專(zhuān)利名稱(chēng)：黑翅土白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、編碼基因、載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑翅土白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、編碼基因、載體及應(yīng)用。 背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過(guò)光合作 用產(chǎn)生的主要干物質(zhì)。據(jù)估計(jì)，全世界綠色植物每年光合作用產(chǎn)生的干物質(zhì)達(dá)1730億噸， 所合能量為2Χ1021焦耳，相當(dāng)于全世界每年消耗能量的10倍(李忠仁，生物能源的開(kāi)發(fā)和 利用，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25 (3) 225 227)。纖維素的酶降解需要纖維素酶的參與，纖維素酶并不是一種簡(jiǎn)單的酶，而是由若 干種相互關(guān)聯(lián)的酶組成的一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)。一般來(lái)說(shuō)，纖維素酶主要由三類(lèi)組成(1)內(nèi) 切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo—^-l,4-glucanase, EC 3. 2. 1. 4)，主要作用于纖維素分子 內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β _1，4糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子鏈截短，產(chǎn)生大量帶有非還 原性末端的小分子纖維素和可溶性纖維寡聚糖；(2)外切-β_1，4-葡聚糖酶(Εχο-β-1， 4-glucanase, EC 3.2. 1. 91)，主要作用于纖維素分子鏈的非還原末端，水解β_1，4糖苷 鍵，產(chǎn)生纖維二糖；(3) β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC 3. 2. 1.21)，水解上述兩種酶 產(chǎn)生的纖維二糖和其他低聚糖，生成葡萄糖(Coughlin M P，Ljungdahl J G. Comparative biochemistry of fungal and bacterial eellulolyticenzyme systems. In Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. New York Academic,1988,11-30 ；Goyal A, et al. Characteristics of fungalcellulases. Bioresource Technology, 1991, 36(1) 37-50;王蘭芬.纖維素酶的作用機(jī)理及開(kāi)發(fā)應(yīng)用.釀酒科技，1997,6:16-17;嚴(yán)巖，張全 福.纖維素酶的性質(zhì)、應(yīng)用及其環(huán)境意義.農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展，1997，1 :17-20)。隨著全球人類(lèi)的增長(zhǎng)和多數(shù)國(guó)家的工業(yè)化發(fā)展，能源的消耗在急劇增加，能源危 機(jī)日益嚴(yán)重，因此尋找新的石油替代品一直是眾多科技工作者關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)，燃料乙 醇作為石油能源的替代物，逐漸成為世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)。在美國(guó)，乙醇已被廣泛應(yīng)用在汽 車(chē)燃料中取代部分石油，它們?cè)谑腿剂现屑尤氩糠忠掖迹詼p少石油的使用。這樣既可以 減少環(huán)境污染，又可以節(jié)省能源，減少成本。目前，美國(guó)等國(guó)家在混合燃料中所使用的大量 乙醇都是由谷物發(fā)酵而產(chǎn)生的，這樣成本較高，并且還會(huì)消耗掉大量的糧食。我國(guó)是一個(gè) 農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)林生產(chǎn)中所產(chǎn)生的生物質(zhì)種類(lèi)多，產(chǎn)量巨大，較常見(jiàn)的有枝椏材、稻殼、植物秸 稈、玉米芯、鋸末、碎木塊、甘蔗渣、薪柴、禽畜糞便和城市垃圾等，是僅次于煤炭、石油和天 然氣的第四位能源。然而，每年用于工業(yè)過(guò)程或燃燒的木質(zhì)纖維素僅占所產(chǎn)生木質(zhì)纖維素 的2% (李忠仁.生物能源的開(kāi)發(fā)和利用.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25 (3) :225_227 ；王超， 章超樺.酶解纖維素類(lèi)物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精的研究進(jìn)展.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2003，11 (4) 52-59)。如果用高活性的木質(zhì)纖維素酶將這些木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生還原糖，再進(jìn)一步發(fā)酵 生產(chǎn)乙醇，這樣既可以降低制造成本，還可以變廢為寶，為燃料和能源工業(yè)服務(wù)。自然界中，纖維素酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和一些昆蟲(chóng)如蟑螂、天牛、白蟻等的體內(nèi)。其中，人們對(duì)細(xì)菌、真菌體內(nèi)的纖維素酶研究得最多，而 對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)的纖維素酶則研究得較少。目前有關(guān)昆蟲(chóng)體內(nèi)纖維素酶的研究主要集中在天牛 和白蟻的一些種類(lèi)上。白蟻是一類(lèi)以木質(zhì)纖維素為主要食源的古老生物，在地球物理循環(huán)和能量流動(dòng) 中起著十分重要的作用。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，白蟻為了適應(yīng)纖維素類(lèi)食物的消化，體 內(nèi)形成了非常高效的降解纖維素的纖維素酶系統(tǒng)。近幾十年的研究結(jié)果表明，白蟻體內(nèi) 的纖維素酶主要由內(nèi)切_0 -1，4-葡聚糖酶和0 -葡糖苷酶組成，在一定條件下，這兩種 酶也具有外切-0-l，4-葡聚糖酶活性。在澳白蟻科、草白蟻科、木白蟻科、鼻白蟻科和 齒白蟻科白蟻體內(nèi)，纖維素的消化由白蟻?zhàn)陨矸置诘睦w維素酶和體內(nèi)共生生物分泌的纖 維素酶協(xié)同完成；在白蟻科白蟻體內(nèi)，纖維素的消化則主要依賴(lài)頭部唾液腺或中腸上皮 細(xì)胞分泌的內(nèi)源性纖維素酶(Martin M M. The evolution ofcellulose digestion in insects. Philosophical Transactions of the Royal Societyof London B:Biological Sciences. 