專利名稱：大腸菌群單管定量快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別是涉及一種大腸菌群單管定量快 速檢測方法。
背景技術：
目前國內(nèi)外已有的基于產(chǎn)色技術檢測樣品中大腸菌群都是采用
最大可能數(shù)法(MPN)，也就是單管定性，多管定量，檢測手段都是采
用目測產(chǎn)色。該方法存在2個主要缺陷第一個缺陷是檢測時間較長，
該方法在接種樣品后需要培養(yǎng)18-24小時；第二個缺陷是采用最大可 能數(shù)法進行定量，導致接種試管數(shù)較多， 一般需要接種9支或15支 試管，同時最大可能數(shù)法的誤差比較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏度高、成本低廉的大腸菌 群單管定量快速檢測方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是
本發(fā)明是一種大腸菌群單管定量快速檢測方法，它包括以下步驟: 特異性檢測培養(yǎng)基的配制;樣品接種；將接種的樣品在35"C-44X:下 培養(yǎng)8-15h;以8000-12000rpm速度離心5-10 min; 用分光光度計測定上清液在405nm處的吸光度值；根據(jù)公式計算菌濃度。
所述的培養(yǎng)基為含0NPG (鄰硝基酚半乳糖甙)的培養(yǎng)液，其 組分和重量如下0NPG 300-700mg;胰蛋白胨8-12g; (NH4) 2S04 3_8g; Mn (S04) 2 0. 2-0. 7mg; ZnS04 0. 2-0. 7mg; Na2S03 20-60mg; NaCl 8-12g; CaCl2 40-60mg; KH2P04 0. 7-1. 2g; Na2HP04 6. 0-6. 5g;蒸餾水lOOOml。
所述的培養(yǎng)基配制方法將所列重量的各組分置于容器內(nèi)，培養(yǎng) 溫度35-44°C，培養(yǎng)時間10-14h，保持pH值7,0-7.5。
采用上述方案后，本發(fā)明應用分光光度計測定培養(yǎng)液的吸光度 值，比目測法靈敏很多，可以大大縮短培養(yǎng)時間。采用單管定量檢測 技術， 一個樣品只需1管培養(yǎng)液，比最大可能數(shù)法節(jié)約很多試劑、耗 材，而且檢測結果更加快速、穩(wěn)定、靈敏度高。
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。


圖l是本發(fā)明的檢測流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的原理根據(jù)大腸菌群在生長的過程中能產(chǎn)生3-半乳糖 苷酶(e-galactosidase)分解培養(yǎng)液中的特定底物0NPG (鄰硝基 酚半乳糖甙)產(chǎn)生顯色物質(zhì)ONP (鄰硝基酚)的原理，通過測定培養(yǎng) 液有無產(chǎn)生黃色物質(zhì)可以判斷樣品中是否存在大腸菌群。通過研究發(fā) 現(xiàn)，在一定條件下，培養(yǎng)液中黃色物質(zhì)的量與接種大腸菌群數(shù)量成正 比。因此，可以在特定條件下通過測定培養(yǎng)液的吸光度值來推算出樣品中的大腸菌群數(shù)。
如圖1所示，本發(fā)明大腸菌群單管定量快速檢測方法，它包括以
下步驟特異性檢測培養(yǎng)基的配制；樣品接種；恒溫培養(yǎng)一定時間； 離心;測定405ran處的吸光度值；根據(jù)公式計算菌濃度。
培養(yǎng)基含ONPG (鄰硝基酚半乳糖甙)的培養(yǎng)液，推薦配方如 下ONPG 300-700mg;胰蛋白胨8-12g; (NH4)2S04: 3-8g; Mn(S04)2: 0. 2-0. 7mg; ZnS04: 0. 2-0. 7mg; Na2S03: 20-60mg; NaCl: 8-12g; CaCl2: 40-60mg; KH2P04: 0. 7-1. 2g;歸PO" 6. 0-6. 5g;蒸餾水1000ml; pH: 7.0-7.5。
培養(yǎng)溫度35-44 °C。
培養(yǎng)時間10-14h。
檢測方法用分光光度計測定培養(yǎng)液的吸光度值，檢測波長為 405nm，光禾呈為lcm。
計算公式根據(jù)培養(yǎng)的條件不同，菌濃度的計算公式與線性檢測 范圍也有所不同。
