專利名稱：改良的dna銀氨染色法以及檢測dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及在聚丙烯酰胺凝膠上對 DNA染色的方法，其在檢測靈敏性和操作方便程度上帶來了綜合性能的改善。另外，本 發(fā)明還涉及檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離DNA并使DNA條帶顯色(可視化)，已經(jīng) 成為生物檢測中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝膠上的DNA條可視化可 以采用熒光染料、可視有機(jī)染料和銀等?？梢曈袡C(jī)染料，如亞甲藍(lán)[1]、亮甲酚藍(lán)[2]、 結(jié)晶紫[3]、和尼羅河藍(lán)[4，5]等，其靈敏性低而且操作耗時(shí)。熒光染料，如溴化乙錠 (EB)、SYBRgreen^和SYBR gold，其能夠插入DNA鏈中，因而檢測效果不錯，但是其 需要配備專門的熒光檢測儀器，而且會對實(shí)驗(yàn)操作人員產(chǎn)生致突變效果，因而極大地限 制了它們的使用[6-8]。而銀染技術(shù)已經(jīng)在廣泛應(yīng)用于對聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離的蛋 白質(zhì)的檢測[16]，也有報(bào)道銀染[9-11]能用于核酸[17]和脂多糖[18]的染色。銀染技術(shù)技術(shù)根據(jù)用含銀離子的溶液浸滲中所用的試劑而分成兩大類。一類被 稱為銀氨染色法，其使用銀-氨溶液來浸滲凝膠，并用含甲醛的酸性溶液來顯色，但是 其靈敏性低而且操作過程費(fèi)時(shí)[12]；另一類用酸性銀離子溶液染色，其中凝膠浸滲在pH 為弱酸性的硝酸銀中，然后在堿性條件下用甲醛還原，然而其在進(jìn)行DNA檢測時(shí)，要么 染色靈敏度高但操作過程比較復(fù)雜[19]，要么操作過程較簡單但靈敏度不高[20-22]。為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期實(shí)踐研究，令人驚訝地在銀氨染色法的基礎(chǔ)上發(fā)明 了一種改良的DNA染色法，其省略了固定和敏化的步驟從而降低操作繁瑣程度并減 少操作耗時(shí)，而且能提高檢測靈敏性，僅僅在約40分鐘的操作時(shí)間內(nèi)就能檢測到皮克 (picogram)級的DNA條帶(可達(dá)1.5pg)。另夕卜，本發(fā)明人還發(fā)明了基于改良的DNA染 色法的檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其在檢測靈敏 性和操作方便程度上帶來了綜合性能的改善。另外，本發(fā)明的目的還在于提供檢測DNA 的方法以及用于這些方法的試劑盒等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染 色的方法，其為銀氨染色法，其特征在于，所述方法不包括固定和敏化的步驟。本發(fā)明 第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA后使用，對聚丙烯酰胺凝膠上的 DNA條帶進(jìn)行染色，盡管不優(yōu)選，但是該方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙 烯酰胺凝膠中之后使用。在本文中，銀氨染色法本身為現(xiàn)有技術(shù)[12]，其依次包括洗滌 步驟、敏化步驟、洗滌步驟、浸滲步驟、洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應(yīng)步驟。其 中，浸滲步驟是用含銀離子和氨的堿性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝膠。由于本發(fā)明相對于現(xiàn) 有技術(shù)(包括酸性銀離子溶液染色法等，其中有固定步驟)，省略了固定和敏化的步驟，因而大大縮短了操作時(shí)間，簡化了操作步驟，也避免使用了在固定和敏化步驟中所需的 戊二醛、苯磺酸等對操作人員有害的試劑。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述方法依次包 括第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應(yīng)步驟。這 樣，該方法在達(dá)到上述優(yōu)點(diǎn)后還保留了現(xiàn)有銀氨染色法的檢測靈敏度。