專利名稱：：在浮萍中表達(dá)生物活性多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由遺傳改造的浮萍表達(dá)和分泌生物活性多肽的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：浮萍是水萍科單子葉類植物唯一成員。浮萍的四個(gè)屬和34種都是小的，自由漂動(dòng)的，淡水植物，其地理分布橫跨全球(Landolt(1986)浮萍科的生物系統(tǒng)調(diào)查水萍科-專論研究GeobatanischenInstitutETH，StiftungRubel，蘇黎世)。盡管浮萍為已知的形態(tài)學(xué)最減化(reduced)的植物，但是多數(shù)的浮萍種類具有較大植物的所有組織和器官，包括根，莖，花，種子和葉。人們已經(jīng)對浮萍種類進(jìn)行廣泛地研究，存在大量文獻(xiàn)詳細(xì)描述它們的生態(tài)學(xué)，系統(tǒng)，生活周期，代謝，疾病和害蟲易感性，它們的生殖生物學(xué)，基因結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)。(Hillman(1961)Bot.Review27:221;Landolt(1986)浮萍科植物的生物系統(tǒng)調(diào)查水萍植物科-專論研究GeobatanischenInstitutETH，StiftungRubel，蘇黎世)。浮萍的生長習(xí)性對于微生物的培養(yǎng)方法是非常理想的。植物通過新葉的營養(yǎng)出芽快速增殖，宏觀方式類似于酵母中無性生殖。通過從分生組織細(xì)胞營養(yǎng)出芽而進(jìn)行增殖。分生組織區(qū)域很小，位于葉腹側(cè)表面。分生組織細(xì)胞處于兩個(gè)嚢(pocket)中，兩個(gè)囊分別位于葉中脈(midvein)兩側(cè)。小的中脈區(qū)域也是根發(fā)生及莖生長而將每篇葉子連接到母葉的地方。分生組織嚢受到組織瓣保護(hù)。葉從嚢中交替發(fā)芽。不同的的種類倍增時(shí)間不同，短至20-24小時(shí)(Landolt(195"Ber,Schweiz，Bot.Ges.67:271;Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24:19;Datko和Mudd(1970)PlantPhysiol.65:16;Venkatar謹(jǐn)n等人(1970)ZPflanze叩hysiol.62:316)。浮萍大量的培養(yǎng)導(dǎo)致單位時(shí)間生物量高速聚集(Landolt和Kandeler(1987)水萍科-專論研究，第二巻植物化學(xué)，生理學(xué)，應(yīng)用，參考數(shù)目VeroffentlichungendesGeobotanischenInstitutesETH，StiftungRubel，蘇黎世)，干重累積為鮮重的6-15%(Tillberg等人(1979)Physiol.Plant.46:5:Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67:271;Stomp,未發(fā)表數(shù)據(jù))。已報(bào)道在不同條件下生長的大量浮萍種類的蛋白含量范圍在干重的15-45%(Chang等人(1977)Bull，Inst-Chem.Acad.Sin.24:19;Chang和Chui(1978)ZPflanzenphysiol.89:9UPorath等人(1979)AquaticBotany7:272;Appenroth等人，(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177:251)。使用這些數(shù)值，浮萍中每升培養(yǎng)基蛋白產(chǎn)量的水平和酵母基因表達(dá)系統(tǒng)處于相同數(shù)量級。浮萍中的有性生殖受到培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的控制，包括光周期和培養(yǎng)密度。一些浮萍種類的花誘導(dǎo)為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室步錄。植物通常自花授粉，在實(shí)驗(yàn)室中自花授粉可以通過輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)物來完成。通過這種方法發(fā)展了Lemnagibba的同系繁殖系。已經(jīng)鑒定了自發(fā)突變體(Slovin和Cohen(1988)PlantPhysiol.86,522),且化學(xué)及伽馬射線突變(使用EMS或者醒U)已經(jīng)用來生產(chǎn)具有特定特征的突變體。L.gibba的異型雜交非常繁瑣但是能夠通過受控的人工授粉完成。浮萍的基因組大小為0.25-1.63pgDNA/2C染色體數(shù)目從20到80條，在浮萍科中(acrosstheLe醒ceae)平均數(shù)目為40條。Landolt(1986)浮萍科植物的生物系統(tǒng)調(diào)查水萍植物科-專論研究GeobatanischenInstitutETH，StiftungRubel,蘇黎世).估計(jì)倍性水平為2-12C.Id。使用次生產(chǎn)物，同工酶和DNA序列調(diào)查水萍矛+植物內(nèi)部的遺傳多樣性(McClure和Alston(1966)Nature4916:311;McClure和Alston(1966)Amer.J.Bot.53:849;Vasseur等人(1991)PlSyst.EvoL177:139(1991);Crawford和Landolt(1993)Syst.Bot.10:389)。用含有目的核苷酸序列的表達(dá)盒能夠有效的轉(zhuǎn)化浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)化方法可以是包括土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，彈道轟擊(ballisticbombardment),或者電穿孔等大量方法中的任意一種方法。穩(wěn)定的浮萍轉(zhuǎn)化抹可以通過用帶有目的核苷酸序列和提供選擇試劑抗性的基因轉(zhuǎn)化浮萍細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含有選擇試劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而分離得到。見美國授予Stomp等人的專利6，040,498。浮萍基因表達(dá)系統(tǒng)提供用于大量研究和商業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。對于植物分子生物學(xué)研究整體，以酵母的實(shí)驗(yàn)室便利性搡作的分化的植物體系提供分析分離的基因的發(fā)育和生理學(xué)作用的非常快速體系。對于商業(yè)生產(chǎn)有價(jià)值的多肽，浮萍基礎(chǔ)的體系相對于現(xiàn)存的微生物或者細(xì)胞培養(yǎng)體系具有很多優(yōu)點(diǎn)。植物顯示出其翻譯后處理和哺乳動(dòng)物相似，克服了微生物細(xì)胞生產(chǎn)生物活性哺乳動(dòng)物多肽所具有的一個(gè)主要問題，其他方面(Hiatt(1990)Nature334:469)顯示植物系統(tǒng)具有裝配多亞基蛋白的能力，這種能力在微生物系統(tǒng)中是缺乏的。浮萍生物量增加到重組蛋白商業(yè)生產(chǎn)水平比哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似的增加更快且成本效益更高，而且不同于其它建議的植物生產(chǎn)系統(tǒng)，例如大豆和煙草，浮萍可以在全滿的而且完全受控制的生物質(zhì)生產(chǎn)容器中生長，使得該系統(tǒng)更加容易整合到現(xiàn)存的蛋白生產(chǎn)工業(yè)的下部構(gòu)造中。這些特征使得浮萍成為開發(fā)作為生產(chǎn)重組蛋白的有效的植物基礎(chǔ)體系的理想選擇。因此，本發(fā)明提供增加作為生物活性多肽生產(chǎn)工具的浮萍基因表達(dá)系統(tǒng)有效性的方法和組合物.發(fā)明概迷本發(fā)明涉及使用浮萍作為表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)和回收生物活性重組多肽的方法和組合物。本發(fā)明的一方面提供提高生物活性多肽在浮萍中的表達(dá)水平的方法，導(dǎo)致多肽產(chǎn)量增加，并使得該系統(tǒng)能生產(chǎn)有用量的有價(jià)值的生物活性多肽。本發(fā)明的另外一個(gè)方面公開從遺傳改造的浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物定向分泌生物活性多肽的方法。表達(dá)的多肽的分泌促進(jìn)其回收并防止可能由機(jī)械摩擦或者浮萍組織酶的溶解導(dǎo)致的多肽活性喪失。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含在浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中生產(chǎn)生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)在浮萍培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)化而表達(dá)生物活性重組多肽，其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導(dǎo)多肽分泌入培養(yǎng)基的信號肽編碼序列的核苷酸序列表達(dá)得到的；以及(b)從浮萍培養(yǎng)基中收集生物活性多肽。在該方法的一些實(shí)施方案中，核苷酸序列具有至少一種特征選自(a)多肽的編碼序列中使用浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列使用浮萍優(yōu)選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景(context)核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上游的植物內(nèi)含子。在該方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽分泌到浮萍培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含在浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中分泌生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)在浮萍培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而表達(dá)生物活性重組多肽，其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導(dǎo)多肽分泌入培養(yǎng)基的信號肽編碼序列的核苷酸序列表達(dá)得到的；以及(b)從浮萍培養(yǎng)基收集生物活性多肽。在該方法的一些實(shí)施方案中，核苷酸序列具有至少一種特征選自(a)多肽的編碼序列中使用浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列使用浮萍優(yōu)選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上游的植物內(nèi)含子。在該方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽分泌到浮萍培養(yǎng)基中。在以上方法的一些實(shí)施方案中，信號肽序列選自(a)人體a-2b-干擾素信號序列；(b)擬南芥(Arabidopsisthaliana)殼多糖質(zhì)酶信號序列；(c)水稻a-淀粉酶信號序列；(d)改良的水稻a-淀粉酶序列；(e)浮萍信號序列；以及(f)生物活性重組多肽的天然的信號序列。本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，信號肽為水稻a-淀粉酶信號肽，其序列為SEQIDNO:3所列。以上方法的一些實(shí)施方案中，浮萍優(yōu)選的密碼子為浮萍屬(Lemna-)優(yōu)選的密碼子。進(jìn)一步的實(shí)施方案，浮萍優(yōu)選的密碼子為Lemnagibba優(yōu)選的密碼子或者浮萍(Lenmaminor)優(yōu)選的密碼子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案，其中選自多肽編碼序列和信號肽編碼序列的編碼序列中至少一種含有70%-100%的Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者Lemnaminor-優(yōu)選的密碼子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含生產(chǎn)生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而表達(dá)生物活性重組多肽，其中編碼生物活性重組多肽的核苷酸序列已經(jīng)經(jīng)過改進(jìn)以提高在浮萍中的表達(dá)，以及(b)從所述浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中收集生物活性多肽。