專利名稱：人乳頭瘤病毒dna片段、特異性引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及人乳頭瘤病毒DNA的檢測和/或分型。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是一種小的DNA雙鏈病毒，目前已 分出100余種HPV DNA，其中40多種與宮頸的感染和病變有關(guān)。根據(jù)HPV致病力的大小分 為高危型和低危型兩種，低危型主要引起生殖道、肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病 變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN I)；高危型主要導(dǎo)致CIN II、III級 病變和宮頸癌的發(fā)生。持續(xù)高危HPV感染是CIN進(jìn)一步發(fā)展為宮頸癌的必經(jīng)過程，從感染 高危HPV開始至發(fā)展為宮頸癌的時間間隔為15年，故宮頸癌是可預(yù)防的特殊癌癥。目前， 經(jīng)流行病學(xué)和生物學(xué)證明，HPV感染是引起宮頸癌及其癌前病變的首要原因。因此，對HPV 進(jìn)行檢測及分型是一種有效的、可靠的宮頸癌篩查手段。傳統(tǒng)的HPV檢測方法有巴氏涂片法、液基層細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查、組織病理學(xué) 檢查、電鏡直接觀察、放射免疫沉淀法檢查、酶聯(lián)免疫吸附法檢查等，這些檢測方法的靈敏 度和準(zhǔn)確率均不夠理想，且不能夠?qū)PV進(jìn)行分型。傳統(tǒng)的HPV分型方法有PCR、原位雜交、 探針分析等，這些方法操作復(fù)雜，準(zhǔn)確率不高，且價格昂貴，難以推廣。最近幾年，為了克服傳統(tǒng)檢測方法的不足，采用新的分子生物學(xué)檢測方法對HPV 進(jìn)行檢測，這些方法有核酸雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)PCR法、熒光免疫檢測法等，但是這些方 法仍然操作繁瑣，且價格昂貴。因此，開發(fā)一種簡單、易行、成本較低的檢測方法就顯得尤為 重要。美國Qiagen公司推出的雜交捕獲二代(HC-II)檢測技術(shù)是獲FDA唯一批準(zhǔn)的可 在臨床使用的一種檢測HPV DNA的技術(shù)，是目前最流行的HPV分子生物技術(shù)檢測試劑盒， 但是該試劑盒只能同時檢測13種高危型HPV (16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和 68)，不能做到具體的分型。因此，仍然需要改進(jìn)的HPV檢測分型系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于，提供一組人乳頭瘤病毒DNA片段。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一組用于檢測和/或分型人乳頭瘤病毒的混合引 物及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供了一組人乳頭瘤病毒DNA片段組合，所述DNA片段組合包括如 SEQ ID NO :1-31 所示的 DNA序列，其分別來源自 HPV6、HPV 1UHPV 16,HPV 18,HPV 26,HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82 禾口 HPV 83。另一方面，本發(fā)明提供了能特異性擴(kuò)增出前述DNA片段組合中的至少一種DNA片ID NO :48-49、SEQ ID NO :50-51、SEQ IDNO
ID NO :56-57、SEQ ID NO :58_59、SEQ IDNO
ID NO :64-65、SEQ ID NO :66_67、SEQ IDNO
ID NO :72-73、SEQ ID NO :74_75、SEQ IDNO
ID NO :80-81、SEQ ID NO :82_83、SEQ IDNO
ID NO :88-89、SEQ ID NO:90_91、SEQ IDNO
36-37 或 44-45 或 52-53 或 60-61 或 68-69 或 76-77 或 84-85 或 92-93 或
段的引物，所述引物包括選自下列的一種或多種引物對1)HPV6 的引物對如 SEQ ID NO :32_33、SEQ ID NO 34-35、SEQ IDNO SEQ ID NO : 38-39所示的序列；2)HPV11 的引物對如 SEQ ID NO :40_41、SEQ ID NO :42_43、SEQ IDNO SEQ ID NO :46-47所示的序列；3)HPV16 的引物對如 SEQ SEQ ID NO : 54-55所示的序列；4)HPV18 的引物對如 SEQ SEQ ID NO 62-63所示的序列；5) HPV26 的弓 | 物對如 SEQ SEQ ID NO 70-71所示的序列；6) HPV31 的引物對如 SEQ SEQ ID NO 78-79所示的序列；7) HPV33 的弓 | 物對如 SEQ SEQ ID NO 86-87所示的序列；8) HPV35 的弓 | 物對如 SEQ SEQ ID NO 94-95所示的序列；9)HPV39 的引物對如 SEQ ID NO :96_97、SEQ ID NO :98_99、SEQ IDNO : 100-101 或SEQ ID NO : 102-103所示的序列；10)HPV40 的引物對如 SEQ ID NO 104-105、SEQ ID NO : 106-107、SEQ ID NO: 108-109 或 SEQ ID NO : 110-111 所示的序列；11)HPV42 的引物對如 SEQ ID NO 112-113、SEQ ID NO :114_115、SEQID NO: 116-117 或 SEQ ID NO :118-119 所示的序列12)HPV43 的引物對如 SEQ ID NO :120_121、SEQ ID NO : 122-123、SEQ ID NO 124-125 或 SEQ ID NO : 126-127 所示的序列13)HPV44 的引物對如 SEQ ID NO 132-133 或 SEQ ID NO : 134-135 所示的序列14)HPV45 的引物對如 SEQ ID NO 140-141 或 SEQ ID NO : 142-143 所示的序列15)HPV51 的引物對如 SEQ ID NO : 144-145 或 SEQ ID NO 146-147 所示的序列；16)HPV52 的引物對如 SEQ ID NO 148-149、SEQ ID NO :150_151、SEQ ID NO: 152-153 或 SEQ ID NO : 154-155 所示的序列；17)HPV53 的引物對如 SEQ ID NO 156-157、SEQ ID NO : 158-159、SEQ ID NO: 160-161 或 SEQ ID NO : 162-163 所示的序列；18)HPV54 的引物對如 SEQ ID NO 164-165、SEQ ID NO : 166-167、SEQ ID NO: 168-169 或 SEQ ID NO : 170-171 所示的序列；19)HPV55 的引物對如 SEQ ID NO 172-173、SEQ ID NO : 174-175、SEQ ID NO: 176-177 或 SEQ ID NO : 178-179 所示的序列；20)HPV56 的引物對如 SEQ ID NO 180-181、SEQ ID NO : 182-183、SEQ ID NO:
128-129、SEQ ID NO :130_131、SEQ ID NO
136-137, SEQ ID NO 138-139, SEQ ID NO184-185或SEQ ID NO : 186-187所示的序列
21)HPV58 的引物對如 SEQ ID NO188-189、SEQIDNO:190--191、SEQIDNO 192-193或SEQ ID NO : 194-195所示的序列
22) HPV59 的引物對如 SEQ ID NO196-197、SEQIDNO:198--199、SEQIDNO 200-201或SEQ ID NO : 202-203所示的序列
23)HPV61 的引物對如 SEQ ID NO204-205、SEQIDNO:206--207、SEQIDNO 208-209或SEQ ID NO : 210-211所示的序列
24) HPV66 的引物對如 SEQ ID NO212-213、SEQIDNO:214--215、SEQIDNO 216-217或SEQ ID NO : 218-219所示的序列
25) HPV68 的引物對如 SEQ ID NO220-221、SEQIDNO:222--223、SEQIDNO 224-225或SEQ ID NO : 226-227所示的序列
26) HPV70 的引物對如 SEQ ID NO228-229、SEQIDNO:230--231、SEQIDNO 232-233或SEQ ID NO : 234-235所示的序列
27)HPV72 的引物對如 SEQ ID NO236-237、SEQIDNO:238--239、SEQIDNO 240-241或SEQ ID NO : 242-243所示的序列
28) HPV73 的引物對如 SEQ ID NO244-245、SEQIDNO:246--247、SEQIDNO 248-249或SEQ ID NO : 250-251所示的序列
29)HPV81 的引物對如 SEQ ID NO252-253、SEQIDNO:254--255、SEQIDNO 256-257或SEQ ID NO : 258-259所示的序列
30) HPV82 的引物對如 SEQ ID NO260-261、SEQIDNO:262--263、SEQIDNO 264-265或SEQ ID NO : 266-267所示的序列以及
31)HPV83 的引物對如 SEQ ID NO268-269、SEQIDNO:270--271、SEQIDNO 272-273或SEQ ID NO :274-275所示的序列。
優(yōu)選地，所述的引物，其包括能特異性擴(kuò)增出前述DNA片段組合中至少分別源自HPV 16、HPV 18、HPV 3UHPV 33、HPV 35、HPV39、HPV 45,HPV 5UHPV 52,HPV56、HPV58、
HPV 59和HPV68的DNA序列的引物對。優(yōu)選地，所述的引物，其包括能特異性擴(kuò)增出前述DNA片段組合中至少分別源自 HPV 6、HPV 11、HPV 26、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV44、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 61、 HPV 66、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82 和 HPV83 的 DNA 序列的引物對。優(yōu)選地，所述的引物，其包括能特異性擴(kuò)增出前述DNA片段組合中分別源自HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82 和 HPV83 的 DNA 序列的全部 31種引物對。又一方面，本發(fā)明還提供了將前述的混合引物在制備用于檢測和/或分型人乳頭 瘤病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的引物用于檢測和/或分型人乳頭瘤病毒的試劑盒。優(yōu)選地，該試劑 盒還包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合緩沖液、核酸洗滌液和PCR反應(yīng)液。再一方面，本發(fā)明還提供了一種在體外對HPV進(jìn)行分型的方法，其包括以下步驟1)提取樣本DNA;2)使用前述的引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)；3)檢測反應(yīng)產(chǎn)物，其中步驟1)所 述的樣本，包括人或其他生物的體液或組織樣本。綜上所述，本發(fā)明選取31種常見類型的HPV穩(wěn)定存在的DNA片段，針對各DNA片 段設(shè)計出多對特異性引物，選取兩種或兩種以上DNA片段的引物混合后組成的混合引物， 能一次檢測出樣本中所含有的HPV，甚至是全部31種HPV?？梢?，本發(fā)明提供的用于檢測和 /或分型人乳頭瘤病毒DNA的31種HPV DNA片段，其應(yīng)用包括由針對該31種DNA片段而分 別設(shè)計出的兩種或多種特異性引物混合而成的混合引物，由兩種或多種混合引物制成的試 劑盒等工具，都具有檢測和/或分型HPV DNA的用途。本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明基于聚合酶鏈反應(yīng)PCR法，具有該方法簡單、易行、技術(shù)成熟、結(jié)果穩(wěn)定 且成本低的優(yōu)點；(2)已有的分析方法只能檢測13種以內(nèi)的重型HPV感染，對于13種重型感染意 外的HPV病毒感染均認(rèn)為是陰性，而本發(fā)明不但可以實現(xiàn)對31種HPV感染均一一分型，還 能糾正以往的分析方法中假陰性的誤斷，將混合感染患者所感染的各型HPV病毒一一檢測 出，更準(zhǔn)確的對HPV病毒感染作出體外檢測和分型；(3)本發(fā)明能一次同時檢測31種不同類型HPV DNA，大大提高了 HPV的檢測效率， 克服了血清學(xué)和免疫組化檢測方法對潛伏感染產(chǎn)生漏檢的缺陷，實現(xiàn)對有關(guān)HPV疾病的早 期診斷，適用于臨床檢測HPV基因及分型，以指導(dǎo)宮頸癌的防治；(4)本發(fā)明所采用的方法屬于一個HPV分型的基礎(chǔ)研究，也可將此技術(shù)用于其他 分型的檢測。不僅為進(jìn)一步研究HPV的分型提供了有力的基礎(chǔ)技術(shù)支持，還對其他病毒的 分型檢測提供了借鑒。


圖1為使用MEGA4. 0軟件制作的本發(fā)明31種HPV病毒的進(jìn)化樹模型。圖2A至圖2E為用31對單引物分別擴(kuò)增HPV DNA片段的電泳圖。圖3A至圖3E為用含31對引物的混合引物擴(kuò)增HPV DNA片段的電泳圖。圖4A至圖4E為用31對單引物分別擴(kuò)增HPV DNA片段作為對照，驗證含31對引物 的混合引物擴(kuò)增HPV DNA片段的電泳圖，其中A1 A7、B1 B6、C1 C7、D1 D7、E1 E4為混合引物擴(kuò)增，A1， A7，、B1， B6，、C1， C7，、D1， D7，、E1， E4，為作為對照 的單引物擴(kuò)增。圖5A至圖5D為臨床樣本驗證電泳圖，其中圖5A為用含31對引物的混合引物擴(kuò) 增臨床樣本1 3的電泳圖；圖5B為用31對單引物擴(kuò)增臨床樣本1的電泳圖；圖5C為用 31對單引物擴(kuò)增臨床樣本2的電泳圖；圖5D為用31對單引物擴(kuò)增臨床樣本3的電泳圖。下表將附圖中的代碼與其所對應(yīng)的病毒類型說明如下病毒型號代碼病萄〖型號代碼
HPV 58A1、A1，HPV43C4、C4，
HPV 35A2、A2，HPV44C5、C5，