1991,333(1267) :281_288 ；李捃，等.低等白蟻腸道內(nèi)原生動(dòng)物的分布及其進(jìn) 化學(xué)意義.白蟻科技，1999，16(2) 1-7 ；Nakashima K, ffatanabe H, Saitoh H et al. Dual cellulose-digesting system ofthe wood-feeding termite, Coptotermes formosanus Shiraki. InsectBiochemistry and Molecular Biology, 2002, 32 :777_784)。在當(dāng)前利用纖維素酶降解纖維素的生產(chǎn)工藝中，最困擾人們的是如何提高纖維素 酶的酶解效率和降低纖維素酶的生產(chǎn)成本(王景林.纖維素酶固定化的研究進(jìn)展.生命科 學(xué).1997，9(3) :116-118，135)。從自然界中尋找高活性的纖維素酶和利用分子生物學(xué)技術(shù) 改造纖維素酶基因，進(jìn)而開(kāi)發(fā)活性高、熱穩(wěn)定性好、底物范圍廣、耐酒精能力強(qiáng)的纖維素酶 生物工程菌，是解決這一問(wèn)題的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種黑翅土白蟻內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶、編碼基因、載體及應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶，含有與5￡0 ID No. 3所示多肽同源性95%以上的氨
基酸序列。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有與SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的肽蛋白同 源性在95%以上的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，均屬于本發(fā)明 保護(hù)范圍之列。具體的改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變 體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替 換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸?；蛘?，所述的內(nèi)切-3-l，4-葡聚糖酶，具有與SEQ ID No. 2所示多肽同源性95% 以上的氨基酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切-3 -1，4-葡聚糖酶”、“黑翅土白蟻內(nèi)切_ 3 -1，4-葡聚糖 酶”或“酶OfEG”都可互換使用，該術(shù)語(yǔ)包括含有信號(hào)肽的多肽以及不含信號(hào)肽的成熟的內(nèi) 切-3-l，4-葡聚糖酶。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切-3 -1，4-葡聚糖酶”指具有內(nèi)切-3 -1，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No. 2的全長(zhǎng)序列(第1-448位)或成熟序列(第17-448位，即SEQ ID No. 3) 的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No.2序列的變異形式。 這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行 取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基 酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶的活性片段和衍 生物。該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或 低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提 供了其他多肽，如包含內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽 外，本發(fā)明還包括了內(nèi)切-日-1，4-葡聚糖酶的可溶性片段。通常，該片段具有內(nèi)切-3-1， 4-葡聚糖酶序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約 50個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地約70個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶或多肽的類(lèi)似物，這些類(lèi)似物與天然內(nèi) 切-1，4-葡聚糖酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形 式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通 過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其 他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸) 的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如0、Y氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解， 本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng) 物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。本發(fā)明所述內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 2中第1 448位或第17 448位(即SEQ ID No. 3)氨基酸殘基序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或 其活性衍生物。優(yōu)選的，所述的內(nèi)切-3-l，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列?；?者將SEQ ID No. 2氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。優(yōu)選的，所述的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。將 SEQ ID No. 3氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且 具有內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及一種編碼所述內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶的基因。該核苷酸序列與選 自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)具有SEQ ID No. 1中第1 1726位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID No. 1中第152 1498位(即SEQ ID NO. 4)的核苷酸序列；