在該方法的一些實(shí)施方案中，已經(jīng)改進(jìn)核苷酸序列以提高在浮萍中的表達(dá)，其有至少一種特征選自(a)所述生物活性重組多肽的編碼序列使用浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上游的植物內(nèi)含子。該方法的一些實(shí)施方案中，浮萍優(yōu)選的密碼子為浮萍屬優(yōu)選的密碼子。進(jìn)一步的實(shí)施方案，浮萍優(yōu)選的密碼子為Le咖agibba優(yōu)選的密碼子或者Lemnaminor優(yōu)選的密碼子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案，編碼序列含有70%-100%的Le隨gibba-優(yōu)選密碼子或者Lemnaminor-優(yōu)選密碼子。在以上方法的一些實(shí)施方案中，植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸9序列由核苷酸序列ACC"或者ACA"組成，其中背景位置緊接著翻譯起始密碼子5'末端。在以上方法的一些實(shí)施方案中，操作性連接的含有所述植物內(nèi)含子的核苷酸序列為SEQIDNO:l所列的序列。在以上任何方法的一些實(shí)施方案中，浮萍葉培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物表達(dá)并組裝生物活性多聚蛋白所有亞單位。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中多聚蛋白選自膠原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及單克隆抗體。在以上任何方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽為哺乳動(dòng)物多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物多肽為治療性多肽。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物多肽選自胰島素，生長激素，a-干擾素，p-干擾素，葡糖腦苷脂酶，P-glucoronidase,成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白，p53蛋白，制管張素，leptin,單克隆抗體，細(xì)胞因子，受體，人體疫苗，動(dòng)物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。在以上任何方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽為a-2b-干擾素。進(jìn)一步的實(shí)施方案，a-2b-干擾素為人a-2b-干擾素。進(jìn)一步的實(shí)施方案，人體a-2b-干擾素氨基酸序列為SEQIDN0:4或者SEQIDN0:5所列的序列。在以上任何方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽為a-2b-干擾素生物活性變體，其中所述生物活性變體序列和SEQIDNO:4或者SEQIDNO:5有80%序列一致性在以上任何方法的一些實(shí)施方案中，生物活性重組多肽為酶。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括以上任何方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物選自紫萍(Spirodela)屬，蕪萍屬，Wolfiella屬和浮萍屬。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物選自乳萍，Lemnaminiscula,Lemnaaequinoctialis和Lenrnagibba。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有編碼氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中氨基酸序列選自(a)SEQIDN0:4所列的氨基酸序列；(b)SEQIDNO:5所列的氨基酸序列；(c)SEQINN0:4所示氨基酸序列的生物活性變體的氨基酸序列，其中生物活性變體氨基酸序列和SEQIDN0:4所列的序列具有至少80%的序列一致性；以及(d)SEQINN05所示氨基酸序列的生物活性變體的氨基酸序列，其中生物活性變體氨基酸序列和SEQIDN0:5所列的序列具有至少80%的序列一致性；其中核普酸序列包含浮萍優(yōu)選的密碼子。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核苷酸序列為SEQIDN0:2所列的核普酸序列。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有編碼選自以下信號肽的核苷酸序列的核酸分子(a)SEQIDN0:6所列的水稻a-淀粉酶信號肽氨基酸序列；以及(b)SEQIDN0:7所列的改進(jìn)的水稻-淀粉酶信號肽氨基酸序列；其中核苷酸序列包含浮萍優(yōu)選的密碼子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核苷酸序列為SEQIDN0:3所列的核苷酸序列。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于在浮萍中表達(dá)和分泌人a-2b-干擾素的核酸分子，該核酸分子包含SEQIDNO:3給出的編碼信號肽的核苷酸序列以及SEQIDNO:5給出的編碼成熟人a-2b-干擾素的核苷酸序列，其中編碼信號肽的核苷酸序列和編碼成熟人a-2b-干擾素的核苷酸序列操作性相連接。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核酸分子，還包括SEQIDNO:l給出的包含內(nèi)含子的核苷酸序列，其中該含有內(nèi)含子的核苷酸序列與所迷編碼信號肽的核苷酸序列和所迷編碼成熟的人ot-2b-千擾素的核苷酸序列搡作性相連。本發(fā)明的這些及其它方面更加詳細(xì)的內(nèi)容在以下給出的發(fā)明詳述中公開。附圖簡述圖1圖1顯示在轉(zhuǎn)化的浮萍培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和組織中的干擾素水平(通過固相夾心式(sandwich)免疫測定確定)，如實(shí)施例1所述。圖2圖2顯示在培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化的浮萍培養(yǎng)物組織中的干擾素水平(通過固相夾心式免疫測定確定)，如實(shí)施例2所述。發(fā)明詳述本發(fā)明中，公開提高遺傳改造的浮萍植物和浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中生物活性多肽的表達(dá)和回收的方法。這些方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，它們表達(dá)至少一種生物活性多肽，其中編碼多肽的核苷酸序列已經(jīng)經(jīng)過改造以使其在浮萍中的表達(dá)提高，以及從浮萍培養(yǎng)物中回收生物活性多肽。本發(fā)明包含的核苷酸序列的改造包括，但并不限于，對編碼序列采用浮萍優(yōu)選的密碼子，對翻譯起始密碼子采用植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列，以及在多肽編碼序列的上游插入包含植物內(nèi)含子序列的核苷酸序列。(2)培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，它們表達(dá)至少一種含有信號序列的生物活性多肽，該信號序列指導(dǎo)多肽分泌到培養(yǎng)基中，隨后從培養(yǎng)基中回收生物活性多肽。該方法的一個(gè)實(shí)施方案，改造編碼生物活性多肽的核苷酸序列用以提高其在浮萍中的表達(dá)。或者，在另一種實(shí)施方案中，改造編碼信號肽的核苷酸序列用以提高浮萍中的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，改造生物活性多肽及信號肽的核酸編碼序列以提高其在浮萍中的表達(dá)。另一方面，本發(fā)明包括根據(jù)以上方法生產(chǎn)生物活性多肽的轉(zhuǎn)化的漂浮植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物。另一方面，本方面公開在浮萍中生產(chǎn)生物活性人a-2b-干擾素的方法的和核酸序列。定義^肽"是指單體或者多聚蛋白或者肽。"生物活性多肽"是指具有一種或者多種生物功能或者一系列在生物學(xué)中多肽通常具有的活性的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員意識(shí)到術(shù)語"生物活性"包括和天然蛋白相比生物活性有所改變的多肽(例如活性受到抑制或者增加)，只要蛋白在用于工業(yè)或者化學(xué)處理或者作為治療，疫苗，或者診斷試劑時(shí)具有充分的活性就是具有生物活性?？捎帽绢I(lǐng)域的任何方法來確定生物活性。例如，干擾素家族的蛋白成員的生物活性可通過很多方法來確定，包括它們和干擾素特異性抗體的相互作用，它們增加病毒感染抗性的能力，或者它們調(diào)節(jié)干擾素調(diào)控基因靶轉(zhuǎn)錄的能力。此處使用的"目的核酸序列"是指任何詣在浮萍中表達(dá)的多肽的核苷酸編碼序列。例如，可用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的浮萍進(jìn)行表達(dá)的治療性(例如獸醫(yī)用或者醫(yī)用)或者免疫原性(例如用來接種)多肽的核苷酸編碼序列。術(shù)語"表達(dá)"或者"生產(chǎn)"是指基因產(chǎn)品的生物合成，包括轉(zhuǎn)錄，翻譯和該基因產(chǎn)物的組裝。術(shù)語,萍"是指水萍科成員。該科目前分為4個(gè)屬和34個(gè)種的浮萍，如下浮萍屬(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis,Lgibba,L,japonica，浮萍,Lmiiiiscula,Lobscura,稀脈浮萍(L.perpusilla)，L,tenera,品藻(Ltrisulca)，Lturionifera,Lvaldiviand)i紫萍屬(S.intermedia,S.polyrrhiza,S.punctata)蘢萍屬(Wa.angusta，蘢萍(Wa.arrhiza),Wa.australina,Wa.borealis，Wa.brasiliensis,Wa.coltunbiana,Wa,elongata,Wa,globosa,Wa.扭icroscopica,Wa.neglectd)和Wolfiella屬(Wl.caudata,Wl.denticulata,Wl.gladiata，Wl，hyalina,lingulata,WLr印unda,WLrotunda,和WLneotropica)。如果存在任何水萍科植物其它屬或者種，也屬于本發(fā)明方面?？梢允褂肔andolt(1986)所述分類學(xué)方案對Lemna各種進(jìn)行歸類浮萍科生物系統(tǒng)調(diào)查水萍科-專論研究GeobatanischenInstitutETH，StiftungRubel，蘇黎世。此處使用的術(shù)語^浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物"是指含有浮萍細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中至少50%，55%,60%，65%,70%,75%，80%,85%,90%,95%,或者100%的細(xì)胞為分化的細(xì)胞。此處使用的"分化的細(xì)胞"為具有至少一種表型性狀(例如，顯著的細(xì)胞形態(tài)或者標(biāo)記的核酸或者蛋白的表達(dá))的細(xì)胞，該表型性狀可以將其同未分化的細(xì)胞或者在其它組織類型中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞區(qū)分開來。此處描述的浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物的分化的細(xì)胞形成相互連接的細(xì)胞的平鋪的光滑表面，相互連接的細(xì)胞在它們相鄰的細(xì)胞壁處融合，開始組織成葉原基的節(jié)結(jié)分散于整個(gè)組織。節(jié)結(jié)培養(yǎng)物的組織表面具有通過原生質(zhì)網(wǎng)(plasmadesmata)相互連接的表皮細(xì)胞。此處使用的〃浮萍優(yōu)選密碼子〃是指在浮萍中使用頻率大于17%的密碼子。此處使用的〃浮萍屬優(yōu)選密碼子〃是指在浮萍屬中使用頻率大于17%的密碼子。此處使用的〃Lemnagibba優(yōu)選密碼子〃是指在Le咖agibba中使用頻率大于17%的密碼子。此處Lemnagibba中的密碼子〗吏用頻率來自密碼子使用數(shù)據(jù)庫(GenBankRelease113,0;網(wǎng)址為http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgiYspecies-Lemna+gibba+[gbpln])。,譯起始密碼子〃是指啟動(dòng)從目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄得到的mRNA的翻譯的密碼子。此處使用的〃翻譯起始背景核苷酸序列〃是指緊接翻譯起始密碼子5，的三個(gè)核苷酸的特性。