HPV 33A3、A3，HPV11C6、C6，
HPV 68A4、A4，HPV40C7、C7，
HPV 45A5、A5，HPV82D1、D1，
HPV 31A6、A6，HPV81D2、D2，
HPV18A7、A7，HPV83D3、D3
HPV16B1、B1，HPV66D4、D4
HPV39B2、B2，HPV70D5、D5
HPV51B3、B3，HPV61D6、D6
HPV52B4、B4，HPV53D7、D7
HPV56B5、B5，HPV72E1、E1
HPV59B6、B6，HPV54E2、E2
HPV6C1、C1，HPV26E3、E3
HPV73C2、C2，HPV42E4、E4
HPV55C3、C3，
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中所使用的技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī) 技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人 員可以通過公共途徑獲得的。實施例1 31種HPV基因DNA片段的選擇將GenBank上公布的31種HPV病毒的基因組全部進(jìn)行基因比較，對比同源性，選 擇出本發(fā)明所提供的31種HPV基因DNA片段。31種HPV病毒的基因登錄號分別如下(見括號內(nèi)所示)HPV6 [X00203]、HPV 11[M14119]、HPV 16[K02718]、HPV 18 [X05015]、HPV 26 [X74472]、HPV 31 [J04353]、HPV 33 [M12732]、HPV 35 [X74477]、HPV 39 [M62849]、HPV 40 [X74478]、HPV 42 [M73236]、HPV 43 [AJ620205]、HPV 44 [U31788]、HPV 45 [X74479]、HPV 51 [M62877]、HPV 52[X74481]、 HPV 53 [X74482]、HPV 54 [U37488]、HPV 55 [U31791]、HPV 56 [X74483]、HPV 58[D90400]、 HPV 59[X77858]、HPV 61 [U31793]、HPV 66 [U31794]、HPV 68 [X67161]、HPV 70[U21941]、 HPV 72[X94164]、HPV 73 [X94165]、HPV 81 [AJ620209]、HPV 82[AB027021]禾口 HPV 83[AF151983]。根據(jù)同源性比較結(jié)果，使用MEGA4. 0軟件制作出各亞型HPV病毒的進(jìn)化樹模型，如 圖1所示，其原理是通過各個HPV亞型之間的基因比較，推導(dǎo)得出各亞型之間的進(jìn)化距離， 構(gòu)建一個進(jìn)化距離矩陣，基于該矩陣中的進(jìn)化距離關(guān)系構(gòu)建出進(jìn)化樹模型。最終選擇出本發(fā)明的31種HPV基因DNA片段序列，為SEQ ID NO 1_31所示的DNA 序列，其分別來源自 HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82 禾口 HPV 83。其中，所選取31種不同分型的HPV DNA片段同源性最低，大小不同，以便電泳區(qū)分 檢測結(jié)果。實施例2 設(shè)計出31種HPV基因DNA片段多對不同的引物設(shè)計引物之前，分析待測靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行 引物設(shè)計。寡核苷酸引物長度為15 30bp。引物的Tm值一般控制在55 60°C，盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般不超過2°C。有效引物中(G+C)的比例一般為40 60%。本發(fā)明用primer軟件進(jìn)行設(shè)計，并根據(jù)每個引物的得分多少進(jìn)行挑選。每個片段 選擇了 10對得分最高的引物進(jìn)行試驗，擴(kuò)增不出目的條帶的引物被刪除，重新進(jìn)行選擇。根據(jù)上述方法所設(shè)計出的實施例1所述全部31種人乳頭瘤病毒DNA片段的特異 性引物如下，括號內(nèi)為被擴(kuò)增序列起止位點1)HPV6 的引物對如 SEQ ID NO :32_33 (278-403)、SEQ ID NO :34_35 (7-108)、SEQ ID NO 36-37 (278-592)或 SEQ ID NO :38_39 (836-950)所示的序列；2)HPV11 的引物對如 SEQ ID NO :40_41 (114-454)、SEQ ID NO :42_43 (354-751)、 SEQ ID NO 44-45 (8-347)或 SEQ ID NO :46_47 (453-834)所示的序列；3)HPV16 的引物對如 SEQ ID NO :48_49 (38-434)、SEQ ID NO :50_51* (117-505)、 SEQ ID NO 52-53 (120-553)或 SEQ ID NO :54_55 (232-647)所示的序列；4)HPV18 的引物對如 SEQ ID NO :56_57 (39-243)、SEQ ID NO :58_59 (252-457)、 SEQ ID NO 60-61 (439-642)或 SEQ ID NO :62_63 (405-694)所示的序列；5) HPV26 的引物對如 SEQ ID NO :64_65 (65-265)、SEQ ID NO :66_67 (417-616)、 SEQ ID NO 68-69 (705-905)或 SEQ ID NO :70_71 (1228-1427)所示的序列；6)HPV31 的引物對如 SEQ ID NO 72-73 (24-382)、SEQ ID NO :74-75 (40-306)、SEQ ID NO 76-77 (127-366)或 SEQ ID NO :78_79 (351-690)所示的序列；7) HPV33 的引物對如 SEQ ID NO :80_81 (28-219)、SEQ ID NO :82_83 (129-337)、 SEQ ID NO 84-85 (317-512)或 SEQ ID NO :86_87 (339-525)所示的序列；8)HPV35 的引物對如 SEQ ID NO :88_89 (28-302)、SEQ ID NO :90_91 (53-321)、SEQ ID NO 92-93 (46-699)或 SEQ ID NO :94_95 (1294-1460)所示的序列；9) HPV39 的引物對如 SEQ ID NO :96_97 (4-439)、SEQ ID NO :98_99 (34-461)、SEQ ID NO 100-101 (145-582)或 SEQ ID NO : 102-103 (554-887)所示的序列；10)HPV40 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 104-105 (10-595)、SEQ ID NO: 106-107(22-613)、SEQ ID NO : 108-109 (137-733)或 SEQ ID NO : 110-111 (440-1044)所示 的序列；11)HPV42 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 112—113 (15—267)、SEQ ID NO: 114-115(23-273)、SEQ ID NO : 116-117 (127-371)或 SEQ ID NO : 118-119 (243-495)所示的 序列；12)HPV43 