yè)標準。以發(fā)病盛期時病情指數(shù)的高低， 評價抗性。2.結果與分析品種抗性測定結果見表l，以病情指數(shù)大于70為高度感病、50《病情指 數(shù)<70為感病、30《病情指數(shù)<50為低度抗病、20《病情指數(shù)<30為中度 抗病、小于20為高度抗病進行評價，可以看出G28高度感病，NC89感病 K326、云煙97、云煙98低度抗病，凈葉黃高度抗病。表l.待測抗性品種的測定結果(病情基數(shù)為O)品種病情指數(shù)抗性評價G2878.24Aa高感(HS)凈葉黃16.45Dd高抗(HR)K32635.06Cc低抗(L)云煙9839.36Cc低抗(-L)云煙9738.42Cc低抗(L)NC8954.21Bb感病(S)應用實施例2防治藥劑篩選 1.材料與方法U材料 供試藥劑見表2。供試接種病原為強致病力煙草赤星病菌97Aa003菌株。供試品種為 K326。1.2方法1.2.1供試菌株接種體的制備煙草赤星病菌孢子接種體的制備強致病力煙草疫霉97Aa003菌株孢子 接種體按實施例進行。1.2.2防治藥劑的小區(qū)處理試驗處理為5種藥劑處理、l個空白對照共6個處理(表2)。每處理植煙 30株，4次重復。小區(qū)隨機排列。管理與種植同優(yōu)質烤煙模式。試驗用地約 1.5畝。本試驗在云南省煙草科學研究所研和試驗基地進行。表2.供試藥劑及處理設置處藥劑藥劑編號使用生產廠家理名稱濃度A秀安50%異菌脲可濕性粉劑1500x浙江禾益農化有限公司B東旺19%惡霉>絡銅水劑1800x北京巿東旺農藥廠C菌克45%菌核.王銅可濕性粉劑600 x浙江禾益農化有限公司D菌霸多抗霉素畫x浙江一帆化工有限公司E菌核凈40%菌核凈超微可濕性粉劑1200x溫州巿斯佩斯化工農藥有限公司CK1.2.3防治藥劑的施用封頂去2片腳葉后，按處理設置表中各藥劑分別噴霧。 1.2.4病菌人工接種 按照應用實施例l中的方法進行。 1.2.5病情調查在煙草赤星病菌接種前一天，進行一次病情基數(shù)調查，接種后每7天調 查一次病情。調查各處理的葉片，調查記載釆用YC/T39-1996 "煙草病害分 級及調查方法"中煙草赤星病害的行業(yè)標準。以第14天病情，評價藥劑防治 效果。2.結果與分析藥劑的田間小區(qū)防治試驗結果(表3)表明，供試的5種藥劑對大田發(fā)生 的赤星病都有一定的防治效果，其中，菌克防治效果最好，再次是菌核凈， 秀安、東旺效果較差，菌霸效果最差。表2.藥劑防治赤星病的田間小區(qū)試驗結果(病情基數(shù)為0 )處理藥劑名稱病情指數(shù) 防治效果(％)A秀安14.5646.76CcB東旺15.0744.卯CcC菌克10.4861.68AaD菌霸17.6335.54DdE菌核凈12.2455.25BbCK清水27.3權利要求
1. 一種煙草赤星病菌孢子接種體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)獲取強致病力菌株；(2)黑暗培養(yǎng)；(3)冰箱黑暗誘導；(4)獲取赤星病菌孢子接種體。
2. 根據(jù)權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的強致病力菌株 的獲取方法是從發(fā)病田塊中釆集病葉，經過分離、純化、致病力篩選測定， 獲得強致病力病菌，將菌種保存于CA斜面，置于4。C條件下恒溫保存，備 用。
3. 根據(jù)權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述黑暗培養(yǎng)的方法 是將煙草赤星病菌產生孢子的菌絲4 10點點接到CA平板培養(yǎng)基上，在25± rc下恒溫培養(yǎng)5-7天，選擇菌絲黑褐色、在平板表面形成一層較致密菌絲 層的培養(yǎng)物，用于誘導產孢。
4. 根據(jù)權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的冰箱黑暗誘導 的方法是密封培養(yǎng)好的平板，置6 1(TC冰箱內黑暗誘導產孢3 5天。
5. 根據(jù)權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的獲取赤星病菌 孢子接種體的方法是用P/。葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌絲，脫脂棉過 濾除菌絲，濾液即為赤星病菌孢子接種體。
6. 根據(jù)權利要求3所述的赤星病菌點接物為已經大量產生孢子的培養(yǎng) 物，接種時每點以孢子接種體為主。
7. 根據(jù)權利要求4所述的赤星病菌誘導產孢方法為高濕、低溫誘導，誘 導前病菌菌絲已充分生長。
8. 根據(jù)權利要求5所述的赤星病菌孢子接種體,每內皿直徑9cm的平板可 獲得孢子含量為0.1 1.0億個/ml的孢子懸浮液20 25ml，孢子萌發(fā)率90%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草赤星病菌孢子接種體的制備方法。其包括以下步驟(1)獲取強致病力菌株；(2)黑暗培養(yǎng)；(3)冰箱黑暗誘導；(4)獲取赤星病菌孢子接種體。其中，赤星病菌點接物為已經大量產生孢子的培養(yǎng)物，接種時每點以孢子接種體為主；赤星病菌誘導產孢方法為高濕、低溫誘導，誘導前病菌菌絲已充分生長。赤星病菌孢子接種體，每內皿直徑9cm的平板可獲得孢子含量為0.1～1.0億個/ml的孢子懸浮液20～25ml，孢子萌發(fā)率90％以上。本發(fā)明制備的孢子量是常規(guī)的50～100倍，可減少50～100倍制備孢子接種體的工作量。
文檔編號C12R1/645GK101519645SQ20091009428
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權日2009年4月1日
發(fā)明者盧秀萍, 張樹鋒, 方敦煌, 李永平, 白江蘭 申請人:云南省煙草科學研究所