此處使用的〃分泌〃是指多肽橫跨宿主細(xì)胞的質(zhì)膜和細(xì)胞壁的遷移。此處使用的〃操作性連接的〃是指核苷酸序列彼此放置的位置處于功能關(guān)系。通常，操作性連接的DNA序列為相鄰的，且其位置必需以符合閱讀框連接兩個(gè)蛋白的編碼區(qū)域。A.表達(dá)盒根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍是通過用包含于表達(dá)盒內(nèi)的目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化得到。表達(dá)盒包括連接有目的核酸或者基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。提供的表達(dá)盒具有多個(gè)可以插入一個(gè)或幾個(gè)目的基因的(例如，一個(gè)目的基因，兩個(gè)目的基因等等)限制性酶切位點(diǎn)，目的基因受到調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表達(dá)盒可以編碼單個(gè)目的基因。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移的核酸含有2個(gè)或者多個(gè)的表達(dá)盒，其中每個(gè)表達(dá)盒編碼至少一個(gè)目的基因。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，(例如啟動(dòng)子)可以是宿主本身或者和宿主同源的或者外來的或者異源的，或者可以是天然序列或合成的序列。外來的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域就意味在野生型的宿主中不存在這種轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，而是向其中引入的。此處使用的嵌合基因包含操作性連接與其異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列。根據(jù)本發(fā)明可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的合適的啟動(dòng)子(包括細(xì)菌，酵母，真菌，昆蟲，哺乳動(dòng)物和植物的啟動(dòng)子).例如，可以使用植物啟動(dòng)子，包括浮萍啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子包括但并不僅限于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，冠湊堿合成酶啟動(dòng)子(例如，nos，mas，ocs，等等)，泛素啟動(dòng)子，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，核酮糖雙磷酸(RubP)羧化酶小亞基啟動(dòng)子，和乙醇脫氫酶啟動(dòng)子.浮萍RubP羧化酶小亞基啟動(dòng)子為本領(lǐng)域已知(Silverthorne等人(1990)PlantMol.Biol.15:49)。感染植物(優(yōu)選感染浮萍)的病毒的其它啟動(dòng)子也是合適的，這些啟動(dòng)子包括但是并不僅限于芋頭(Dasheen)花葉病毒，小球藻(Chlorella)病毒(例如，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子；Mitra等人(1994)PlantMol.Biol.26:85),番茶點(diǎn)狀萎蔫病毒，煙草脆裂病毒，煙草壞死病毒，煙草環(huán)斑病毒，番茄環(huán)斑病毒，黃瓜花葉病毒，花生殘抹(stump)病毒，紫花苜蓿花葉病毒，甘蔗桿狀badnavirus等病毒分離出來的啟動(dòng)子。最終，選擇啟動(dòng)子達(dá)到要求的調(diào)控水平。例如，在一些實(shí)例中，使用導(dǎo)致組成型表達(dá)的啟動(dòng)子是有利的，(例如來自根癌土壤桿菌(Agrobacteri咖tumefaciens)的甘露減合成酵)?；蛘?在另夕卜一種情況下，對特異性環(huán)境刺激反應(yīng)而激活的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是有利的15(例如，熱休克基因啟動(dòng)子，干燥誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，病原體誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，創(chuàng)傷誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，和光/暗誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子)或者使用對植物生長調(diào)節(jié)劑反應(yīng)而激活的啟動(dòng)子是有利的(例如，受到脫落酸，植物生長素，細(xì)胞分裂素，和赤霉素誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子)。作為進(jìn)一步的選擇，可以選擇導(dǎo)致組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子(例如，根，葉，花特異的啟動(dòng)子)。給定啟動(dòng)子的總強(qiáng)度受到順式作用核苷酸序列的組合及空間組織的影響，這種核苷酸如上游激活序列。例如，根癌土壤桿菌章魚堿合成酶基因的激活核苷酸序列能夠提高根癌土壤桿菌甘露堿合成酶基因的啟動(dòng)子(見Gelvin等人的美國專利5,955,646)的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明中，表達(dá)盒能包括啟動(dòng)子序列上游插入的激活核苷酸序列，以增強(qiáng)目的核苷酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括來自根癌土壤桿菌章魚堿合成酶基因的3個(gè)上游的激活核苷酸序列，該序列搡作性連接于根癌土壤桿菌甘露堿合成酶基因的啟動(dòng)子(見美國專利5,955,646，此處引作參考)。轉(zhuǎn)錄盒包括5'-3'方向的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，目的核苷酸序列，以及植物中轉(zhuǎn)錄和翻譯終止功能區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何本領(lǐng)域已知的合適的終止序列。終止區(qū)可以對轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的(benativewith)，可以對目的基因是天然的，也可以來自另外的來源。合宜的終止區(qū)來自根癌土壤桿菌Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶的終止區(qū)。見Guerineau等人(1991)Mol.Gen.genet.262:141iProudfoot(1991)Cell64:671;Sanfacon等人(1991)GenesDev.5:141:Mogen等人(1990)PlantCell2:1261;Munroe等人(1990)Gene91:151;Ballas等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891;和Joshi等人(1987)NucleicAcidsRes.15:9627。另外典型的終止序列為豌豆RubP歡化酶小亞基終止序列和花椰菜花葉病毒35S終止序列。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員其它適當(dāng)?shù)慕K止序列是顯而易見的。或者，也可在本領(lǐng)域已知的任何其它合適的表達(dá)盒上提供目的基因。表達(dá)盒可以含有超過一個(gè)轉(zhuǎn)移并在轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)的基因或者核酸序列。這樣，每個(gè)核酸序列可以操作性連接5'和3'調(diào)節(jié)序列?；蛘?，也可以提供多個(gè)表達(dá)盒。通常，表達(dá)盒包括用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者組織的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及提供對除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因通常編碼對除草劑不敏感的經(jīng)過修飾的耙蛋白，或者編碼在除草劑起作用之前降解除草劑或者除去其毒性的酶。見DeBlock等人(1987)EMBOJ.6:2513;DeBlock等人(1989)PlantPhysiol.91:691，F(xiàn)romm等人(1990)BioTechnology8z833.,Gordon-Ka,等人(1990)PlantCell2:603。例如，使用編碼突變耙酶5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰乳酸合成酶(ALS)的基因獲得磷酸甘氨酸或者磺酰脲除草劑抗性。通過使用編碼去除相應(yīng)除草劑毒性的phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶，一種腈水解酶或者2,4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細(xì)菌的基因獲得glufosinate銨，boromoxynil,和2,4-二氯笨氧基乙酸(2，4-D)的抗性。本發(fā)明的各種用途中，選擇性標(biāo)記基因包括但是并不僅限于編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II的基因(Fraley等人(1986)CRCCriticalReviewsinPlantScience4:1);氨腈水合酶(Maier-Greiner等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4250);天氡氨酸激酶；二氫畎咬二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶(Peri等人(1993)Biotechnology11:715);bar基因(Toki等人(1992)PlantPhysiol.100:1503;Meagher等人(1996)CropSci.36:1367);色氨酸脫羧酶(Goddijn等人(1993)PlantMol.Biol.22:907);新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NEO;Southern等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1:327);潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT或者HYG;Shimizu等人(1986)Mol,Cell.Biol.6:1074);二氫葉酸還原酶(DHFR;Kwok等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4552);hosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶(DeBlock等人(1987)EMBOJ.6:2513);2,2-二氯丙酸脫卣素酶(Buchanan-Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D-.330);乙酰羥酸(acetohydroxyacid)合成酵(Anderson等人的美國專利4,761,373Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221:266);5-烯醇丙嗣酰莽草酸-磷酸合成酶(aroA;Comai等人(1985)Nature317:741);卣代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(W087/04181Stalker等人)；乙酰輔酶A羧化酶(Parker等人(1990)PlantPhysiol.92:1220);二氬孕酮合成酶(sull;Guerineau等人(1990)PlantMol.Biol.15:127);和32kDa光系統(tǒng)II多肽(psbA;Hirschberg等人(1983)Science222:1346(1983)。也包括所有編碼以下抗性的基因慶大霉素(例如，aacCI，Wohlleben等人(1989)Mol.Gen.Genet.217:202-208);氯霉素(Herrera-Estrella等人(1983)EMB0J.2:987);甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等人(1983)Nature303:209;Meijer等人(1991)PlantMol.Biol.16:807);潮霉素(Waldron等人(1985)PlantMol.Biol.5:103;Zhijian等人(1995)PlantScience108:219:Meijer等人(1991)PlantMol.Bio.16:807);鏈霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.genet.210:86);大觀霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)TransgenicRes.5:131)^博來霉素(Hille等人(1986)PlantMol.Biol.7:171);磺胺藥物(Guerineau等人(1990)PlantMol.Bio.15:127);bromoxynil(Stalker等人(1988)Science242:419)^2,4-D(Streber等人(1989)BioTechnology7:811)^phosphinothricin(DeBlock等人(1987)EMBOJ.6:2513);大觀霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau,TransgenicResearch5:131)。