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 120-121 (44-271)、SEQ ID NO: 122-123(125-360)、SEQ ID NO : 124-125 (102-335)或 SEQ ID NO : 126-127 (458-687)所示 的序列；13)HPV44 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 128—129 (1—288)、SEQ ID NO: 130-131 (54-339)、SEQ ID NO :132_133 (133-420)或 SEQ ID NO : 134-135 (341-636)所示的 序列；14)HPV45 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 136-137 (135-363)、SEQ ID NO: 138-139(440-686)、SEQ ID NO : 140-141 (613-819)或 SEQ ID NO : 142-143 (794-1130)所示 的序列；15)HPV51 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 144-145 (10-335)或 SEQ ID NO:146-147(19-344)所示的序列；16)HPV52 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 148-149 (37-221)、SEQ ID NO: 150-151 (64-254)、SEQ ID NO : 152-153 (209-390)或 SEQ ID NO : 154-155 (608-795)所示的 序列；17)HPV53 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 156-157 (37-221)、SEQ ID NO: 158-159(65-242)、SEQ ID NO : 160-161 (328-498)或 SEQ ID NO : 162-163 (742-938)所示的 序列；18)HPV54 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 164-165 (82-262)、SEQ ID NO: 166-167(259-452)、SEQ ID NO :168_169 (534-711)或 SEQ ID NO : 170-171 (563-753)所示 的序列；19)HPV55 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 172—173 (1 — 193)、SEQ ID NO: 174-175(50-242)、SEQ ID NO :176_177 (146-341)或 SEQ ID NO : 178-179 (450-634)所示的 序列；20)HPV56 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 180-181 (19-188)、SEQ ID NO: 182-183(58-227)、SEQ ID NO : 184-185 (79-249)或 SEQ ID NO : 186-187 (180-300)所示的 序列；21)HPV58 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 188-189 (36-140)、SEQ ID NO: 190-191 (97-203)、SEQ ID NO : 192-193 (108-212)或 SEQ ID NO : 194-195 (651-756)所示的 序列；22)HPV59 的弓 | 物對如 SEQ ID NO 196—197 (1 — 114)、SEQ ID NO: 198-199(34-148)、SEQ ID NO :200_201 (25-134)或 SEQ ID NO :202_203 (248-357)所示的 序列；23)HPV61 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :204_205 (20-471)、SEQ ID NO: 206-207(42-512)、SEQ ID NO :208_209 (62-538)或 SEQ ID NO :210_211 (243-700)所示的 序列；24)HPV66 的引物對如 SEQ ID NO :212_213 (11-242)、SEQ ID NO: 214-215(48-281)、SEQ ID NO :216_217 (200-443)或 SEQ ID NO :218_219 (223-467)所示的 序列；25)HPV68 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :220_221 (12-141)、SEQ ID NO: 222-223(34-163)、SEQ ID NO :224_225 (193-310)或 SEQ ID NO :226_227 (1298-1427)所示 的序列；26)HPV70 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :228_229 (8—258)、SEQ ID NO: 230-231 (18-269)、SEQ ID NO :232_233 (215-465)或 SEQ ID NO :234_235 (398-649)所示的 序列；27)HPV72 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :236_237 (14-142)、SEQ ID NO: 238-239(39-177)、SEQ ID NO :240_241 (120-261)或 SEQ ID NO :242_243 (254-383)所示的 序列；28)HPV73 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :244_245 (24-199)、SEQ ID NO: 246-247(33-207)、SEQ ID NO :248_249 (104-277)或 SEQ ID NO :250_251 (323-502)所示的序列；29)HPV81 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :252_253 (14-130)、SEQ ID NO: 254-255(115-229)、SEQ ID NO :256_257 (147-261)或 SEQ ID NO :258_259 (203-322)所示 的序列；30)HPV82 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :260_261 (1 — 102)、SEQ ID NO: 262-263(19-121)、SEQ ID NO :264_265 (103-205)或 SEQ ID NO :266_267 (379-480)所示的 序列；以及31)HPV83 的弓 | 物對如 SEQ ID NO :268_269 (17—306)、SEQ ID NO: 270-271(55-344)、SEQ ID NO :272_273 (84-269)或 SEQ ID NO :274_275 (205-489)所示的 序列。實施例3 用31對單引物分別擴(kuò)增31個HPV DNA模板用根據(jù)實施例2所設(shè)計的31對特異性引物分別對其相應(yīng)的31個HPVDNA模板單 獨進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。