(c)具有SEQ ID No. 1中第200 1498位(即SEQ ID NO. 5)的核苷酸序列(d)編碼具有SEQ ID No. 2中第1 448位或第17 448位(即SEQ IDN0. 3)氨 基酸殘基序列的多核苷酸；(e)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID No. 1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何前述多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有 70%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“編碼內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶的多核苷酸”指編碼具有內(nèi) 切-0-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，如3￡0 ID No. 1中第152 1498位核苷酸 序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指位于SEQ ID No. 1序列的編碼框第152 1498位核苷 酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于 密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID No. 1中第152 1498位核苷酸序列同源性低至約70%。 簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID No. 2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳 地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No. 1中從核苷酸第152 1498位的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID No. 1中從核苷酸第152 1498位的核苷酸序列的同 源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶相同功能的蛋白的SEQ ID No. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入或取 代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。本發(fā)明還包括內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種 反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶的表達(dá)。優(yōu)選的，所述基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。或者，所述基因具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種含有所述基因的重組載體。以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo) 或轉(zhuǎn)染得到的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，編碼內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶的核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含 有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、 植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載 體還包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的 pcDNA3. 1載體和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù) 制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體，優(yōu)選PET載體系列以及其它原 核表達(dá)載體系列。表達(dá)載體一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯 調(diào)控元件。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大 腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，較佳 地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如Tn細(xì)胞、CH0細(xì)胞、COS細(xì)胞等。本發(fā)明還涉及所述的基因在制備內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶中的應(yīng)用。具體方法包 含(a)在適合表達(dá)該內(nèi)切-0_1，4-葡聚糖酶的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì) 胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出該內(nèi)切-0-l，4_葡聚糖酶。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼黑翅土白蟻內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶的基因，該基因可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)以生產(chǎn)該內(nèi)切-0-l，4_葡聚糖酶，用于纖維素的降解，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā) 明的內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶的酶活達(dá)1901本發(fā)明所提供的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶及其 編碼基因可應(yīng)用于纖維素的降解。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 黑翅土白蟻內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶基因(OfEG)的克隆1.基因克隆于冰浴條件下解剖黑翅土白蟻(取自浙江杭州)的唾液腺，并將獲得的腺 體迅速至于Trizoldnvitrogen)溶液中，迅速抽提其總RNA，并以oligo(dT)18為 引物反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對(duì)特異性引物(Primer 1