Bar基因提供對glufosinate-類型除草劑(例如)的除草劑抗性。正如上述，其它可以在載體構(gòu)建中使用的選擇性標(biāo)記基因包括但并不僅限于pat基因，也用于bialaphos和phosphinothricin抗'法，用于咪唑啉酮抗性的ALS基因，用于潮霉素抗性的HPH或者HYG基因，用于glyphosate抗性的EPSP合成酶基因，用于He-毒素抗性的Hml基因和其它常規(guī)使用以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的選擇試劑。見Yarmnton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506;Chistopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314;Yao等人(1992)Cell71:63;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419;Barkley等人(1980)操縱子TheOperon177-220;Hu等人(1987)Cell48:555;Brown等人(1987)Cell49:603;Figge等人(1988)Cell52:713sDeuschle等人(1989)Proc,Natl-Acad.Sci.USA86:5400;Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549;Deuschle等人(1990)Science248:480;Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343;Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952;Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072;Wyborski等人(1991)Nuc.AcidsRes.19:4647.,Hillenand-Wissman(1989)TopicsinMol.AndStruc.Biol.10:143.,Degenkolb等人(1991)Antimicrob，AgentsChemother.35:1591iKleinschnidt等人(1988)Biochemistry27:1094JGatz等人(1992)PlantJ.2:397'，Gossen等人(1992)Proc.NatLAcad.Sci.USA89:5547'，Oliva等人(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913;Hlavka等人(1985)藥物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊78;和Gill等人(1988)Nature334:721.這些公開內(nèi)容此處引入作為參考。以上選擇性標(biāo)記基因列表并不意在限制，任何選擇性標(biāo)記基因都可以在本發(fā)明中使用。B.修飾核苷酸序列以提高其在浮萍中的表達(dá)本發(fā)明提供表達(dá)的核苷酸序列的修飾以增加其在浮萍中的表達(dá)。一種修飾為使用浮萍優(yōu)選的密碼子合成的目的核苷酸序列。本領(lǐng)域中有用植物優(yōu)選密碼子合成核苷酸序列的方法。見例如，美國專利5,380,831和5,436,391;Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA15:3324;la麵come等人(1997)PlantMol.Biol.34:485;以及Murray等人，(1989)NucleicAcids.Res.17:477，此處引入作為參考。優(yōu)選密碼子由在浮萍表達(dá)蛋白中最高使用頻率的密碼子來決定。例如，Lemnagibba密碼子的使用頻率可以在以下網(wǎng)'頁找到http://www-kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi7species-Lenma+gibba+[gbpln]，而Leninaminor密碼子的^吏用頻率可以在以下網(wǎng)頁找到http://www.kazusa,or,jp/codon/cgibin/showcodon.cgi*species=Lemna+minor+[gbpln]。在浮萍和其它單子葉植物中表達(dá)經(jīng)過優(yōu)化的基因被認(rèn)為可以在本發(fā)明的方法中使用。見例如，EP0359472,EP0385962，WO91/16432;Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88-.3324;la廳come等人(1997)PlantMol.Biol.34:485;和Murray等人(1989)Nuc.AcidsRes.17:477，等等，此處引入作為參考。進(jìn)一步認(rèn)為所有基因序列或者基因序列的任何部分都可以優(yōu)化或者合成。換言之，可以使用完全優(yōu)化或者部分優(yōu)化的序列。例如，40%,4596，5096,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或者100%的密碼子可為浮萍的優(yōu)選密碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，有90至96%密碼子為浮萍優(yōu)選密碼子。目的核苷酸序列的編碼序列可包含在Lemnagibba使用頻率至少為17%的密碼子。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的核苷酸為在SEQIDN0:2顯示的人a-2B-干擾素的編碼核苷酸序列，其中包含了93%的浮萍優(yōu)選的密碼子。目的核苷酸也進(jìn)行其它的修飾以提高其在浮萍中的表達(dá)。這些修飾包括但是并不僅限于，去掉編碼的假多腺苷酸化信號的核苷酸序列，外顯子-內(nèi)含子拼接位點(diǎn)信號的序列，轉(zhuǎn)座子類重復(fù)序列，以及其特征已知為可能不利于基因表達(dá)的其它序列。序列的G-C含量可以20調(diào)節(jié)到給定細(xì)胞宿主的平均水平，該水平由參考該宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的已知基因計(jì)算而得。如果可能，可以修飾序列以避免預(yù)測的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。在動(dòng)物和植物中翻譯起始密碼子的最佳的翻譯起始背景核苷酸序列之間存在已知的差別，這些翻譯起始背景核苷酸序列的組成影響翻譯起始的效率。見例如，Lukaszewicz等人(2000)PlantScience154:89-98;和Joshi等人(1997);PlantMol.Biol.35:993-1001。在本發(fā)明中，用于目的核苷酸序列翻譯起始密碼子的翻譯起始背景核苷酸序列可以修飾以提高在浮萍中的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣修飾核苷酸序列，而使目的核苷酸序列的翻譯起始密碼子上游緊接的三個(gè)核苷酸為ACC"。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些核苷酸為ACA"。通過使用5'前導(dǎo)序列也能提高浮萍中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。該前導(dǎo)序列也能產(chǎn)生增強(qiáng)翻譯的效果。翻譯前導(dǎo)序列在本領(lǐng)域是已知的，包括但是并不僅限于，微小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如，EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5，非編碼區(qū)；EIroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.SciUSA86:6126);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如，TEV前導(dǎo)序列(TobaccoEtchVirus;Allison等人(1986)Virology154:9);人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP:MacajakandSar請(1991)Nature353:90);苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白姐RNA不翻譯的前導(dǎo)序列(AMVRNA4;Jobling和Gehrke(1987)Nature325:622);煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV;Gallie(1989)MolecularBiologyofRNA，23:56);馬鈴薯蝕刻病毒前導(dǎo)序列(Tomashevskaya等人(1993)J.Gen.Virol.74:2717—2724);Fed-l5，非翻譯區(qū)(Dickey(1992)EMB0J.11:2311-2317);RbcS5，非翻譯區(qū)(Silverthorne等人(1990)J.Plant.Mol.Biol.15:49-58);以及玉米萎黃斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV;Lo,el等人(1991)Virology81:382)。并見文獻(xiàn)，DeliaCioppa等人(1987)PlantPhysiology84:965。包括植物內(nèi)含子序列的前導(dǎo)序列也顯示增加植物中的翻譯效率，其中植物內(nèi)含子序列包括來自玉米脫氫酶1基因的，來自蓖麻子過氧化氫酶基因或者擬南芥屬色氨酸途徑基因PAT1的內(nèi)含子序列。(Callis等人(1987)GenesDev.1:1183-1200;Mascarenhas等人(1990)PlantMol.Biol.15:913-920)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將SEQIDNO:1中所列玉米乙醇脫氫酶l基因(GenBank編號X04049)核苷酸1222-1775對應(yīng)的核苷酸序列插入到目的核苷酸序列上游以增加其翻譯效率。以上描述的任何一種增加浮萍表達(dá)的核苷酸序列修飾都可以在本發(fā)明中使用，包括任何一種修飾或者任何可能的修飾的組合。此處使用的短語〃修飾用于提高浮萍中表達(dá)〃是指含有任何一種修飾或者任何幾種修飾組合的核普酸序列。C.信號肽分泌蛋白通常從含有呵言號肽"的前體多肽開始翻譯，前體肽包括一種和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER)上受體相互作用來指導(dǎo)正生成的多肽鏈跨膜位移且進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行細(xì)胞分泌的"信號肽"。通常從前體肽切下信號肽產(chǎn)生缺乏信號肽的貨熟"多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在浮萍中表達(dá)的生物活性多肽的核苷酸序列和編碼信號肽的的核苷酸序列連接，信號肽指導(dǎo)多肽分泌入培養(yǎng)基。在本領(lǐng)域中指導(dǎo)目標(biāo)蛋白移位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(用于向胞外分泌)的植物信號肽是已知的。見例如，Lee等人的美國專利6,020，169。在本發(fā)明中，使目標(biāo)多肽表達(dá)到ER中可以使用任何植物信號肽。在一些實(shí)施方案中，信號肽為擬南芥(Arabidopsisthaliana)堿性內(nèi)切殼多糖酶(basicendochitinase)信號肽(SEQIDN0:8;NCBI蛋白質(zhì)編號BM82823的氨基酸14-34),伸展蛋白信號肽(Stiefel等人(1990)PlantCell2:785-793),水稻a-淀粉酶信號肽(SEQIDN0:6;NCBI蛋白質(zhì)編號AAA33885的氨基酸1-31)，或者經(jīng)修飾的水稻a-淀粉酶信號序列(SEQIDNO:7)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，信號肽對應(yīng)于分泌的浮萍蛋白的信號肽?；蛘撸褂貌溉閯?dòng)物信號肽在遺傳改造的浮萍中引導(dǎo)表達(dá)的重組多肽進(jìn)行分泌。已經(jīng)證明植物細(xì)胞識(shí)別哺乳動(dòng)物中以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為耙位點(diǎn)的信號肽，而且這些信號肽能夠指導(dǎo)多肽分泌不僅能夠通過質(zhì)膜而且也能夠通過植物細(xì)胞壁。