所用引物對為 SEQ ID NO 32-33, SEQ IDN0 40-41、SEQ ID NO 48-49、 SEQ ID NO :56-57、SEQ ID NO :64_65、SEQ ID NO :72_73、SEQ ID NO :80_81、SEQ ID NO 88-89,SEQ ID NO 96-97,SEQ ID NO : 104-105、SEQ ID NO :112_113、SEQ ID N0:120_121、 SEQ ID NO : 128-129、SEQ ID NO : 136-137、SEQ ID NO : 144-145、SEQID NO : 148-149、SEQ ID NO :156-157、SEQ ID NO :164_165、SEQ ID NO :172_173、SEQ ID NO :180_181、SEQ ID NO : 188-189、SEQ ID NO : 196-197、SEQ ID NO :204_205、SEQ ID NO :212_213、SEQ ID NO :220-22U SEQID NO -.228-229, SEQ ID NO :236_237、SEQ ID NO 244-245, SEQ ID NO 252-253、SEQ ID NO :262_261 和 SEQ ID NO :268_269。1)單引物PCR擴(kuò)增a)在 200 u L Eppendorf 管內(nèi)配制 25 ii L 反應(yīng)體系其中的2Xbuffer 包括 MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl (pH 8. 8，25°C ) 20mmol/L、KC1 30mmol/L、(NH4) 2S04 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA 多聚酶 0. 08U/ii L。b) PCR 條件第一階段94°C，2分鐘；第二階段94°C，20 秒；60°C，30 秒；72°C，45 秒；共 30 個循環(huán)；第三階段72 °C，2分鐘。2)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的正確性a)制備2 %的瓊脂糖凝膠將0.8g瓊脂糖中加入1XTAE 40mL，煮沸使其溶解后，冷卻至50°C，加入染料 0. 5iiL，混勻后倒膠。b)電泳 設(shè)置電壓150V,時間20min ；點樣10iiL樣品+liiL 6 X loading buffer (上海生工)，markerl (上海生工，片 段大小為分別為100、200、300、400、500、600、700bp)4iiL ；電泳結(jié)束后在紫外儀下觀察結(jié) 果，如圖2A至圖2E所示，為用31對單引物分別擴(kuò)增HPV DNA模板的電泳圖，表明使用所設(shè) 計的引物均能擴(kuò)增出HPV DNA片段。實施例4 用混合引物分別擴(kuò)增31個HPV DNA模板單引物驗證結(jié)果正確后，將實施例3所使用的31對引物以1 1的比例混合(單 引物的終濃度稀釋了 3倍)形成混合引物，用于本實施例中。1)混合引物PCR擴(kuò)增a)在 200 ii L Eppendorf 管內(nèi)配制 25 ii L 反應(yīng)體系 其中的2Xbuffer 包括 MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl (pH 8. 8，25°C ) 20mmol/L、KC1 30mmol/L、(NH4) 2S04 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA 多聚酶 0. 08U/ii L。b) PCR 條件第一階段94°C，2分鐘；第二階段94°C，20 秒；60°C，30 秒；72°C，45 秒；共 30 個循環(huán)；第三階段72 °C，2分鐘。2)聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠(PAGE)電泳檢測PCR產(chǎn)物的正確性a)制備5 %的PAGE凝膠 b)電泳用混合引物PCR擴(kuò)增的片段大小、亮度必須與單獨引物擴(kuò)增的結(jié)果一致且沒有雜
市o設(shè)置電壓100V,時間30min ；點樣10iiL樣品+liiL 6 X loading buffer (上海生工)，markerl (上海生工，片 段大小為分別為100、200、300、400、500、600、700bp)4ii L ；洗膠蒸餾水洗一10%乙醇洗一1% HN03洗一蒸餾水洗一0. 2% AgN03于脫色搖床上脫 色30min —雙蒸水10s/次洗2次一3% Na2C03+0. 15%甲醛于脫色搖床上顯色5min —蒸餾 水洗一3%乙酸lOmin停止顯色。
電泳結(jié)束后在紫外儀下觀察結(jié)果，如圖3A至圖3E所示，為用含31對引物的混合 引物擴(kuò)增HPV DNA片段的電泳圖。從圖中可以看出，使用所設(shè)計的混合引物能擴(kuò)增出對應(yīng) 的HPV DNA片段。實施例5 用混合引物分別擴(kuò)增31個HPV DNA模板，以單引物擴(kuò)增的31個PCR產(chǎn) 物做為對照品進(jìn)行電泳驗證將實施例3中單引物擴(kuò)增的31個PCR產(chǎn)物做為對照品(可用凝膠純化試劑盒回 收并濃縮)，驗證用混合引物分別擴(kuò)增31個HPV DNA模板(樣品)的準(zhǔn)確性。測序膠電泳驗證對照品和樣品的操作方法如下a)用去污劑溶液清洗玻璃板和間隔條，用自來水徹底沖洗后，再用蒸餾水沖洗，最 后用乙醇沖洗板并晾干(必須徹底洗凈玻璃板，以確保灌膠時不會產(chǎn)生氣泡)。b)測序板的硅化處理長板(親和硅烷)lmL涂滿長板，涂勻，5min后用95%乙醇洗3次，去多余的親和 娃燒；短板(剝離硅烷)更換手套，避免與親和硅烷交叉污染；1.5mL涂滿短板，涂勻， lOmin后用干凈鏡頭紙檫去多余的剝離硅烷。c)裝板與封邊將板的兩側(cè)及底邊封嚴(yán)，在灌膠時不至于漏膠。將板的兩側(cè)放置好0. 4mm的塑料 間隔邊條，安裝固定用夾板，底用透明膠帶封好，防止?jié)B漏。d)測序凝膠的灌制制備(60mL 5%的PAGE膠), 混勻后倒入夾板中，不要留有氣泡。測序凝膠的銀染染色過程要求凝膠浸在塑料 盤中，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。e)電泳設(shè)置電壓1500V,時間 30min ；點樣10iiL 樣品+2ii L6Xloading buffer (上海生工)，markerl (上海生工，片 段大小為分別為100、200、300、400、500、600、700bp)4ii L ；電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在短玻璃板 上。f)洗膠蒸餾水洗一10%乙醇洗一1% HN03洗一蒸餾水洗一0. 2% AgN03于脫色搖床上脫 色30min —雙蒸水10s/次洗2次一3% Na2C03+0. 15%甲醛于脫色搖床上顯色5min —蒸餾 水洗一3%乙酸lOmin停止顯色。將混合弓丨物的31個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和對照品(31個模板DNA)與marker進(jìn)行對照，檢測混合引物擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖4A至圖4E所示，表明混合引物能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增 出對應(yīng)單引物擴(kuò)增的HPV DNA片段。實施例6 多重PCR擴(kuò)增試劑盒的組成本發(fā)明所提供的試劑盒成分如下試劑盒由一個拭子，一個10mL試管，一個200iiL PCR管，A、B、C、D四瓶試劑組成，