在本文中，“依次”指的是所針對的步驟按其所出現(xiàn)的順序執(zhí)行，不能與其他 步驟交換執(zhí)行的順序。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述方法依次由第一次洗滌步驟、浸 滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應(yīng)步驟組成。在本文中，“第一次”與“第二次”用于區(qū)別洗滌步驟在操作流程上的次序， 并不構(gòu)成對洗滌步驟本身執(zhí)行過程的限制。在本文中，“洗滌”指的是用溶劑清洗聚 丙烯酰胺凝膠，用以洗去上一步驟殘留在聚丙烯酰胺凝膠上的試劑。其中，優(yōu)選溶劑是 水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液等，最優(yōu)選是去離子水。優(yōu)選 在本發(fā)明的第一方面，所述方法中第一次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯酰胺凝膠。本發(fā)明 人研究發(fā)現(xiàn)，第一次洗滌對于最終染色效果有顯著的提升，是必須的，但是洗滌時(shí)間可 以不必過長。因此優(yōu)選其中，洗滌時(shí)間大于等于3 分鐘，更優(yōu)選為5-30分鐘，最優(yōu)選為 10分鐘。另外也優(yōu)選其中，洗滌次數(shù)為一次。其中這樣最優(yōu)選的方式大大節(jié)約了操作時(shí) 間。在本文中，“浸滲”指的是用含銀離子和氨的堿性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝膠， 用以使銀離子滲入聚丙烯酰胺凝膠中并結(jié)合到凝膠中的DNA上。其中，堿優(yōu)選是強(qiáng) 堿，如氫氧化鈉或氫氧化鉀。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述方法中浸滲步驟是用含硝 酸銀、氫氧化鈉和氨的溶液浸滲聚丙烯酰胺凝膠。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，浸滲的時(shí)間以及 溶液中各組分的含量對于最終染色效果有顯著的影響。因此為了進(jìn)一步提高染色效果， 提高檢測靈敏度并節(jié)約操作時(shí)間，優(yōu)選浸滲時(shí)間為5-60分鐘，更優(yōu)選為8-30分鐘，最 優(yōu)選為10分鐘；優(yōu)選硝酸銀的濃度為0.05%-0.4%，更優(yōu)選為0.1%-0.3%，最優(yōu)選為 0.2% ；由于經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，溶液的pH顯著能夠顯著影響銀離子擴(kuò)散入凝膠中，pH值越 大，擴(kuò)散速度越快，而溶液的pH基本依賴于氫氧化鈉的濃度，因此優(yōu)選氫氧化鈉的濃度 為0.2%-0.5%，更優(yōu)選為0.3%-0.45%，最優(yōu)選為0.4%，其中氫氧化鈉可以等同于能 產(chǎn)生相同pH的其它強(qiáng)堿；和/或，由于經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，溶液的氨能溶解溶液中產(chǎn)生的氫氧 化銀，避免沉淀，因此優(yōu)選氨的濃度為0.6%-0.9%，更優(yōu)選為0.65%-0.8%，最優(yōu)選為 0.7%。另外，在本文中如未特別指出，所述“溶液”均為水溶液，即溶劑為水，優(yōu)選 明示出其中所含的溶質(zhì)為所述溶液中的全部溶質(zhì)；也優(yōu)選對于液體溶質(zhì)來說，其百分比 濃度指的是體積百分比濃度，而對于固體溶質(zhì)來說，其百分比濃度指的是質(zhì)量百分比濃 度。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述方法中第二次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯酰胺 凝膠。其中，優(yōu)選洗滌時(shí)間為1-5分鐘，最優(yōu)選洗滌時(shí)間為2分鐘；也優(yōu)選洗滌次數(shù)為 一次；，也優(yōu)選其中的水是去離子水。在本文中，“顯色”指的是用含還原劑的酸性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝膠，用 以使?jié)B入聚丙烯酰胺凝膠中DNA上的銀離子還原成銀，從而顯現(xiàn)出可觀察的顏色。其 中，還原劑通常是甲醛，而酸為弱酸，優(yōu)選是檸檬酸。