見Hiatt等人美國專利5,202,422和5,639,947。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，引導(dǎo)多肽分泌的哺乳動(dòng)物信號肽為人ot-2b-干擾素信號肽(NCBI蛋白質(zhì)編號AAB59402的氨基酸1—23和SEQIDNO:4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼信號肽的核苷酸序列經(jīng)過修飾用來提高浮萍中的表達(dá)，使用B部分公開的目的核酸序列的任何一種修飾或者幾種修飾的組合。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，水稻a-淀粉酶信號肽由SEQIDN0:3所列修飾核普酸序列編碼，該序列含有大約93%浮萍優(yōu)選的密碼子。用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法從培養(yǎng)基中收獲分泌的生物活性多肽并通過層析，電泳，透析，溶劑-溶劑萃取，等方法來純化。D.轉(zhuǎn)化的浮萍植物和浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物本發(fā)明使用的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍是通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得的在一個(gè)實(shí)施方案中，通過Stomp等人的美國專利6,040,498，(此處引入作為參考)公開的基因轉(zhuǎn)移方法之一獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍。這些方法包括用包有含目的核苷酸序列的核酸的微射彈進(jìn)行彈道轟擊來轉(zhuǎn)移基因，電穿孔轉(zhuǎn)移基因，和用含由目的核苷酸序列組成的載體的土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過任何一種在Stomp等人的美國專利6,040,498中公開的土壤桿菌介導(dǎo)的方法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍。使用的土壤桿菌為根癌土壤桿菌或者發(fā)根土壤桿菌。優(yōu)選使用這些方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物表現(xiàn)正常的形態(tài)，并可通過有性生殖增殖。優(yōu)選的，本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物含有單拷貝轉(zhuǎn)化的核酸，以及轉(zhuǎn)化的核酸中間沒有明顯的重排。也優(yōu)選在浮萍中轉(zhuǎn)化的核酸以低拷貝數(shù)存在(即，每個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)核酸不超過5個(gè)拷貝，或者，不超過3個(gè)拷貝，進(jìn)一步作為選擇，核酸少于3個(gè)拷貝)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍表達(dá)生物活性蛋白激素，生長因子，或者細(xì)胞因子，胰島素，或者生長激素(尤其是人生長激素)?；蛘?，浮萍表達(dá)生物活性P-葡糖醛酸糖苷酶。浮萍可以表達(dá)生物活性的a-2b-干擾素，例如人ct-2b-干擾素前體(NCBI蛋白質(zhì)編號AAB59402;SEQIDN0:4所列)或者成熟的人a-2b-干擾素(NCBI蛋白質(zhì)編號AAB9402第24-188位氨基酸；SEQIDN0:5所列)或者其生物活性變體。人的a-2b-干擾素"生物活性變體"是指通過在天然蛋白的N-末端和/或C-末端刪除(也稱為截短)或增加一個(gè)或者幾個(gè)核苷酸；在天然蛋白的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)刪除或者增加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸；或在天然蛋白的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)替換一個(gè)或者多個(gè)氨基酸而從天然多肽衍生的得到的多肽。本發(fā)明包括的生物活性變體a-2b-干擾素多肽具有生物活性，即，它們繼續(xù)擁有所需的天然a-2b-干擾素生物活性，包括增加對病毒感染抗性的能力，調(diào)節(jié)受a-2b-干擾素調(diào)節(jié)的靶基因轉(zhuǎn)錄的能力。如基因多態(tài)性或者人為操作可產(chǎn)生這種生物活性變體。本發(fā)明的天然a-2b-干擾素的生物活性變體和SEQIDN0:4或者SEQIDNO:5顯示的氨基酸序列至少具有50%,60%,65%,70%，一般至少為約75%,80%,85%，優(yōu)選地至少為約90%,91%,92%，93%,94%,95%,96%,97%，更加優(yōu)選至少約98%，99%或者更高的序列一致性這樣，本發(fā)明的a-2b-干擾素的生物活性變體和該蛋白的區(qū)別小至1-15個(gè)氨基酸殘基，小至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10個(gè)，小至5個(gè)，小至4個(gè)，3個(gè)，2個(gè)，甚至一個(gè)氨基酸殘基。人a-干擾素的生物活性變體在本領(lǐng)域是已知的。見例如，歐洲專利EP211148B1，和美國專利4,748,233，4,801,685，4,816,566，4，973,479,4,975,276，5,089，400,5,098,703，5，231,176，和5,869,293;此處引入作為參考。序列的比較和一致性百分比的確定以及兩種序列的相似性百分比的確定可通過數(shù)學(xué)運(yùn)算法則得到。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.45:444-453運(yùn)算法則確定兩個(gè)氨基酸序列間的一致性百分比，在GCG軟件包(網(wǎng)站www,accelrys.com可下載)的GAP程序包含該法則，或者使用BL0SSUM62矩陣或者PAM250矩陣，并且16，14，12,10,8，6，或者4的缺口重量(gapweight)以及1，2，3,4,5,或者6的長度重量(lengthweight).在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)核苷酸序列的一致性百分比用GCG軟件包中的GAP程序來確定，使用BLOSUM62記分(scoring)矩陣(見Henikoff等人(1989)Proc.NatiAcadSci,USA89:10915)以及缺口重量為40,50，60，70，或者80及長度重量的1，2,3，4，5，或者6。特別優(yōu)選的一套參數(shù)(而且也是當(dāng)技術(shù)人員不能確定應(yīng)該選擇哪些參數(shù)來確定分子是否在本發(fā)明的序列一致性限制范圍之內(nèi)時(shí)使用的參數(shù))是使用BL0SUM62記分矩陣，以缺口長重量為60以及長度重量為3)。氨基酸或者核苷酸序列的一致性百分比還可以通過E.Meyers和W.Miller(1989)CABIOS4:11-17的法則來確定。該法則包含在ALIGN程序中(版本2.0)，使用PAM120重量殘基(weightresidue)表，缺口長度罰分(penalty)為12和缺口罰分為4。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物表達(dá)由于受到成本或者合理性或者這兩者共同的限制，現(xiàn)存的基因表達(dá)系統(tǒng)不能有效地進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)的生物活性多肽。例如，由于蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)干擾細(xì)胞生存，細(xì)胞生殖，細(xì)胞分化或者蛋白質(zhì)組裝，一些蛋白不能在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)。這些蛋白包括但是并不僅限于成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白，p53,制管張素，和l印tin。可以有利地應(yīng)用本發(fā)明來生產(chǎn)哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)蛋白；由于高等植物和哺乳動(dòng)物之間具有大的進(jìn)化距離這些蛋白不可能干擾浮萍中的調(diào)控過程。轉(zhuǎn)基罔浮萍也用來生產(chǎn)大量的蛋白如血清白蛋白(尤其是人血清白蛋白)，血色素，和膠原蛋白，挑戰(zhàn)現(xiàn)存的表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)能力。最終，可以改造高等植物系統(tǒng)，使之要比哺乳動(dòng)物系統(tǒng)更加容易地生產(chǎn)生物活性多聚體蛋白(例如，單克隆抗體，血色素，P450氧化酶和膠原蛋白等等)。一種在浮萍中生產(chǎn)生物活性多聚體蛋白典型的方法為使用含有所有多肽亞基編碼基因的表達(dá)載體。例如.During等人(1990)PlantMol.Biol.15:281和vanEngelen等人(1994)PlantMol.Biol.26:1701。將這種栽體通過任何已知方法，例如彈道轟擊或者土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法引入到浮萍細(xì)胞。這種方法導(dǎo)致表達(dá)所有裝配多聚體蛋白所必需的多肽的無性細(xì)胞系。這種方法的變化為構(gòu)建單基因構(gòu)建體，將這些構(gòu)建體的DNA混合在一起，然后用彈道轟擊或者土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將DNA的混合物打入植物細(xì)胞。作為進(jìn)一步的改變，一些或者所有載體可以編碼多聚體蛋白的一個(gè)以上的亞基(即，以便交叉的浮萍克隆要少于多聚體蛋白亞基的數(shù)量)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)浮萍克隆至少表達(dá)多聚體蛋白的一個(gè)亞基，且分泌每個(gè)亞基的浮萍克隆在一起培養(yǎng)，由不同的分泌的亞基的在培養(yǎng)基中組裝成多聚體蛋白。在一些情況中，需要在浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中產(chǎn)生的亞基要少于多聚體蛋白所有的亞基，或者僅僅產(chǎn)生單個(gè)蛋白亞基，例如，用于工業(yè)或者化學(xué)處理或者用于診斷，治療，或者接種疫苗目的。實(shí)驗(yàn)提供以下實(shí)施例用于說明目的，而不是為了限制。表達(dá)栽體在一些實(shí)施例中使用的表達(dá)載體pBMSP-1在美國專利5,955,646中做過描述，此處引入作為參考。pBMSP-l轉(zhuǎn)錄盒包含來自根癌土壤桿菌章魚堿合成酶的轉(zhuǎn)錄激活核苷酸序列，和額外的來自根癌土壤桿菌甘露堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄激活核苷酸序列，來自根癌土壤桿菌甘露堿合成酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，用于插入編碼目的多肽的核苷酸序列的多接頭位點(diǎn)，以及來自土壤桿菌根癌胭脂堿合成酶基因的終止序列。pBMSP-l表達(dá)載體也含有作為可選標(biāo)記的編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II的核苷酸序列。選擇性標(biāo)記序列的轉(zhuǎn)錄由來自根癌土壤桿菌胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。也用于以下實(shí)施例的表達(dá)載體pBMSP-3含有以上所述的pBMSP-l表達(dá)載體的成分并附加含有和玉米乙醇脫氫酶基因(GenBank編號X04049)核苷酸1222-1775位相對應(yīng)的核苷酸序列，該基因插于啟動(dòng)子和多接頭之間。26用于在浮萍中生產(chǎn)人a-2b-干擾素的表達(dá)構(gòu)建體以下表達(dá)構(gòu)建體使用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建。見例如Sambrook:J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，和Maniatis，T.分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊第二版:冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室發(fā)行，冷泉港，紐約，1989。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*編碼經(jīng)過修飾的水稻a-淀粉酶信號肽的核苷酸序列對應(yīng)GenBank編號M24286的第34-126位核苷酸，只是將97-102位核苷酸從〃CTTGGC〃改變?yōu)椤ˋTCGTC〃。