各試劑分別詳述如下A液細(xì)胞裂解液，52mL，每次用lmL，設(shè)計用量50次；
B液核酉I結(jié)合緩沖液，52mL,每次用lmL，設(shè)計用量50次；
C液核酉堯洗滌液，52mL,每次用lmL，設(shè)計用量50次；
D液:PCR反應(yīng)液，0. 8mL,每次用13. 5uL，設(shè)計用量50次。
其中的2Xbuffer 包括 MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl (pH 8. 8，25°C ) 20mmol/L、KC1 30mmol/L、(NH4) 2S04 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA 多聚酶 0. 08U/ii L。實施例7 :PCR擴(kuò)增試劑盒的操作步驟本發(fā)明實施例6所提供的多重PCR擴(kuò)增試劑盒的操作步驟如下a)使用拭子刮取適量的待測細(xì)胞，加入10mL試管中，試管中已加入了 5mL細(xì)胞洗 滌液和5ml生理鹽水，輕輕轉(zhuǎn)動拭子，將待測細(xì)胞洗下；b)低速離心后細(xì)胞沉入管底，抽出上清，加入A液，室溫條件下作用10分鐘，裂解 掉待測細(xì)胞，釋放DNA;c)加入B液和核酸吸附填料，混合均勻，微微振動，在合適的離子強度下，核酸結(jié) 合到填料上；d)加入溶液C洗掉多余的不結(jié)合雜質(zhì)，即成為待檢測的細(xì)胞樣品；e)將細(xì)胞樣品1 y L溶于10. 5 y L蒸餾水中，與D液混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；實施例8 對臨床樣本的驗證使用混合引物對3個臨床樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分別使用31對單引物對這3個臨 床樣本分別進(jìn)行擴(kuò)增作為對照，驗證混合引物的擴(kuò)增結(jié)果。
使用實施例6所提供的多重PCR擴(kuò)增試劑盒，分別擴(kuò)增3個臨床樣本，具體操作方 法如下a)樣本的制備用一次性宮頸拭子取病人子宮頸組織表面細(xì)胞，溶于10ml生理鹽 水中，混合均勻后，取1ml于滅菌的1. 5ml離心管中，12000r/min離心2min，去上清。b)裂解將細(xì)胞液低速離心，1000r/min, 15min。抽出上清液，加入A液1ml，室溫 條件下裂解lOmin。c)吸附加入核酸吸附填料和B液1ml，微微振動，混合均勻，使核酸結(jié)合到填料 上，抽出上清液。d)沖洗在吸附填料上加入C液1ml，洗掉多余的不結(jié)合雜質(zhì)，抽出上清液。e) DNA原位提取在吸附填料上加入D液1管，溶膜釋放DAN。f)PCR反應(yīng)將25UL上清液加入EP管中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為第一階段 94°C，2分鐘；第二階段94°C，20秒；50°C，30秒；72°C，45秒；共30個循環(huán)；第三階段72°C， 2分鐘。參照實施例5所提供的方法對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序膠電泳驗證，結(jié)果如圖5A至 圖5D所示。 用混合弓丨物擴(kuò)增臨床樣本1、2和3的電泳圖，如圖5A所示。從圖5A可以看出，樣 本1擴(kuò)增出一條片段，樣本2擴(kuò)增出兩條目標(biāo)片段，樣本3可見三條目標(biāo)片段，以上擴(kuò)增出 的目標(biāo)片段，分別表明該臨床患者至少感染的HPV病毒分型數(shù)。用31對單引物擴(kuò)增臨床樣本1的電泳圖，如圖5B所示。由圖可知，從臨床樣本1 中擴(kuò)增出E1片段，與混合引物擴(kuò)增結(jié)果相同，表明臨床樣本1中感染的HPV病毒為HPV26。用31對單引物擴(kuò)增臨床樣本2的電泳圖，如圖5C所示。由圖可知，從臨床樣本中 擴(kuò)增出D2和D3片段，與混合引物擴(kuò)增結(jié)果相同，表明臨床樣本2中感染的HPV病毒為HPV81 和 HPV 83。用31對單引物擴(kuò)增臨床樣本3的電泳圖，如圖5D所示。由圖可知，從臨床樣本中 擴(kuò)增出E2、E3和E4片段，與混合引物擴(kuò)增結(jié)果相同，表明臨床樣本3中感染的HPV病毒為 HPV54.HPV26 和 HPV42。以上結(jié)果表明，采用本發(fā)明所提供的混合引物及其試劑盒可以有效的擴(kuò)增出臨床 樣本中的HPV病毒片段并對其進(jìn)行分型。序列表<110> 白向陽寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司<120>人乳頭瘤病毒DNA片段、特異性引物及其應(yīng)用<130>DIC08110160<160>275<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1503<212>DNA<213>HPV6 片段
<400>1
atgtggcggcctagcgacagcacagtatatgtgcctcctcctaaccctgtatccaaagtt60
gttgccacggatgcttatgttactcgcaccaacatattttatcatgccagcagttctaga120
cttcttgcagtgggtcatccttatttttccataaaacgggctaacaaaactgttgtgcca180
aaggtgtcaggatatcaatacagggtatttaaggtggtgttaccagatcctaacaaattt240
gcattgcctgactcgtctctttttgatccc3.C3.3.C3.C3.3.Cgtttggtatgggcatgcaca300
ggcctagaggtgggcaggggacagccattaggtgtgggtgtaagtggacatcctttccta360
aataaatatgatgatgttgaaaattcagggagtggtggtaaccctggacaggataacagg420
gttaatgttggtatggattataaacaaacacaattatgcatggttggatgtgccccccct480
ttgggcgagcattggggtaaaggtaaacagtgtactaatacacctgtacaggctggtgac540
tgcccgcccttagaacttattaccagtgttatacaggatggcgatatggttgacacaggc600
tttggtgctatgaattttgctgatttgcagaccaataaatcagatgttcctatttacata660
tgtggcactacatgtaaatatccagattatttacaaatggctgcagacccatatggtgat720
agattatttttttttctacggaaggaacaaatgtttgccagacatttttttaacagggct780
ggcgaggtgggggaacctgtgcctgatactcttataattaagggtagtggaaatcgaacg840
tctgtagggagtagtatatatgttaacaccccaagcggctctttggtgtcctctgaggca900
caattgtttaataagccatattggctacaaaaagcccagggacataacaatggtatttgt960