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所 述方法中顯色步驟是用含檸檬酸和甲醛的溶液浸聚丙烯酰胺凝膠。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，溶液中各組分的含量對于最終染色效果有顯著的影響，尤其是甲醛等還原劑的還 原作用(還原反應(yīng)的速度)受由酸決定的溶液pH影響。因此，優(yōu)選檸檬酸的濃度為 0.0025% -0.0125%,更優(yōu)選為0.005%-0.0125%，最優(yōu)選為0.01%，其中檸檬酸可以等 同于能產(chǎn)生相同pH的其它弱酸；和/或，甲醛的濃度分別為0.025%-0.1%，更優(yōu)選為 0.04% -0.06%,最優(yōu)選為0.05%。顯色的時(shí)間由顏色顯現(xiàn)的時(shí)間所決定，優(yōu)選為5-7分鐘。在本文中，“終止顯色反應(yīng)”指的是使聚丙烯酰胺凝膠浸泡于顯色反應(yīng)終止溶 液中，用以終止前述的顯色。通常，顯色反應(yīng)終止溶液為含乙酸的水溶液。優(yōu)選在本發(fā) 明的第一方面，所述方法中終止顯色反應(yīng)步驟是用乙酸溶液浸聚丙烯酰胺凝膠。其中， 優(yōu)選乙酸溶液為-8%的乙酸溶液，最優(yōu)選為5%的乙酸溶液；優(yōu)選終止顯色反應(yīng)步驟 中浸的時(shí)間為1-30分鐘，優(yōu)選為1.5-10分鐘，最優(yōu)選為2分鐘。在第二方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第一方面所述方法的試劑盒， 其包括分裝的浸滲溶液、顯色溶液和顯色反應(yīng)終止溶液，其中浸滲溶液是含銀離子和氨 的堿性溶液，顯色溶液是含還原劑的酸性溶液，顯色反應(yīng)終止溶液是含乙酸的水溶液。 優(yōu)選所述試劑盒包括分裝的含硝酸銀、氫氧化鈉和氨的浸滲溶液、含檸檬酸和甲醛的顯 色溶液、和乙酸溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中各溶液中溶質(zhì)的含量如本發(fā)明第一方面所優(yōu) 選的那樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。在本文中，試劑盒具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的含義，在本文中，其包括分 開的容器，分別包裝(即，分裝)不同的溶液。這樣，不同的溶液之間不會發(fā)生混合。 其中，容器是任何能夠保存其所儲存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，優(yōu)選是能夠 長期保存其所儲存的溶液的容器。另外，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的試劑盒還包括記載有本 發(fā)明第一方面所述方法的說明書。說明書可以是獨(dú)立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑 盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容 器上。在第三方面，本發(fā)明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法，其 包括在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行本發(fā)明第一方面所述的方法。聚丙烯酰胺 凝膠電泳是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)，其方法步驟及使用的試劑、設(shè)備可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)嶒?yàn)手冊，也有許多已經(jīng)商品化了。本發(fā)明人經(jīng) 過實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，盡管DNA在不同厚度(如，0.75、1.0、或1.5mm)的聚丙烯酰胺凝膠 都能分離，并且都能用本發(fā)明第一方面所述的方法染色，但是1.5mm厚的聚丙烯酰胺凝 膠已經(jīng)開始不能得到DNA條帶和背景之間的很好的對比度，因而降低了檢測靈敏度； 而0.75和1.0mm厚的聚丙烯酰胺凝膠的表現(xiàn)都良好。因此，優(yōu)選在本發(fā)明的第三方面 的方法中，所述聚丙烯酰胺凝膠的厚度為0.5-1.5mm，更優(yōu)選為0.6-1.3mm，最優(yōu)選為 0.75-1.0mm,如 0.75mm 或 1.0mm。