-aggaaggattccgcccttaacga-3‘,Primer2 -ccgtcacccaatgcgt aatcga-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增到的片段進(jìn)行T載體(Promega)克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定(Invitrogen)。根據(jù)測(cè)序得到的結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物(Primer 3 5，-tgtcgacccctcttattccaacga-3，，Primer 4 :5，-gtagtaactgttggcgtcggtga-3，)，分別 用于擴(kuò)增編碼OfEG全長(zhǎng)cDNA的3’及5’端。以總RNA為模板，利用3’及5’ RACE試劑盒 (Takara-Clontech)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別擴(kuò)增該基因的3’端及5’端序列。分別對(duì)擴(kuò) 增到的片段進(jìn)行T載體(Promega)克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定(Invitrogen)。將測(cè)序獲得 的序列用軟件進(jìn)行序列拼接，最終獲得全長(zhǎng)cDNA。2.序列比對(duì)利用DNAStar軟件對(duì)編碼OfEG的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)該序列長(zhǎng) 1726bp(SEQ ID No. 1)，GC 含量為 50. 0%。其中開(kāi)放閱讀框(open reading frame, 0RF)為 1347bp(SEQ ID NO. 4)，編碼 448 個(gè)推導(dǎo)氨基酸殘基(SEQ ID NO. 2)。利用SignalP 3. 0 在線(xiàn)軟件(http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)對(duì)其 推導(dǎo)氨基酸序列的信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)前16個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。利用 http://au. expasy. org/網(wǎng)站的在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為48. 9KDa，等 電點(diǎn)為5. 25。使用在線(xiàn)SMART工具(http//smart, embl-heidelberg. de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的 功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個(gè)典型的Glyco hydro 9結(jié)構(gòu)域。將該基因的0RF閱讀框所包含的cDNA序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn比對(duì)分 析，結(jié)果顯示其與多種昆蟲(chóng)的內(nèi)切0 -1,4-葡聚糖酶基因高度同源。實(shí)施例2 黑翅土白蟻內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶基因(OfEG)在大腸桿菌中的表達(dá)將得到的黑翅土白蟻內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因編碼區(qū) (SEQID N0. 4)，經(jīng)Sac I和Hind III雙酶切后，連接入同樣酶切的大腸桿菌表達(dá) 質(zhì)粒pET-28a(NOVagen)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后得到表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-0fEG。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將含有pET-28a-0fEG的表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，按1 100 接種到大體積LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D值0. 6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，28°C 誘導(dǎo)4小時(shí)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心收集菌體，用20mM Tris-HCl pH8. 0 50mM NaCl 0. 5mM EDTA洗菌體兩遍，重懸于 20mM Tris-HCl pH8. 0 50mM NaCl 0. 5mM EDTA 0. 5mM PMSFO. 5mg/ml 溶菌酶中，超聲處理裂解細(xì)胞，取上清測(cè)酶活，沒(méi)有活性。實(shí)施例3 黑翅土白蟻內(nèi)切-0-1， 4_葡聚糖酶基因(OfEG)在真核細(xì)胞(Tn細(xì)胞株，即粉紋夜蛾細(xì)胞株)中的表達(dá)將得到的黑翅土白蟻內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因編碼區(qū) (SEQID NO. 4)，經(jīng)Not I和Hind III雙酶切后，連接入同樣酶切的Tn細(xì)胞表達(dá)載體 pBacFastHTa(Invitrogen)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后得到表達(dá)質(zhì)粒 pBacFastHTa-OfEG。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOBac中，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在Lipofectin(GiBco Life)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集 細(xì)胞及細(xì)胞上清，含重組病毒粒子的細(xì)胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2 3周的TC-100連續(xù) 傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用超聲裂解法破碎細(xì)胞，取上清測(cè)酶活，酶活大小為190U。實(shí)施例4 黑翅土白蟻內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶的酶活測(cè)定內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶的酶活測(cè)定采用Somogyi-Nelson微量法(Somogyi M，A reagent for the copper-iodometric determination of verysmall amounts of sugar. Journal of Biological Chemistry,1937,117 (2) 771-776 ；Somogyi M, A new reagent for the determination of sugars. Journal of Biological Chemistry,1945,160(1) 61-68 ；Somogyi M, Notes onsugar determination. Journal of Biological Chemistry, 1952,195(1) 19-23；Nelson N, A photometric adaptation of the Somogyi method for thedetermination of glucose. Journal of Biological Chemistry,1951,193 (1) 375-380)，具體操作如下1.