tggggtaatcaactgtttgttactgtggtagataccacacgcagtaccaacatgacatta1020
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catgtggaagagtatgatttacaatttatttttcaattatgtagcattacattgtctgct1140
gaagtaatggcctatattcacacaatgaatccctctgttttggaagactggaactttggg1200
ttatcgcctcccccaaatggtacattagaagatacctataggtatgtgcagtcacaggcc1260
attacctgtcaaaagcccactcctgaaaaggaaaagccagatccctataagaaccttagt1320
ttttgggaggagaaaagttttctagtgaattggatcagtatcctttggga1380
cgcaagtttttgttacaaagtggatataggggacggtcctctattcgtaccggtgttaag1440
cgccctgctgtttccaaagcctctgctgcccctaaacgtaagcgcgccaaaaccaaaagg1500
taa1503
<210>2
<211>1506
<212>DNA
<213>HPV11片段
<400>2
atgtggcggcctagcgacagcacagtatatgtgcctcctcccaaccctgtatccaaggtt60
gttgccacggatgcgtatgttaaacgcaccaacatattttatcacgccagcagttctaga120
ctccttgctgtgggacatccatattactctatcaaaaaagttaacaaaacagttgtacca180
aaggtgtctggatatcaatatagagtgtttaaggtagtgttgccagatcctaacaagttt240
gcattacctgattcatctctgtttgaccccactacacagcgtttagtatgggcgtgcaca300
gggttggaggtaggcaggggtcaacctttaggcgttggtgttagtgggcatccattgcta360
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accataggccctcgcaaacgttctgctcca
cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa
<210>5
<211>1512
<212>DNA
<213>HPV26片段
<400>5
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gttgtcaacacggatgaatatgtaactcgc
cgtttattaacattaggacatccatatttt
attcctaaggtatctgcctatcagtacagg
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72CN 10851630 A說[2401<210>241[2402<211>25[2403<212>DNA[2404<213>人工序列[2405<400>241[2406aggcaaagca aatttattgg gatca[2407<210>242[2408<211>24[2409<212>DNA[2410<213>人工序列[2411<400>242[2412ctttgcctga tggcacactttaca[2413<210>243[2414<211>25[2415<212>DNA[2416<213>人工序列[2417<400>243[2418tccaagcgat tatacaaggggtgac[2419<210>244[2420<211>21[2421<212>DNA[2422<213>人工序列[2423<400>244[2424gataaggagc gcctagtatgg[2425<210>245[2426<211>26[2427<212>DNA[2428<213>人工序列[2429<400>245[2430tctgggtatt tacaggtagtgttaga[2431<210>246[2432<211>25[2433<212>DNA[2434<213>人工序列[2435<400>246[2436aggtatacct gccccctgtgtctgt[2437<210>247[2438<211>25[2439<212>DNA
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權(quán)利要求
一組人乳頭瘤病毒DNA片段組合，其特征在于，所述DNA片段組合包括如SEQ ID NO1-31所示的31種DNA序列，其分別來源自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。
2.能特異性擴(kuò)增出權(quán)利要求1所述DNA片段組合中的至少一種DNA片段的引物，所述 引物包括選自下列的一種或多種引物對1)HPV6的引物對如 SEQ ID NO 32-33、SEQ ID NO 34-35、SEQ IDNO 36-37 或 SEQ ID NO 38-39所示的序列；2)HPVll的引物對如 SEQ ID NO :40_41、SEQ ID NO :42_43、SEQ IDNO 44-45 或 SEQ ID NO 46-47所示的序列；3)HPV16 的引物對如 SEQ ID NO :48_49、SEQ ID NO 50-51、SEQ IDNO 52-53 或 SEQ ID NO 54-55所示的序列；4)HPV18的引物對如 SEQ ID NO :56_57、SEQ ID NO :58_59、SEQ IDNO :60_61 或 SEQ ID NO 62-63所示的序列；5)HPV26的引物對如 SEQ ID NO 64-65、SEQ ID NO 66-67、SEQ IDNO 68-69 或 SEQ ID NO 70-71所示的序列；6)HPV31的引物對如 SEQ ID NO 72-73、SEQ ID NO 74-75、SEQ IDNO 76-77 或 SEQ ID NO 78-79所示的序列；7)HPV33的引物對如 SEQ ID NO :80_81、SEQ ID NO :82_83、SEQ IDNO :84_85 或 SEQ ID NO 86-87所示的序列；8)HPV35的引物對如 SEQ ID NO :88_89、SEQ ID NO :90_91、SEQ IDNO :92_93 或 SEQ ID NO 94-95所示的序列；9)HPV39的引物對如 SEQ ID NO 96-97、SEQ ID NO :98_99、SEQ IDNO 100-101 或 SEQ ID NO 102-103所示的序列；10)HPV40的引物對如 SEQ ID NO 104-105,SEQ ID NO 106-107,SEQ ID NO 108-109 或SEQ ID NO 110-111所示的序列；11)HPV42的引物對如 SEQ ID NO 112-113、SEQ ID NO 114-115、SEQID NO: 116-117 或SEQ ID NO 118-119所示的序列；12)HPV43的引物對如 SEQ ID NO :120_121、SEQ ID NO :122_123、SEQ ID NO :124_125 或SEQ ID NO 126-127所示的序列；13)HPV44的引物對如 SEQ ID NO :128_129、SEQ ID NO :130_131、SEQ ID