浮萍轉(zhuǎn)化使用上迷的表達(dá)構(gòu)建體用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化浮萍葉或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物(在這些實(shí)施例中來自浮萍抹挑27)。根癌土壤桿菌抹C58Z707,—種解除毒性的(disarmed)，廣泛宿主范圍的C58抹(Hepburn等人(1985)J.Gen.Microbiol.131:2961-2969)用于這些實(shí)施例的轉(zhuǎn)化。上述的表達(dá)構(gòu)建體通過電穿孔或者三親抹雜交程序轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌，三親抹雜交程序使用含有移動(dòng)(mobilizing)質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌MM294(Hoekema等人(1983)Nature303:179-18(KDitta等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7347-7350)。含有上述表達(dá)構(gòu)建體的C58Z707抹在AB最小培養(yǎng)基(Chilton等人，(1974)Proc.Nat.Acad.Sci.USA71:3672-3676)或者含有鏈霉素500mg/L，奇大觀霉素50mg/L以及硫酸卡那霉素50mg/L的YEB培養(yǎng)基(lg/L酵母提取物，5g/L牛肉汁提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/LMgS0》上劃線，并在28"C過夜培養(yǎng)。盡管可以使用任何浮萍屬抹，但在這些實(shí)施例中使用浮萍抹8627來轉(zhuǎn)化。葉子在液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(SchenkandHildebrandt(1972)Can.J.Bot.50:199)中生長，該培養(yǎng)基含有1%蔗糖和10jiM丐1哚乙酸，培養(yǎng)溫度23X:，光周期為光照下培養(yǎng)16小時(shí)/陰暗條件下培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)，光強(qiáng)度大約為40pM/m2sec。用于接種，將單個(gè)葉子從叢中分開并漂浮在接種培養(yǎng)基上持續(xù)大約2-20分鐘。接種培養(yǎng)基為Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(pH5.6)，附加0.6M甘露醇和100jiM乙?；∠愫?，適當(dāng)?shù)母┩寥罈U菌抹包含表達(dá)構(gòu)建體的濃度為1X109細(xì)胞/亳升。然后將這些葉子轉(zhuǎn)移到含有1%蔗糖，0.9%瓊脂以及20mg/L乙酰丁香網(wǎng)的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(pH5.6)并在23"于陰暗處共培養(yǎng)3-4天。共培養(yǎng)之后，轉(zhuǎn)移葉子到Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基或者附加200pg/ml硫酸卡那霉素的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)用以回收。每隔2-4天將感染的組織轉(zhuǎn)移到含有抗生素的新鮮的培養(yǎng)基中來去除葉子感染土壤桿菌的污染。葉子在低光強(qiáng)(1-5jxM/n^sec)的條件下在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約4周。用于轉(zhuǎn)化的浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物生產(chǎn)如下。分離浮萍葉子，用無菌手術(shù)刀切去根，將葉子腹側(cè)面朝下置于附加5viM2，4-二氯笨氧基乙酸，0-5pM卜笨基-3(1，2，3-thiadiazo1-5-基)脲thidiazuron(SigmaP6186),3%蔗糖，0.4DifcoBacto-瓊月旨(FisherScientific),和0.15%Gelrite(Sigma)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中(目錄號M-5519;Sigma化學(xué)公司，St.Louis,M0)pH5.6。葉子生長5-6周。此時(shí)，節(jié)結(jié)(小的微黃色細(xì)胞團(tuán))出現(xiàn)，通常從腹側(cè)中心部分出現(xiàn)。將節(jié)結(jié)組織從母葉中分離并在附加3%蔗糖，0.4%DifcoBacto-瓊脂，0.15%Gelrite,1pM2，4-二氯笨氧基乙酸，和2pM千基腺噤呤的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化如下。合適的根癌土壤桿菌抹在馬鈴薯葡萄糖瓊脂或者含有50mg/L卡那霉素和100]iM乙酰丁香酮的YEB瓊脂上生長，并在附加0.6M甘露醇和andIOOjiM乙酰丁香酮的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中重懸。通過將重懸的細(xì)菌浸入溶液1-2分鐘，移去剩余的液體，并鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中來接種節(jié)結(jié)培養(yǎng)組織，該培養(yǎng)基含有Murashige和Skoog培養(yǎng)基并附加植物生長素和優(yōu)化的促進(jìn)節(jié)結(jié)生長細(xì)胞分裂素和IOOjiM乙酰丁香嗣。用于選擇，將節(jié)結(jié)培養(yǎng)物組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基Murashige和Skoog培養(yǎng)基含有3%蔗糖，1mM2，4-二氯苯氧基乙酸，2^M千基腺噤呤，0.4%DifcoBacto-瓊脂，0.15%Gelrite，500mg/L頭孢氨噻，和200mg/L疏酸卡那霉素，并在連續(xù)光照(20-40nM/m2sec)下培養(yǎng)大約4周。每7天將結(jié)節(jié)組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。當(dāng)結(jié)節(jié)組織在篩選劑中生長旺盛時(shí)，篩選結(jié)束。在某些實(shí)施例中，直接將轉(zhuǎn)化的浮萍結(jié)節(jié)組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到用于篩選的再生培養(yǎng)基中，而不是在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。對于轉(zhuǎn)化浮萍的再生，將篩選得到的結(jié)節(jié)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(0.5XSchenk和Hildebrandt培養(yǎng)基添加1%的蔗糖和200mgs/L的卡那霉素)中組織并產(chǎn)生植物。結(jié)節(jié)培養(yǎng)物在再生培養(yǎng)基上以充足的光照錄育約3周時(shí)間，直到葉出現(xiàn)。將充分組織好的葉轉(zhuǎn)移到加有1-3%蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中并在充足的光照下孵化進(jìn)行克隆增殖。檢測由浮萍葉或者浮萍結(jié)節(jié)培養(yǎng)物產(chǎn)生的生物活性干擾素利用多種分析方法檢測生物活性干擾素，包括Staehlin等人(1981年)酶學(xué)方法(MethodsEnzymoL)79:589-594和Kelder等人(1986年)酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)119:582-587,描述的固相夾心式免疫實(shí)驗(yàn)，此處引入作為參考，以及Tovey等人(1978年)自然(Nature)276:270-272所描迷的細(xì)胞病變作用抑制實(shí)驗(yàn)(cytopathiceffectinhibitionassay),此處引入作為參考。從浮萍培養(yǎng)基中收集分泌型干擾素，從浮萍植物或者浮萍結(jié)節(jié)組織的研磨或者裂解物中收集非分泌型干擾素。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明使用PBL實(shí)驗(yàn)室(NewBrunswick,新澤西州)的試劑盒進(jìn)行干擾素的固相夾心式免疫分析。簡而言之，干擾素被結(jié)合在微量滴定板孔中的抗體捕獲。接著用二抗顯示結(jié)合的抗體然后使用結(jié)合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗二抗標(biāo)記干擾素。四甲基對二氨基聯(lián)笨(TMB)啟動(dòng)過氧化物酶催化的顏色變化以便可以觀察干擾素的水平并與標(biāo)準(zhǔn)比較。在本實(shí)施例中使用對a-2b-干擾素特異的單克隆抗體(目錄號11105,PBI實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行此項(xiàng)分析。按照Tovey等人(1978年)自然(Nature)276:270-272的方法進(jìn)行細(xì)胞病變作用抑制分析。簡而言之，將待分析的樣品的連續(xù)兩倍稀釋樣用100微升添加2%的胎牛血清的Eagles基本培養(yǎng)基(LifeTechnologies公司)稀釋到96孔徵量滴定板(Falcon公司)中，使用美國國家衛(wèi)生研究院人IFNa國際參考樣品(G-002-901-527)的連續(xù)兩倍稀釋樣進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。然后，在包含100微升有2%的胎牛血清的培養(yǎng)基的微量滴定板的每個(gè)空中加入2萬個(gè)人羊膜細(xì)胞(WISH系)。將細(xì)胞在5%0)2和37"C的條件下培養(yǎng)過夜，用200微升有2%的胎牛血清并且含有感染復(fù)制指數(shù)為0.1的水泡性口炎病毒的培養(yǎng)基換液。將細(xì)胞進(jìn)一步在5%(302和37t:的條件下培養(yǎng)過夜，然后在光學(xué)顯微鏡下估計(jì)由于病毒復(fù)制的細(xì)胞病變作用。干擾素的滴度表示為能夠?qū)Σ《镜募?xì)胞病變作用提供50%的保護(hù)的IFN的稀釋度的倒數(shù)。通過參考參照樣品的滴度，干擾素的滴度用國際參考單位的形式表示。如下實(shí)施例說明在浮萍中表達(dá)生物活性干擾素。實(shí)施例1進(jìn)行這一研究旨在確定同一批培養(yǎng)物中在不同時(shí)間點(diǎn)存在于培養(yǎng)基和組織中的培養(yǎng)的IFN的水平。第0天在一套24至30亳升175盎司的培養(yǎng)瓶中接種20片同一品系經(jīng)先預(yù)鑒定為表達(dá)可檢測水平的人a-2b-干擾素(IFN)的葉。培養(yǎng)物在自給營養(yǎng)，緩沖環(huán)境中生長并且由植物/水生物熒光生長燈泡提供連續(xù)的強(qiáng)光。在每一時(shí)間點(diǎn)-第5、7、13、15和18天-測量四個(gè)培養(yǎng)物的鮮重和培養(yǎng)基體積。對于每一培養(yǎng)物，取其培養(yǎng)基和組織樣品并且加入植物蛋白酶抑制劑混合物。將組織樣品研磨并且冷凍離心。收集上清液。培養(yǎng)基和組織提取物保存在零下70"C直到準(zhǔn)備好所有的樣品。在同一天使用上述固相夾心式免疫實(shí)驗(yàn)測定培養(yǎng)基和組織提取物中的IFN的水平。將測量的IFN的濃度分別乘以培養(yǎng)基的體積和培養(yǎng)物的鮮重計(jì)算培養(yǎng)基和組織中培養(yǎng)的IFN的總量。圖1表示了在第7、13、15和18天與第5天相比的相對IFN水平。在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，由于失去一個(gè)培養(yǎng)物，所表示的是三個(gè)培養(yǎng)物的平均值而不是四個(gè)培養(yǎng)物的平均值。實(shí)施例2進(jìn)行這一研究旨在確定同一批培養(yǎng)物中在不同時(shí)間點(diǎn)存在于培養(yǎng)基和組織中的培養(yǎng)IFN的水平'第0天在一套24至30毫升175盎司的培養(yǎng)瓶中接種20片同實(shí)施例1中同一品系的葉。培養(yǎng)物在自給營養(yǎng)，非緩沖液環(huán)境中生長并且由植物/水生物熒光生長燈泡提供連續(xù)的強(qiáng)光。在每一時(shí)間點(diǎn)-第7、10、12、14、17和19天-測量四個(gè)培養(yǎng)物的鮮重和培養(yǎng)基體積。對于每一培養(yǎng)物，取其培養(yǎng)基和組織樣品并且加入一植物蛋白酶抑制劑混合物。將組織樣品研磨并且冷凍離心。收集上清液。培養(yǎng)基和組織提取物保存在零下70t:直到準(zhǔn)備好所有的樣品。在同一天使用上迷固相夾心式免疫實(shí)驗(yàn)測定培養(yǎng)基和組織提取物中的IFN的水平。將測量的IFN的濃度分別乘以培養(yǎng)基的體積和培養(yǎng)物的鮮重計(jì)算培養(yǎng)基和組織中培養(yǎng)IFN的總量。圖2表示了在第14、17和19天與第12天相比的相對IFN水平。