用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)記及特異性引物和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)記及特異性引物和應(yīng)用。所述分子標(biāo)記與Rf基因遺傳距離為0.7cM與該基因緊密連鎖，其特異性上下游引物為：MI16的上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，MI16的下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。M16標(biāo)記能夠很快鑒別出甜椒中的Rf基因，更好的補(bǔ)充了甜椒在雄性不育方向的研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)巧及特異性引物和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體設(shè)及用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)記及特異性引 物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS,切toplasmic male sterility)^系配套雜交制種是 省去辣椒制種人工去雄成本的有效方法。由于辣椒生產(chǎn)W果實(shí)為收獲對(duì)象，若父本雄性不 育恢復(fù)系其育性恢復(fù)力不強(qiáng)，則會(huì)導(dǎo)致果實(shí)種子量不足，從而嚴(yán)重影響雜交Fi代商品辣椒 果實(shí)的外觀和產(chǎn)量。因此細(xì)胞質(zhì)雄性不育強(qiáng)恢復(fù)性?xún)?yōu)良父本(恢復(fù)系）的選育是辣椒CMS利 用中關(guān)鍵問(wèn)題之一。
[0003] 辣椒雄性不育恢復(fù)性主要受位于辣椒6號(hào)染色體上的主效基因 Rf (Fertility restorer)控制，但是辣椒中Rf分布不夠廣泛，在無(wú)辣味的辣椒(甜椒）中更不多見(jiàn)，而且傳 統(tǒng)的辣椒CMS恢復(fù)系轉(zhuǎn)育過(guò)程中需要測(cè)交評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)育周期長(zhǎng)，限制了辣椒CMS的應(yīng)用。辣椒強(qiáng) 恢復(fù)系的選育和與Rf緊密連鎖分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，是解決辣椒CMS育種應(yīng)用瓶頸的有 效方法。
[0004] 辣椒中已報(bào)道了多個(gè)與Rf緊密連鎖的不同類(lèi)型的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)與辣椒Rf遺傳距 離更近的共顯性分子標(biāo)記，對(duì)更好利用辣椒CMS進(jìn)行育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種與辣椒Rf基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用分子標(biāo)記鑒定辣椒的育性的方法，W提高辣椒 的育種進(jìn)程和育種效果。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的可用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)記通過(guò)W下步驟獲得：
[000引 W辣椒可育親本0601M和不育親本77013A及其構(gòu)建的：B巧F2群體為試驗(yàn)材料，研 究輔助辣椒恢復(fù)基因的分子標(biāo)記。利用辣椒基因組重測(cè)序結(jié)果比對(duì)到辣椒CM334基因組信 息6號(hào)染色體上化ttp: //passpo;rt. pepper. snu. ac. k;r/?t = PGEN0ME/);獲取已發(fā)表的有關(guān) Rf基因標(biāo)記之間的DM序列并利用其開(kāi)發(fā)標(biāo)記，共開(kāi)發(fā)233對(duì)SSR引物和76對(duì)Indel引物，經(jīng) 過(guò)初篩，其中8對(duì)在雙親及群體中表現(xiàn)多態(tài)性。通過(guò)與BC5F2群體育性表型對(duì)應(yīng)，將目標(biāo)基因 定位在Indel標(biāo)記MI16旁，遺傳距離為0.7cM。利用此分子標(biāo)記在新群體中進(jìn)行辣椒育性的 鑒定，可W有效地用來(lái)輔助育種工作。
[0009] MI16上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCCdMI16的下游引物序列為： GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT
[0010] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子輔助育種技術(shù)在辣椒的品種選育和育性的鑒定中得 到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。利用MI16引物可W在辣椒的苗期通過(guò)分子的手段確定辣椒的育性， 為辣椒的育種節(jié)約了人力物力。0601M屬于甜椒品系，M16標(biāo)記能夠很快鑒別出甜椒中的Rf 基因，更好的補(bǔ)充了甜椒在雄性不育方向的研究。通過(guò)利用本發(fā)明提供的特異性引物采用 PCR和凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)待測(cè)辣椒基因組DM:擴(kuò)增Inde 1標(biāo)記MI 16，在辣椒不育親本中克隆 得到約13化P的片段，可育親本中得到l(K)bp的片段。由于片段長(zhǎng)度較短并且差異較大，通過(guò) 凝膠電泳技術(shù)能夠很快分辨辣椒植株的育性。MI16引物與Rf基因遺傳距離為0.7cM與該基 因緊密連鎖，能較準(zhǔn)確判斷辣椒育性。本發(fā)明提供了分子標(biāo)記在辣椒分子標(biāo)記輔助育種中 的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[00川圖1顯示MI16標(biāo)記在親本和F1中擴(kuò)增結(jié)果。
[0012] 圖2顯示MI16標(biāo)記在BC5F2群體部分單株擴(kuò)增結(jié)果。注:M:5化P marke;r;a:與不育 親本77013條帶相同;b:與可育親本0601M條帶相同;h:為雜合樣品與F1相同。
[001引圖3顯示MI16標(biāo)記與Rf基因連鎖關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0014] W下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[001引實(shí)施例1
[0016] W辣椒不育親本77013A和可育親本0601M及其F1同77013回交多次構(gòu)建的BCsF2群 體（（77013AX0601M)X77013)為試驗(yàn)材料。
[0017] 辣椒Rf基因遺傳群體構(gòu)建
[001引 W辣椒不育親本77013A(Capsicum annuum L.)及辣椒恢復(fù)系材料0601M (Capsicum annmim L.)為雙親，雜交后獲得F1，F(xiàn)1與77013回交多次獲得的BC日F2群體 ((77013AX0601M)X77013)為作圖群體，共741個(gè)單株。
[0019] 1、基因組DNA的提取
[0020] 用CTAB法提取BC5F2所有單株、親本及F1的基因組DNA，用Biospec-nano微量分光 光度計(jì)測(cè)定濃度和質(zhì)量，將濃度稀釋至l(K)ngAU。
[0021] 2、Inde 1 標(biāo)記開(kāi)發(fā)
[0022] 利用已知辣椒的標(biāo)記對(duì)應(yīng)的比對(duì)到辣椒CM334和Zunla基因組信息6號(hào)染色體上 (http ://passport . pepper . snu . ac . kr/?t = PGEN0ME/；http:// peppersequence. genomics. cn/page/species/index. jsp)，獲取兩標(biāo)記之間的DNA序列并 利用其開(kāi)發(fā)標(biāo)記，設(shè)計(jì)Indel引物，W親本DNA為模板，對(duì)Indel引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選 至化對(duì)具有多態(tài)性的標(biāo)記，再W篩選到的多態(tài)性的標(biāo)記對(duì)BCsF2群體進(jìn)行分析，運(yùn)8對(duì)引物均 與Rf基因連鎖。其中Inde 1標(biāo)記MI16是與辣椒Rf基因連鎖最緊密的分子標(biāo)記。
[0023] PCR擴(kuò)增體系（10化）：DNA(100ng/化)0.扣L，10xGreenMix扣L，上游引物（10i^M/ 化)0.化L，下游引物（1 OiiM/iiL) 0.5化，d地20 3.5化。
[0024] PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共34個(gè) 循環(huán)；72°C延伸8min;16°C保存。
[0025] Indel產(chǎn)物檢測(cè)采用聚丙締酷胺凝膠電泳檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于輔助Rf基因選擇的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記與Rf基因遺傳距離為 0.7cM與該基因緊密連鎖，其特異性上下游引物為： MI 16 的上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， MI 16 的下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。2. 用于檢測(cè)辣椒育性的特異性引物，其特征在于， 上游引物序列為:CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， 下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。3. 檢測(cè)辣椒育性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增的 步驟， 上游引物序列為:CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， 下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106048012SQ201610394487
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】張正海, 王立浩, 張寶璽, 曹亞從, 朱硯姝
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所