NO 132-133 或SEQ ID NO 134-135所示的序列；14)HPV45的引物對如 SEQ ID NO :136_137、SEQ ID NO 138-139,SEQ ID NO 140-141 或SEQ ID NO 142-143所示的序列；15)HPV51的引物對如 SEQ ID NO 144-145 或 SEQ ID NO 146-147 所示的序列；16)HPV52的引物對如 SEQ ID NO 148-149,SEQ ID NO :150_151、SEQ ID NO :152_153 或SEQ ID NO 154-155所示的序列；17)HPV53的引物對如 SEQ ID NO 156_157、SEQ ID NO :158_159、SEQ ID NO 160-161或SEQ ID NO 162-163所示的序列；18)HPV54的引物對如 SEQ ID NO 164-165,SEQ ID NO :166_167、SEQ ID NO :168_169 或SEQ ID NO 170-171所示的序列；19)HPV55的引物對如 SEQ ID NO :172_173、SEQ ID NO :174_175、SEQ ID NO 176-177 或SEQ ID NO 178-179所示的序列；20)HPV56的引物對如 SEQ ID NO :180_181、SEQ ID NO 182-183,SEQ ID NO 184-185 或SEQ ID NO 186-187所示的序列；21)HPV58的引物對如 SEQ ID NO 188-189,SEQ ID NO :190_191、SEQ ID NO 192-193 或SEQ ID NO 194-195所示的序列；22)HPV59的引物對如 SEQ ID NO 196-197,SEQ ID NO :198_199、SEQ ID NO :200_201 或SEQ ID NO 202-203所示的序列；23)HPV61的引物對如SEQ ID NO :204_205、SEQ ID NO :206_207、SEQ ID NO 208-209 或SEQ ID NO 210-211所示的序列；24)HPV66的引物對如 SEQ ID NO :212_213、SEQ ID NO :214_215、SEQ ID NO :216_217 或SEQ ID NO 218-219所示的序列；25)HPV68的引物對如 SEQ ID NO 220-221、SEQ ID NO 222-223、SEQ ID NO 224-225 或SEQ ID NO 226-227所示的序列；26)HPV70的引物對如 SEQ ID NO 228-229、SEQ ID NO 230-231、SEQ ID NO :232_233 或SEQ ID NO 234-235所示的序列；27)HPV72的引物對如 SEQ ID NO :236_237、SEQ ID NO :238_239、SEQ ID NO :240_241 或SEQ ID NO 242-243所示的序列；28)HPV73的引物對如 SEQ ID NO 244-245、SEQ ID NO :246_247、SEQ ID NO 248-249 或SEQ ID NO 250-251所示的序列；29)HPV81的引物對如SEQ ID NO :252_253、SEQ ID NO 254-255、SEQ ID NO :256_257 或SEQ ID NO 258-259所示的序列；30)HPV82的引物對如 SEQ ID NO 260-261、SEQ ID NO 262-263、SEQ ID NO 264-265 或SEQ ID NO :266-267所示的序列；以及31)HPV83的引物對如 SEQ ID NO 268-269、SEQ ID NO :270_271、SEQID NO :272_273 或SEQ ID NO 274-275所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，其至少包括能特異性擴(kuò)增出權(quán)利要求1 所述DNA 片段組合中分別來源自 HPV 16, HPV 18、HPV31、HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45、 HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59 禾口 HPV 68 的 DNA 序列的引物對。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，其至少包括能特異性擴(kuò)增出權(quán)利要求1所 述 DNA 片段組合中分別來源自 HPV 6, HPV 11、HPV26、HPV 40,HPV 42, HPV 43,HPV 44, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 6UHPV 66, HPV 70, HPV 72, HPV 73, HPV 81, HPV 82 和 HPV83 的 DNA序列的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，其包括能特異性擴(kuò)增出權(quán)利要求1所述 DNA 片段組合中分別來源自 HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV/55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83的DNA序列的全部31種引物對。
6.權(quán)利要求2至5中任一項所述的引物在制備用于檢測和/或分型人乳頭瘤病毒的產(chǎn) 品中的用途。
7.包括權(quán)利要求2至5中任一項所述的引物的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其還包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合緩沖 液、核酸洗滌液和PCR反應(yīng)液。
9.一種在體外對HPV進(jìn)行分型的方法，其包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)使用利要求2至5中任一項所述的引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)；3)檢測反應(yīng)產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中所述的步驟1)的樣本，包括人或其 他生物的體液或組織樣本。
全文摘要
本發(fā)明提供人乳頭瘤病毒DNA片段、用于人乳頭瘤病毒DNA檢測和/或分型的混合引物及其應(yīng)用。所述混合引物能特異性的擴(kuò)增出一種或多種來源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列，可用于人乳頭瘤病毒DNA的檢測和/或分型，該混合引物還可制成PCR試劑盒。本發(fā)明能一次檢測出常見類型的HPV，大大提高了HPV的檢測效率，克服了血清學(xué)和免疫組化檢測方法對潛伏感染產(chǎn)生漏檢的缺陷，實現(xiàn)對有關(guān)HPV疾病的早期診斷，適用于臨床HPV基因檢測及分型，以指導(dǎo)宮頸癌的防治。
文檔編號C12Q1/70GK101851630SQ200910132358
公開日2010年10月6日 申請日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者白向陽, 趙珊珊 申請人:白向陽;寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司