在第四方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第三方面所述方法的試劑盒， 其包括分裝的聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑和本發(fā)明第二方面的試劑盒中所包括的溶劑。 艮口，所述試劑盒包括分裝的聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑、浸滲溶液、顯色溶液和顯色反應(yīng) 終止溶液，其中浸滲溶液是含銀離子和氨的堿性溶液，顯色溶液是含還原劑的酸性溶 液，顯色反應(yīng)終止溶液是含乙酸的水溶液。聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其可以通過商業(yè)渠道容易地購買。優(yōu)選所述試劑盒包括分裝的聚丙烯酰胺凝 膠電泳試劑、含硝酸銀、氫氧化鈉和氨的浸滲溶液、含檸檬酸和甲醛的顯色溶液、和乙 酸溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中浸滲溶液、顯色溶液、和/或乙酸溶液中溶質(zhì)的含量如本 發(fā)明第一方面所優(yōu)選的那樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去 離子水。另外，優(yōu)選本發(fā)明第四方面的試劑盒還包括記載有本發(fā)明第三方面所述方法的 說明書。說明書可以是獨(dú)立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是直 接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，尤其是權(quán)利要求書和說明書中位于括 號內(nèi)的附圖標(biāo)記僅僅是為了方便閱讀時(shí)的理解，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修 正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這 些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像 它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


以下附圖中的凝膠照片中，OX174DNA/HaeIII分子量標(biāo)記每個條帶的上樣 量均為泳道1，800pg ；泳道2，400pg ；泳道3，200pg ；泳道4，IOOpg ；泳道5， 50pg ；泳道 6，25pg ；泳道 7，12.5pg ；泳道 8，6.2pg ；泳道 9，3.Ipg ；泳道 10， 1.5pg。圖1顯示了電泳后用水洗滌的時(shí)間長短不同所得的對染色的染色照片，其中， (A) Omin. (B) IOmin. (C) 30min. (D)洗滌過夜。圖2顯示了本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法與其他3種比較例的方法的染色 照片，其中，(A)本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法，(B)現(xiàn)有的銀氨染色法，(C)GE Healthcare的商品化的銀氨染色法，(D)現(xiàn)有的酸性銀離子溶液染色法。圖3顯示了顯示了對2中各凝膠泳道2的掃描圖譜的強(qiáng)度比較(通過軟件Multi Gauge software of Science Lab 2006生成)，各圖中的a曲線代表的是本發(fā)明改良的DNA銀 氨染色法所得的強(qiáng)度掃描譜，b曲線代表的是現(xiàn)有的銀氨染色法所得的強(qiáng)度掃描譜，c曲 線代表的是GE Healthcare的商品化的銀氨染色法所得的強(qiáng)度掃描譜，d曲線代表的是現(xiàn)有 的酸性銀離子溶液染色法所得的強(qiáng)度掃描譜，其中圖A為a曲線與b曲線的比較圖，圖B 為a曲線與c曲線的比較圖，圖C為a曲線與d曲線的比較圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)行說明，其中未特別詳細(xì)說明的材料、步驟均為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的，如可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)?br> 驗(yàn)手冊。