在第7天和第10天培養(yǎng)基中的IFN水平低于進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)流程的延伸范圍的范圍。實(shí)施例3表1中所列表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的浮萍用上述方法產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化的浮萍系在自給營養(yǎng)的條件下生長14天。生長培養(yǎng)基中包括濃度為0.2毫克/亳升的牛血清白蛋白。在第14天，如實(shí)施例1中所述準(zhǔn)備培養(yǎng)基和組織提取物，并用上述的固相夾心式免疫實(shí)驗(yàn)方法測定這些提取物中千擾素的水平。表2給出了所分析的克隆浮萍系的數(shù)量和每個(gè)表達(dá)載體的平均培養(yǎng)基干擾素濃度。表3表示了對于經(jīng)不含信號肽的干擾素表達(dá)載體(IFNOl，IFNIO和IFN12)轉(zhuǎn)化的浮萍系，在其組織中干擾素的水平。并且表示了所分析的全部克隆品系對指定構(gòu)建體的平均干擾素水平，以及最高表達(dá)品系的干擾素水平。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>這些轉(zhuǎn)化的浮萍系生產(chǎn)的干擾素的生物活性使用上述細(xì)胞病變作用實(shí)驗(yàn)方法檢測。表4給出了每個(gè)構(gòu)建體的高表達(dá)系的結(jié)果。并且表明了那些包含信號肽的構(gòu)建體的培養(yǎng)基中的干擾素的活性和那些無信號肽的構(gòu)建體在組織中的干擾素的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>由此實(shí)施例中的數(shù)據(jù)可以注意到如下特征(1)僅在轉(zhuǎn)化有包含信號肽的表達(dá)構(gòu)建體的浮萍系中檢測到干擾素的分泌。例如，將IFN02,IFN03，IFN05,IFN07，IFN08，IFN09和IFN011培養(yǎng)基中的干擾素濃度與IFNOl，IFNIO，和IFN12的相比較。(2)對于所有包含信號肽的表達(dá)構(gòu)建體，均檢測到干擾素的分泌，而加入天然的人干擾素信號肽序列的產(chǎn)生最高水平的分泌型干擾素。例如，將IFN02產(chǎn)生的干擾素水平與IFN03和IFN05產(chǎn)生的那些相比較。(3)使用浮萍優(yōu)選的密碼子可以增強(qiáng)干擾素的表達(dá)。例如，將IFN09產(chǎn)生的干擾素水平與IFN05產(chǎn)生的相比較。(4)不僅僅對信號肽優(yōu)化密碼子獲得更高的表達(dá)水平。例如，比較IFN08和IFN09。(5)包含玉米乙醇脫氫酶的內(nèi)含子序列的表達(dá)構(gòu)建體可以產(chǎn)生更高水平的干擾素表達(dá)。例如，比較IFN09和IFNll，及IFN10和IFN12。(6)比較包含修飾的a-淀粉酶信號肽(IFN05)與含有野生型a-淀粉酶信號肽(IFN07)構(gòu)建體的干擾素表達(dá)水平，沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。在說明書中提及的所有的出版物和專利申請資料指示本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請資料在此引入作為參考，程度等同于特定并單獨(dú)指出每份單獨(dú)出版物或者專利申請資料在此引入作為參考。為了清楚的理解盡管前述發(fā)明通過圖例和實(shí)施例在某些細(xì)節(jié)上做過描述，但是在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修飾是顯而易見的。34本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案如下1.在浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中生產(chǎn)生物活性重組多肽的方法，其包括以下步驟(a)在浮萍培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中該浮萍植物培養(yǎng)物或者該浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物祐:^l定轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述的生物活性重組多肽，且其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導(dǎo)多肽分泌入培養(yǎng)基的信號肽的編碼序列的核苷酸序列表達(dá)。(b)從浮萍培養(yǎng)基收集所述生物活性多肽。2.實(shí)施方案1的方法，其中生物活性多肽分泌到浮萍培養(yǎng)基中。3.實(shí)施方案l的方法，其中核苷酸序列有至少一種特征選自(a)該多肽的編碼序列中有浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列中有浮萍優(yōu)選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插入編碼序列上游的植物內(nèi)含子。4.根據(jù)實(shí)施方案3的方法，其中所述浮萍優(yōu)選密碼子為Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍(Lemnaminor)-優(yōu)選的密碼子。5.根據(jù)實(shí)施方案4的方法，其中選自所述多肽編碼序列和所述信號肽編碼序列的至少一種編碼序列含有70%-100%的Lenmagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍-優(yōu)選的密碼子。6.根據(jù)實(shí)施方案3的方法，其中所述植物優(yōu)選的翻譯起始背景的核苷酸序列由核苷酸序列"ACC"或者"ACA"組成，其中該背景定位緊接著翻譯起始密碼子5，末端。7.根據(jù)實(shí)施方案3的方法，其中包含所述植物內(nèi)含子的操作性連接的核苷酸序列為SEQIDNO:1所列序列。8.生產(chǎn)生物活性重組多肽的方法，包括以下步驟(a)培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中該浮萍植物培養(yǎng)物或者該浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述生物活性重組多肽，且其中生物活性重組多肽由核普酸序列編碼，該核苷酸序列經(jīng)過修飾而提高其在浮萍中的表達(dá)，以及(b)從所述浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物收集生物活性多肽。9.實(shí)施方案8的方法，其中經(jīng)過修飾以提高其在浮萍中表達(dá)的核苷酸序列有至少一種特征選自(a)該生物活性重組多肽的編碼序列中有浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性連接的核苷酸序列包含被插入編碼序列上游的植物內(nèi)含子。10.根據(jù)實(shí)施方案9的方法，其中該浮萍優(yōu)選密碼子為Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍優(yōu)選的密碼子。11.根據(jù)實(shí)施方案10的方法，其中編碼序列含有70°/。-100%的Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍-優(yōu)選的密碼子。12.根據(jù)實(shí)施方案9的方法，其中所述植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列由核苷酸序列"ACC"或者"ACA"組成，其中背景定位緊接著翻譯起始密碼子5，末端。13.根據(jù)實(shí)施方案9的方法，其中包含所述植物內(nèi)含子的操作性連接的核苷酸序列為SEQIDNO:1所列序列'14.根據(jù)實(shí)施方案l的方法，其中該浮萍葉培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物表達(dá)并裝配生物活性多聚蛋白所有的亞基。15.根據(jù)實(shí)施方案14的方法，其中該生物活性多聚蛋白選自膠原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及單克隆抗體。16.根據(jù)實(shí)施方案l的方法，其中生物活性重組多肽為哺乳動(dòng)物多狀。3617.根據(jù)實(shí)施方案16的方法，其中哺乳動(dòng)物多肽為治療多肽。18.根據(jù)實(shí)施方案16的方法，其中哺乳動(dòng)物多肽選自胰島素，生長激素，a-干擾素，e-干擾素，p-葡糖腦苷脂酶，P-glucoronidase，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白，p53蛋白，制管張素，leptin,單克隆抗體，細(xì)胞因子，受體，人用疫苗，動(dòng)物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。19.根據(jù)實(shí)施方案1的方法，其中生物活性重組多肽為a-2b-干擾素。20.根據(jù)實(shí)施方案19的方法，其中所述a-2b-干擾素為人a-2b-干擾素。21.根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其中所述人ct-2b-干擾具有SEQIDNO:4或者SEQIDNO:5所列素氨基酸序列。22.根據(jù)實(shí)施方案l的方法，其中生物活性重組多肽為a-2b-千擾素的生物活性變體，其中所述生物活性變體和SEQIDNO:4或者SEQIDNO:5有至少80%的序列一致性。23.根據(jù)實(shí)施方案l的方法，其中生物活性重組多肽為酶。24.根據(jù)實(shí)施方案l的方法，其中所述信號肽序列選自(a)人oc^b-干擾素信號肽；(b)擬南芥殼多糖酶信號肽；(c)水稻ot-淀粉酶信號肽；(d)修飾的水稻a-淀粉酶肽；(e)浮萍信號肽；以及(f)生物活性重組多肽的本身的信號肽。25.根據(jù)實(shí)施方案24的方法，其中信號肽為具有SEQIDNO:3所列序列的水稻a-淀粉酶的信號肽。26.根據(jù)實(shí)施方案1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物。27.根據(jù)實(shí)施方案26的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中該浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物選自紫萍屬，蕪萍屬，Wolfiella屬和浮萍屬。28.根據(jù)實(shí)施方案27的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中該浮萍植物培養(yǎng)物和浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物選自浮萍，Lemnaminiscula，Lemnaaequinoctialis和Lemnagibba。29.核酸分子，其包括編碼選自以下氨基酸序列的核苷酸序列(a)SEQIDNO:4所列氨基酸序列;(b)SEQIDNO:5所列氨基酸序列;(c)SEQINNO:4所示氨基酸序列的生物活性變體的氨基酸序列，其中該生物活性變體和SEQIDNO:4所列序列具有至少約80%的序列一致性；以及(d)SEQINNO:5所示氨基酸序列的生物活性變體的氨基酸序列，其中該生物活性變體和SEQIDNO:5所列序列具有至少約80%的序列一致性；其中該核苷酸序列包含浮萍優(yōu)選的密碼子。30.實(shí)施方案29的核酸分子，其中該核苷酸序列為SEQIDN0:2所列核苷酸序列。31.核苷酸分子，其包括編碼選自以下信號肽的核苷酸序列(a)SEQIDNO:6所列的水稻ct-淀粉酶信號肽的氨基酸序列；以及(b)SEQIDNO:7所列的修飾的水稻-淀粉酶信號肽的氨基酸序列；其中該核苷酸序列包含浮萍優(yōu)選的密碼子。32.實(shí)施方案31的核酸分子，其中該核苷酸序列為SEQIDNO:3所列核苷酸序列。33.實(shí)施方案29的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQIDNO:5所列核苷酸序列并進(jìn)一步包括SEQIDNO:3給出的編碼信號肽的核苷酸序列且SEQIDNO:5所述的核苷酸序列和SEQIDN0:3給出的該編碼信號肽的核苷酸序列操作性相連接。34.實(shí)施方案33的核酸分子，額外包括SEQIDNO:1給出的包含內(nèi)含子的核苷酸序列，其中所述含有內(nèi)含子的核苷酸序列，所述編碼信號肽的核苷酸序列和所述編碼成熟的人a-2b-干擾素的核苷酸序列操作性相連接。