42'C培養(yǎng)10h的公式吸光度值(y) = 0.5809X lg菌濃度 -1.4801，線性檢測范圍103522-10 6 522cfu/ml。
42。C培養(yǎng)llh的公式吸光度值(y) = 0.5092X lg菌濃度 -0.5521，線性檢測范圍101522-105 522cfu/ml。
42。C培養(yǎng)12h的公式吸光度值(y) = 0.4881X lg菌濃度+ 0.0014，線性檢測范圍0-103'522cfu/ml。
42"培養(yǎng)13h的公式吸光度值(y) = 0.7072X lg菌濃度+ 0.0415,線性檢測范圍0-102 522cfu/ml。
42"C培養(yǎng)14h的公式吸光度值(y) = 0.8677X lg菌濃度+ 0.187，線性檢測范圍0-102522cfu/ml。檢測范圍環(huán)境、食品、飲料等樣品中的大腸菌群。 應用實例
實例l:配制好ONPG培養(yǎng)液，分裝于試管，每支試管10ml，接 種lml樣品到培養(yǎng)液中，42'C培養(yǎng)10小時，離心后用分光光度計測 定培養(yǎng)液在405nm處的吸光度值為1. 20，根據(jù)該條件下吸光度度與 菌濃度的對應公式，該樣品中的大腸菌群數(shù)為4. lX104Cfu/ml。
實例2:配制好ONPG培養(yǎng)液，分裝于試管，每支試管10ml，接 種lml樣品到培養(yǎng)液中，42'C培養(yǎng)12小時，離心后用分光光度計測 定培養(yǎng)液在405nm處的吸光度值為1. 10，根據(jù)該條件下吸光度度與 菌濃度的對應公式，該樣品中的大腸菌群數(shù)為186 cfu/ml。
實例3:配制好ONPG培養(yǎng)液，分裝于試管，每支試管10ml，接 種lml樣品到培養(yǎng)液中，42t培養(yǎng)14小時，離心后用分光光度計測 定培養(yǎng)液在405nm處的吸光度值為1. 30，根據(jù)該條件下吸光度度與 菌濃度的對應公式，該樣品中的大腸菌群數(shù)為16 cfu/ml。
發(fā)明要點及要求保護的重點本發(fā)明的要點是在建立單管定量檢 測技術，并通過研究確定該檢測技術的具體參數(shù)和適用范圍。本發(fā)明 保護的重點是單管定量檢測技術。
權利要求
1、一種大腸菌群單管定量快速檢測方法，其特征在于它包括以下步驟特異性檢測培養(yǎng)基的配制；樣品接種；將接種的樣品在35℃-44℃下培養(yǎng)8-15h；以8000-12000rpm速度離心5-10min；用分光光度計測定上清液在405nm處的吸光度值；根據(jù)公式計算菌濃度。
2、 根據(jù)權利要求1所述的大腸菌群單管定量快速檢測方法，其 特征在于所述的培養(yǎng)基為含鄰硝基酚半乳糖甙的培養(yǎng)液，其組分 和重量如下ONPG 300-700mg;胰蛋白胨8-12g; (NH4)2S04 3-8g; Mn (S04) 2 0. 2-0. 7mg; ZnS04 0. 2-0. 7mg; Na2S03 20-60mg; NaCl 8-12g; CaCl2 40-60mg; KH2P04 0 . 7-1. 2g; Na2HP04 6. 0-6. 5g;蒸餾水lOOOml。
3、 根據(jù)權利要求2所述的大腸菌群單管定量快速檢測方法，其 特征在于所述的培養(yǎng)基配制方法:將所列重量的各組分置于容器內(nèi)，培養(yǎng)溫度35-44。C，培養(yǎng)時間10—14h，保持pH值7.0-7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸菌群單管定量快速檢測方法，它包括以下步驟特異性檢測培養(yǎng)基的配制；樣品接種；將接種的樣品在35℃-44℃下培養(yǎng)8-15h；以8000-12000rpm速度離心5-10min；用分光光度計測定上清液在405nm處的吸光度值；根據(jù)公式計算菌濃度。本發(fā)明應用分光光度計測定培養(yǎng)液的吸光度值，比目測法靈敏很多，可以大大縮短培養(yǎng)時間。采用單管定量檢測技術，一個樣品只需1管培養(yǎng)液，比最大可能數(shù)法節(jié)約很多試劑、耗材，而且檢測結果更加快速、穩(wěn)定、靈敏度高。
文檔編號C12Q1/06GK101613738SQ200910112240
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月15日 優(yōu)先權日2009年7月15日
發(fā)明者莊峙廈, 張小東, 王小如, 鄢慶枇 申請人:集美大學