1，實(shí)驗(yàn)材料丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨 (APS)、Tris> 和硼酸購自 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St.Louis，MO,美國)。ΦΧ174DNA/Haelll 分子量標(biāo)記(Cat # G1761)購自 Promega Corporation (Madison, WI,美國)。 DNA銀染試劑盒(Cat #70-5006-88)購自GE Healthcare (Uppsala,瑞典)。其他化學(xué)產(chǎn)物
均通過市售渠道購買。 2，電泳和圖像分析根據(jù)常規(guī)的聚丙烯酰胺電泳法進(jìn)行，簡要過程如下用TBE緩沖液 (89mM TB, 2mM EDTA, pH 8.3)溶解丙烯酰胺并聚合成8 %聚丙烯酰胺凝膠 (80mmX IOOmmX0.75mm),其中，丙烯酰胺與 Bis 的用量比為 29 1。 ΦXl74 DNA/ HaeIII 分子量標(biāo)記用 Tris-EDTA (TE)緩沖液(IOmM EDTA, IOOmM Tris-Cl, pH 8.0) 稀釋成各個濃度并上樣到凝膠的各個泳道上使得每個泳道的ΦΧ174 DNA/Haelll分 子量標(biāo)記的上樣量分別為 800，400，200，100，50，25，12.5，6.2，3.1 和 1.5pg。用 Miniprotean III dual slab cells (BioRad, Hercules, CA,美國)禾Π PAC 300 (BioRad)以 20mA/凝膠的參數(shù)進(jìn)行電泳。電泳完成后的凝膠分別用以下染色法進(jìn)行染色并觀察顯色 結(jié)果。利用掃描儀(EpsonPerfection V700 Photo，美國)定量觀察DNA條帶的顯色結(jié)果， 并用軟件 Multi Gauge software of Science Lab 2006 (FUJIFILM Corporation,日本)來計(jì)算 機(jī)分析圖象。3，本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法的實(shí)施例電泳后，使用多個凝膠進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)條件變化的一系列實(shí)驗(yàn)?zāi)z在IOOmL去 離子水中洗滌，洗滌時(shí)間分別為O分鐘(不洗滌)、10分鐘、30分鐘和洗滌過夜。然 后，凝膠在50mL含硝酸銀、氫氧化鈉和氨的溶液中分別浸滲5至60分鐘，其中硝酸 銀的濃度分別為0.05% -0.4%,氫氧化鈉的濃度分別為0.2% -0.5%,氨的濃度分別為 0.6%-0.9%。然后取出凝膠，在IOOmL去離子水中洗滌2分鐘。然后取出凝膠，浸入 50mL含檸檬酸和甲醛的溶液顯色，其中檸檬酸的濃度分別為0.0025%-0.0125%，甲醛 的濃度分別為0.025%-0.1%。待顏色顯現(xiàn)并穩(wěn)定后(需要5-7分鐘)取出凝膠并浸入 50mL5%乙酸(HAc)溶液終止顯色反應(yīng)。這一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較如下(1)電泳后洗滌時(shí)間對染色的影響電泳中的物質(zhì)，如Tris、EDTA、硼酸等，可能會干擾銀離子與DNA形成復(fù)合 物，使得背景相對DNA條帶過濃。因此，不同的洗滌時(shí)間會對最終的顯色效果有著不同 的影響。通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，凝膠在去離子水中洗滌10分鐘已經(jīng)足以能夠產(chǎn)生 良好的顯色結(jié)果，長的洗滌時(shí)間不能顯著提升顯色效果，而不洗滌則使檢測的靈敏度大 為降低。(2)浸滲溶液中各組分含量對染色的影響浸滲溶液中以0.05% -0.4%硝酸銀的濃度分別進(jìn)行浸滲，綜合檢測靈敏度、圖 像對比度以及背景的清晰程度，發(fā)現(xiàn)0.2%的硝酸銀濃度是最佳的。更高濃度的硝酸銀將 導(dǎo)致背景更濃從而降低對比度，而更低濃度的硝酸銀將導(dǎo)致靈敏度降低。在含0.2%硝酸銀的浸滲溶液中以0.2% -0.5%氫氧化鈉的濃度分別進(jìn)行浸滲10 分鐘，發(fā)現(xiàn)0.4%的氫氧化鈉濃度是最佳的。更低濃度的氫氧化鈉將導(dǎo)致靈敏度降低，而 更高濃度的氫氧化鈉將增加對背景的染色深度并使凝膠邊緣產(chǎn)生染色條帶(edge-artefacts stain) ο