序列表<110>Biolex,Inc.Stomp,Anne-MarieDickey,IiynriGasdask^,John<120>在浮萍中表達(dá)生物活性多肽<130>40989/237187<150>US60/293,330<151>2001-05-23<150>US60/221,705<151>2000-07-31<160>8<170>FastSEQforWindowsVersion4-0<210>1<211>554<212>DNA<213>玉蜀黍<400>1gatcaagtgcaaaggtccgctatgattcgttgagtaattttgccgcagtggcgctgatcttatccttcactaccatgaaactattaccgtgtggtccatcatctatcttccctgttcttttgcaacttgcaaggaggcgtttctcggacgtsaggcctttcaagggcgsaaagtttgcstccgtgcagctgcgg<210>2<211>498<212>DNA<213>人工序列<220>w》由浮萍密碼子優(yōu)化的人a-2B-干擾素的核苷酸編碼序列cttgtttctcctctgtctcttggggaaagcttcgtccacatgtatgctstcctgcaatcgagactagtaatctttctcgacgacagtctggctgaacacaaatgaaagacgtcattttcattctttctttgaatttaactgctgctccacacatgtccatcttgatgatttagcttgacttgatctgactaatcttggtt60gtttttttttcgatgaacag120tggtgaacttatgtc.tttta180仁g仁aacatcgtccsgcactg240tcatacgatattgagcaaag300tcagtatgstctaagastgt360aactcgttgagtggccctgt420tcgaattttaccgtgtttag480atgcgattgctttcctggac540554<221>CDS<222>(1》…(498)<400>2tgcgscetcCysAspLeuccccsgProGinsecThrescsgcetcHisSerLeugggtecGlySer10cgccgca_ccArgArgThretc3tgLeuMet1548ctgctggcgLeuLeuA3_acagatgGinMet20cgccgcstctegArglieSer25etcttcLeuPheagetgcctgSerCysLeu30aaggacLysAsp96cgccacgacArgHisAsp35ttcggcPheGlyttcPheccgcaggsgProGinGlu40gagttcGluPheggcaaccagGlyAsnGin45ttccaigPheGin14433gLysgccAla50gagacgateGluThrliecccProgtgVal55CtCC3CLeuHisGluatgMetatelie60GinGinatettcliePhe192Asn65ctgLeuttcsgcsecPheSer_Thra_ag70gacAspaigctegSerSergccAlagccAla75tggTrpAspgagGlu己cc.ctgThrLeu80240etcLeugacAspaagttctscLysPheTyr853CCThrGluctgtacL^uTyrGin90cagGinetcLeu33CAsnAspCtg95gagGlu288gcgtgcgtgatecagggggttggggttacggagacgccgctgatgaagAlaCysVallieGinGlyVaiGlyValThrGluThrProLeuMetLys100105110336gagGluAsp3gcateetcSerlieLeu115gccAlaValcgcsagArgLys120t3CTyrttcPheGincgcArg1253tC工leThretcLeu384tacetcaaggagaagaagtacageccgtgcgcctgggaggtcgttcgcTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValValArg130135140432gccAla145GluateatgcgclieMetArgtecSer150ttcPheagectgSerLeuSer5LCCThr155AsnetcGinGlu3gcSer160480etccgcLeuArgtecsaggsgSerLysGlu165t33498<210〉3<211>96<212>DNA<213>稻<400>3accatgeaggtcctgaacacgatggtcaacaagcacttcctctccctgtccgtcctcaXc60gtcctcctcgggctgagcagcaacctcaccgeegge96<210>4<211>188<212>PRT<213>人<400>4MetAlaLeuThrPheAlaLeuLeuValAlaLeuLeuValLeuSerCys1015LysSerSerCys20SerValGlyCysAsp25UeuProGinThrHis30SerLeuGlySerArg35ArgThrLeuMetLeu40LeuAlaGinMetArg45ArglieSerLeuPhe50SerCysLeuLysAsp55ArgHisAspPheG丄y60PheProGinGluGluPheGlyAsnGinPheGinLysAlaGluThrlieProValLeuHis65707580GluMetlieGinGin85liePheAsnLeuPhe90SerThrLysAspSer95SerAlaAlaTrpAsp100GluThrLeuLeuAsp105LysPheTyrThrGlu110LeuTyrGinGinLeuAsnAspIeuGluAlaCysVallieGinGlyValGlyVal11512012541ThrGlu130TyrPhe145CysiUaSerThrThrGinTrpAsnProArgGluLeu180lieVal165GinMetThr150ValGluLysGluLeuTyrArgAlaSerLeuAspJLeuGluArg185SerlieLeuAlaValArgLysLysGluLysLysTyrSerPro155160lieMetArgSerPheSerLeuSerLysGlu<210>5<211>165<212>PRT<213>人<400>5CysAspLeuLeuLeuAlaArgLys65LeuAlaGluTyrAlaLeuHisAsp35AlaGiu50乙euPheAspLysCysValGin20PheThrSerPhelie100lieAspSer115LeuLysGlu130GlulieMetArgSerLys5MetGlylieThrTyr85GinLeuLysArgGlu165ArgPheProLys70ThrGlyAlaLysSer150HisArgProVal55AspGluValValTyr135PheSerlieGlt\40LeuSerLeuGlyArg120SerLeuSer25GJLuHisSerTyrVal105LysProLeuGlySer10LeuPheGluPheGluMetAlaAla75GinGin90ThrGluTyrPheCysAlaSerThr155SerGlylie60TrpLeuThrGinTrp140AsnArgCys45GinAspAsnProArg125GluLeuThrLeuMet15LeuLysAsp30GinPheGinGinliePheGluThrLeu80AspLeuGlu95LeuMetLys110lieThrLeuValValArgGinGluSer160<210>6<211>31<212>PRT<213>翁<400>6MetGinValLeuAsnThrMetValAsnValLeulieValLeuLeuGlyLeuSer2025LysHisPheLeuSerLeuSer1015SerAsnLeuThrAlaGly30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>"w改造的水稻a-淀粉酶信號肽<400>7MetGinValLeuAsnThrMetValAsnLysHisPheLeuSerLeuSer151015ValLeuIJLeValLeuThrValLeuSerSerAsnLeuThrAlaGly20253042<210>8<211>21<212>PRT<213>擬南芥<權(quán)〉8MetLysThrAsnLeuPheLeuPheLeuSerSerAlaGlu20LeuliePheSerLeuLeuLeuSer10154權(quán)利要求1.在浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物中生產(chǎn)生物活性重組多肽的方法，其包括以下步驟(a)在浮萍培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物，其中該浮萍植物培養(yǎng)物或者該浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述生物活性重組多肽，且其中所述生物活性重組多肽由含有所述重組多肽編碼序列和操作性連接的指導(dǎo)所述重組多肽分泌的信號肽的編碼序列的核苷酸序列表達(dá)；和(b)從浮萍培養(yǎng)基收集所述重組多肽；其中所述信號肽選自(a)人α-2b-干擾素信號肽；(b)擬南芥殼多糖酶信號肽；(c)水稻α-淀粉酶信號肽；和(d)SEQIDNO7所示的經(jīng)修飾的水稻α-淀粉酶信號肽。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組多肽為ot-2b-干擾素、生長激素或單克隆抗體。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列具有至少一種選自下列的特征(a)該oc-2b-千擾素的編碼序列中有浮萍優(yōu)選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列中有浮萍優(yōu)選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側(cè)為植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列；U)操作性連接的核普酸序列含有插入編碼序列上游的植物內(nèi)含子；以及(e)操作性連接的5，前導(dǎo)序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述浮萍優(yōu)選的密碼子為Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍(Lemnaminor)-優(yōu)選的密碼子。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中選自所述重組多肽編碼序列和所述信號肽編碼序列的至少一種編碼序列含有70%-100%的Lemnagibba-優(yōu)選的密碼子或者浮萍(Lemnaminor)-優(yōu)選的密碼子。6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述植物內(nèi)含子具有SEQIDNO:1所示的序列。7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述植物優(yōu)選的翻譯起始背景核苷酸序列由核苷酸序列"ACC"或者"ACA"組成，其中所述背景定位緊接著翻譯起始密碼子5，末端。8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述cx-2b-干擾素同SEQIDNO:4或者SEQIDNO:5具有至少80%序列同一性。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述a-2b-干擾素包括這樣的多肽，所述多肽為SEQIDNO:4或者SEQIDN0:5的氨基酸序列的末端截短。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述末端截短為C-末端截短。11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述0(-21)-干擾素為人01-21)-干擾素。12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述ot-2b-干擾素具有SEQIDNO:4或者SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中信號肽為水稻a-淀粉酶信號肽，且所述信號肽由SEQIDN0:3所示的序列編碼。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植物培養(yǎng)物或者浮萍節(jié)結(jié)培養(yǎng)物的植物細(xì)胞。15.根據(jù)權(quán)利要求14的植物細(xì)胞，其中所迷植物細(xì)胞來自選自紫萍屬，蕪萍屬，Wolfiella屬和浮萍屬的屬。16.根據(jù)權(quán)利要求14的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自選自浮萍，Lemnaminiscula,Lemnaaequinoctialis和Le邁nagibba的物種。17.核酸分子，其包含SEQIDNO:2所示的編碼ot-2b-干擾素的核苷酸序列，后者操作性連接SEQIDN0:3給出的編碼信號肽的核苷酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求17的核酸分子，其另外還包括SEQIDN0:1給出的植物內(nèi)含子核普酸序列，其中所迷植物內(nèi)含子核苷酸序列、所述編碼信號肽的核苷酸序列和所述編碼oc-2b-干擾素的核苷酸序列操作性相連接。全文摘要本發(fā)明提供用于從遺傳改造的浮萍表達(dá)和分泌生物活性多肽的方法，核酸序列和轉(zhuǎn)化的浮萍植物或者浮萍節(jié)結(jié)的培養(yǎng)物。通過修飾編碼多肽的表達(dá)盒的核苷酸序列來提高在浮萍中的表達(dá)，改進(jìn)重組多肽在浮萍中的表達(dá)。通過將生物活性多肽連接到指導(dǎo)多肽向培養(yǎng)基分泌的信號肽改善從浮萍中回收生物活性多肽。文檔編號C12N9/00GK101676400SQ20091017476公開日2010年3月24日申請日期2001年7月26日優(yōu)先權(quán)日2000年7月31日發(fā)明者A-M·斯湯普,J·加斯達(dá)斯卡,L·迪奇申請人:比洛克西治療公司