試劑配制Somogyi I 將288g無(wú)水硫酸鈉溶于1L煮沸的蒸餾水中，然后再依次加入24g酒 石酸鉀鈉晶體，48g碳酸鈉，32g碳酸氫鈉，溶解后用蒸餾水稀釋至1.6L，27°C保存。Somogyi II 將72g無(wú)水硫酸鈉溶于300ml煮沸的蒸餾水中，然后再加入8g硫酸 銅，用煮沸的蒸餾水稀釋至400ml，在27 °C保存。Nelson Reagent 將100g鉬酸銨溶解在1. 8L蒸餾水中，然后加入84ml濃硫酸，再 加入100ml砷酸鈉溶液(12g砷酸鈉溶解在100ml蒸餾水中)，然后溶液保存在棕色瓶中并 在37°C下儲(chǔ)存24 48h，最后保存在室溫下。2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作在8支試管中分別裝入200ii g/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 2、 1. 4ml。再依次加入蒸餾水2. 0,1. 8,1. 6,1. 4,1. 2,1. 0,0. 8,0. 6ml，配成每毫升含0、 20、40、60、80、100、120、140ii g的葡萄糖溶液。每試管中加入銅試劑2ml (Somogyi I 1. 6ml, Somogyi II 40ml)，混勻后沸水浴中加熱15min,立即冷卻，再加入2ml砷鉬酸試 劑(NelsonReagent)，振蕩兩分鐘后用分光光度計(jì)在520nm下測(cè)定吸光值。以葡萄糖含量 (ug/ml)為橫坐標(biāo)，520nm下吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3.酶活測(cè)定以(w/v)的羧甲基纖維素(溶劑為0. 1M醋酸-醋酸鈉緩沖液pH5.6)為底 物。取950 ill底物與50 u 1酶液充分混合，在37°C下水浴30min，水解產(chǎn)生的還原糖采用 Somogyi-Nelson微量法進(jìn)行測(cè)定。最后在520nm下測(cè)定吸光值。一個(gè)酶活力單位定義為每 分鐘每克蛋白質(zhì)所產(chǎn)生還原糖的微摩爾數(shù)，表示為U。
gaagacgtta agtactacat cgggggctga agttggggatgttggtaaaa ggagacaaat0102]aaaggaattc gtcctctgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa￡l￡l￡l￡l￡l￡l0103]<210>20104]<211>4480105]<212>PRT0106]<213>formosan whitetermite0107]<400>20108]MetArg ValPheValCysLeuLeuSerAlaLeuAlaLeuCysGinGly0109]1510150110]AlaTyr AspTyrLysThrValLeuArgAsnSerLeuLeuPheTyrGlu0111]2025300112]AlaGinArgSerGlyLysLeuProAlaAspGinLysValThrTrpArg0113]3540450114]LysAspSerAlaLeuAsnAspLysGlyGinAsnGlyGluAspLeuThr0115]5055600116]GlyGlyTyrTyrAspAlaGly AspTyrValLysPheGlyPheProMet0117]657075800118]AlaSerThrAlaThrValLeuAlaTrpGlyLeuValAspTyrAlaAla0119]8590950120]GlyTyrThrSerAlaGly AlaLeuAspAspGlyArgLysAlaValLys0121]1001051100122]TrpAlaThrAspTyrPheLeuLysAlaHisThrAlaProThrGluLeu0123]1151201250124]TyrGlyGinValGlyLysGlyAspLeuAspHisSerTyrTrpGlyArg0125]1301351400126]ProGluAspMetThrMetSerArgProAlaPheLyslieAspAlaSer0127]1451501551600128]AsnProGlySerAspLeuAlaGlyGluThrAlaAlaAlaLeuAlaAla0129]1651701750130]AlaSerlieValPheLys AlaValAspProSerTyrSerAsnAspLeu0131]1801851900132]LeuThrHisAlaLysGinLeuPheAspPheAlaAsnAsnTyrArgGly0133]1952002050134]LysTyrSerAspSerlieThrAsp AlaAsnSerTyrTyrThrSerTyr0135]2102152200136]AspTyrArgAspGluLeuValTrpAlaAlaAlaTrpLeuTyrArgAla0137]2252302352400138]ThrAsnAsplieThrTyrLeuAsnThrAlaGluSerLeuHisAsnGin0139]245250255
10140]PheGly LeuGinAspTrpAsnGly Gly PheSer TrpAspAlaLysVal0141]2602652700142]SerGly ValGinLeuLeuLeuAla LysLeuThrAsnLysGinGinTyr0143]2752802850144]LysAsp AlalieLys GlyTyrValAspTyrLeulieAsnAlaGinGin0145]2902953000146]LysThr ProLysGlyLeuLeuPhelieAspValTrpGlySerLeuArg0147]3053103153200148]HisAla SerAsnAlaAlaPheVallieLeuGinAlaAlaAspLeuGly0149]3253303350150]lieSer AlaValSerTyr ArgGinPheAlaLysLysGinlieAspTyr0151]3403453500152]AlaLeu GlyAspGlyGlyArgSerLeuValValGlyPheGlyAsnAsn0153]3553603650154]ProPro ThrHisProHisHisAlaSerSerSerCysProAspAlaPro0155]3703753800156]AlaVal CysAspTrpSerThrTyrSerSerProAspProAsnPheHis0157]3853903954000158]ValLeu ThrGlyAlaLeuValGlyGlyProAspValAsnAspAsnTyr0159]4054104150160]ValAsp AspArgAsnAspTyrValGinAsnValValAlaCysAspTyr0161]4204254300162]AsnAla GlyPheGinSerAlaValSerAlaLeuValThrLeuGlyTyr0163]4354404450164]<210>30165]<211>4320166]<212>PRT0167]<213>formosan whitetermite0168]<400>30169]AlaTyr AspTyrLysThrValLeuArg AsnSerLeuLeuPheTyrGlu0170]1510150171]AlaGin ArgSerGlyLysLeuProAlaAspGinLysValThrTrpArg0172]2025300173]LysAsp SerAlaLeuAsnAspLysGlyGinAsnGlyGluAspLeuThr0174]3540450175]GlyGly TyrTyrAspAlaGlyAspTyrValLysPheGlyPheProMet0176]5055600177]AlaSer ThrAlaThrValLeuAlaTrpGlyLeuValAspTyrAlaAla0178]65707580