在含0.2%硝酸銀和0.4%氫氧化鈉的浸滲溶液中以0.6% _0.9%氨的濃度分別進(jìn) 行浸滲，發(fā)現(xiàn)0.7%的氨濃度是最佳的。更低濃度的氨將不能完全溶解產(chǎn)生的氫氧化銀， 造成氫氧化銀顆粒沉淀而造成浪費(fèi)，而更高濃度的氨將過多消耗還原步驟中的甲醛從而 造成還原效率低和靈敏度低。(3)浸滲時(shí)間對染色的影響浸滲時(shí)間分別為5至60分鐘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA條帶的顯色強(qiáng)度在浸滲10分鐘的 情況下就能夠達(dá)到最大強(qiáng)度，再延長浸滲時(shí)間并沒有改變結(jié)果，而少于10分鐘則不足以 達(dá)到最大的強(qiáng)度從而無法達(dá)到最大的靈敏度。(4)顯色溶液中各組分含量對染色的影響顯色溶液中分別以0.0025% -0.0125%的檸檬酸濃度以及0.025% -0.1%的甲醛 濃度進(jìn)行顯色，綜合考慮還原速度、背景深度和靈敏度，發(fā)現(xiàn)0.01%的檸檬酸濃度和 0.05%的甲醛濃度是最佳的。更低濃度的檸檬酸將 造成顯色時(shí)間短而不容易控制，背景 顏色深；更高濃度的檸檬酸將造成顯色速度慢而靈敏度降低。4，比較例1 現(xiàn)有的銀氨染色法根據(jù)Fnmk等[12]的論文進(jìn)行染色。基本過程如下電泳后凝膠用IOOmL去 離子水洗滌3次，每次20分鐘，然后浸入IOOmL 12%戊二醛溶液敏化30分鐘，接著用 IOOmL去離子水洗滌2次，然后浸在去離子水中1小時(shí)。此后，用含IOOmL含0.4%硝 酸銀、0.2%氫氧化鈉和氨的溶液浸滲30分鐘，然后用IOOmL去離子水洗滌3次，每 次10分鐘。最后，凝膠在50mL含0.005%檸檬酸和0.05%甲醛的溶液中顯色。待顏色 顯現(xiàn)并穩(wěn)定后(需要5分鐘)取出凝膠并浸入50mL5%乙酸(HAc)溶液終止顯色反應(yīng)。5，比較例2 GEHealthcare的商品化的銀氨染色法根據(jù)GE Healthcare的DNA銀染試劑盒(Cat # 70-5006-88)的廠商說明書進(jìn)行， 基本過程如下電泳后凝膠浸入125mL含24%乙醇和0.6%苯磺酸(BSA)的溶液中固 定30分鐘，然后在125mL含0.2%硝酸銀和0.07% BSA的溶液中浸滲30分鐘，然后 在125mL去離子水中洗滌1分鐘。然后凝膠浸入125mL含2.5%碳酸鈉、0.1%甲醛和 0.002%硫代硫酸鈉的溶液中顯色6分鐘。然后，凝膠浸入含l%HAc、5%乙酸鈉和10% 甘油的溶液中終止顯色反應(yīng)。6，比較例3 現(xiàn)有的酸性銀離子溶液染色法根據(jù)Bnmt等[23]的論文進(jìn)行染色?；具^程如下電泳后凝膠在IOOmL的5% HAc溶液中固定10分鐘，然后在IOOmL去離子水中洗滌3次，每次2分鐘。此后，將 凝膠浸滲在IOOmL含0.1 %硝酸銀的溶液中20分鐘，然后用IOOmL去離子水沖洗5_10秒 以去除凝膠表面的硝酸銀溶液。然后，將凝膠浸入預(yù)冷(8°C)的含3%碳酸鈉，0.0002% 硫代硫酸鈉和0.51 %甲醛的溶液中顯色10分鐘。最后，浸在預(yù)冷(8°C )的7.5% HAc溶 液中5-10分鐘以終止顯色反應(yīng)。7，結(jié)果比較以上4種方法的過程比較如表1所示，用本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法省略了 固定和敏化的步驟，其不但錯作步驟簡單，而且能夠在約35分鐘的時(shí)間內(nèi)完成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小 于其他方法。本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法能夠顯示出低至1.5pg的DNA條帶，在靈 敏度上優(yōu)于GE Healthcare的商品化的銀氨染色法和現(xiàn)有的銀氨染色法，后兩者只能分別顯示出20和IOOpg的DNA條帶(參見圖2和圖3A、3B)。對于分子量標(biāo)記中較長鏈的DNA(603 1353bp)來說，本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法和現(xiàn)有的酸性銀離子溶液染色 法所顯示出的圖象強(qiáng)度相當(dāng)；而對于鏈較短的DNA(<310bp)來說，本發(fā)明改良的DNA 銀氨染色法比現(xiàn)有的酸性銀離子溶液染色法靈敏度更高(參見參見圖2和圖3C)。另外，從成本上來比較，GE Healthcare的商品化的銀氨染色法的試劑盒需要花 費(fèi)16美元，而本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法中試劑花費(fèi)僅6美元，而且如果大規(guī)模采購 可以進(jìn)一步降低成本。從安全性上來考量，本發(fā)明改良的DNA銀氨染色法避免使用了戊二醛和BSA這 兩種有毒物質(zhì)，對操作人員的健康威脅小得多，更適于在實(shí)驗(yàn)室推廣。表1.4種方法的過程比較表
權(quán)利要求
1.在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其為銀氨染色法，其特征在于，所述方 法不包括固定和敏化的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其依次包括第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步 驟、顯色步驟和終止顯色反應(yīng)步驟。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中第一次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯酰胺凝膠，優(yōu)選洗 滌時(shí)間大于等于3分鐘，更優(yōu)選為5-30分鐘，最優(yōu)選為10分鐘。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中浸滲步驟是用含硝酸銀、氫氧化鈉和氨的溶液浸滲 聚丙烯酰胺凝膠，優(yōu)選浸滲時(shí)間為5-60分鐘，更優(yōu)選為8-30分鐘，最優(yōu)選為10分鐘； 優(yōu)選硝酸銀的濃度為0.05%-0.4%，更優(yōu)選為0.1%-0.3%，最優(yōu)選為0.2%;優(yōu)選氫氧 化鈉的濃度為0.2%-0.5%，更優(yōu)選為0.3%-0.45%，最優(yōu)選為 0.4% ；優(yōu)選氨的濃度為 0.6% -0.9%,更優(yōu)選為 0.65%-0.8%，最優(yōu)選為 0.7%。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中第二次洗滌步驟是用水洗滌聚丙烯酰胺凝膠。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中顯色步驟是用含檸檬酸和甲醛的溶液浸聚丙烯酰胺 凝膠，優(yōu)選檸檬酸的濃度為0.0025%-0.0125%，更優(yōu)選為0.005%-0.0125%，最優(yōu)選為 0.01% ；甲醛的濃度分別為0.025%-0.1%，更優(yōu)選為0.04%-0.06%，最優(yōu)選為0.05%。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其中終止顯色反應(yīng)步驟是用乙酸溶液浸聚丙烯酰胺凝膠。
8.用于權(quán)利要求1-7之任一所述方法的試劑盒，其包括分裝的含硝酸銀、氫氧化鈉和 氨的浸滲溶液、含檸檬酸和甲醛的顯色溶液、和乙酸溶液。
9.在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法，其包括在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然 后進(jìn)行權(quán)利要求1-7之任一所述方法。
10.用于權(quán)利要求9所述方法的試劑盒，其包括分裝的聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑、含 硝酸銀、氫氧化鈉和氨的浸滲溶液、含檸檬酸和甲醛的顯色溶液、和乙酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其為銀氨染色法，依次包括第一次洗滌步驟、浸滲步驟、第二次洗滌步驟、顯色步驟和終止顯色反應(yīng)步驟，而不包括固定和敏化的步驟。另外，本發(fā)明還涉及在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102021231SQ20091017088
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月12日
發(fā)明者叢維濤, 何宏章, 初彥輝, 張弛, 李校堃, 金利泰, 金艷, 馬吉勝 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院