11
385390395400
Val Asp Asp Arg Asn Asp Tyr Val (jln Asn ValVal Ala Cys Asp Tyr
405410415
Asn Ala Gly Phe Gin Ser Ala Val Ser Ala LeuVal Thr Leu Gly Tyr
420425430
<210>4
<211>1347
<212>DNA
<213>formosan white termite
<400>4
atgagggtcttcgtttgccttctgtctgcgcttgcgctttgccaaggtgcttatgactac60
aagacagtactgaggaattcactgctgttctacgaggctcagcgatctggaaagttgccc120
gctgatcagaaggtcacgtggaggaaggattccgcccttaacgacaagggacagaacgga180
gaggacctgacagggggatactatgacgctggtgattatgtgaaattcggcttcccaatg240
gcgtccacagctaccgtcctggcatggggcctggtggactatgcagcgggctacacctca300
gcaggcgctctggatgacggtcgtaaagctgttaaatgggccacggactacttcctcaag360
gcgcacacagccccaacagaattatacggacaagtgggaaagggagatttggaccactcc420
tactggggtcgtccagaagacatgacgatgtcgagacctgcgttcaagatcgacgcgtca480
aatccagggtcggatctggccggcgagacggccgccgccctcgctgcagcttccattgtg540
ttcaaggctgtcgacccctcttattccaacgatctgctcacacacgccaagcagcttttc600
gacttcgccaacaattatcgcggcaaatacagtgactccatcaccgacgccaacagttac660
tacacgtcctatgactacagggatgagttagtatgggcagccgcttggctctacagggca720
accaacgacatcacctacctcaacaccgctgaatcgctacataatcaattcggcctacaa780
gactggaacggtggttttagctgggatgctaaagtctccggtgtacagcttctactggcc840
aagctcaccaacaagcagcagtacaaggacgcgataaaaggttacgtggattacttaatt900
aacgctcagcagaagacaccaaaaggtctccttttcatcgacgtgtggggttccctgcga960
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gtgctcaccggagctttggtgggcggtccg gatgtgaacg acaactacgt ggacgatcgc1260
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tccgctctcgtaacgttggg ctattaa1347
<210>5
<211>1299
<212>DNA
<213>formosan white termite
<400>5
gcttatgactacaagacagtactgaggaattcactgctgttctacgaggctcagcgatct60
13
<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>8tgtcgacccc tcttattcca acga 24<210>9<211>23<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>9gtagtaactg ttggcgtcgg tga 2權(quán)利要求
一種內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，含有與SEQ ID No.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求要求1所述的內(nèi)切-β_1，4-葡聚糖酶，具有與SEQID Νο.2所示多肽同 源性95%以上的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求要求2所述的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，具有SEQID Νο.2所示的氨基酸 序列。
4.如權(quán)利要求要求1所述的內(nèi)切-β_1，4-葡聚糖酶，具有SEQID Νο.3所示的氨基酸 序列。
5.一種編碼權(quán)利要求1所述內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5 所示的核苷酸序列。
8.一種含有權(quán)利要求5 7之一所述基因的重組載體。
9.一種利用權(quán)利要求8所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染得到的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求5 7之一所述的基因在制備內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黑翅土白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，編碼基因、載體及應(yīng)用。所述黑翅土白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，含有與SEQ IDNo.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。進(jìn)一步，所述的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，具有與SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼黑翅土白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的基因，該基因可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)以生產(chǎn)該內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，用于纖維素的降解，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活達(dá)190U。本發(fā)明所提供的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶及其編碼基因可應(yīng)用于纖維素的降解。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101864405SQ200910155260
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者莫建初, 陳春潤(rùn) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)