專(zhuān)利名稱(chēng)：人胚胎干細(xì)胞衍生的造血細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及細(xì)胞生物學(xué)、胚胎干細(xì)胞和細(xì)胞分化。更具體的，本發(fā)明提供 了具有造血能力、用于藥物開(kāi)發(fā)和移植治療的分化細(xì)胞。相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)要求2001年12月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/338,979的優(yōu)先權(quán)。在 先申請(qǐng)?jiān)诖送暾胍怨﹨⒖?。背景白血病是具有?yán)重預(yù)后的造血細(xì)胞癌癥。美國(guó)白血病協(xié)會(huì)估計(jì)在1998年，美國(guó) 有28700人被診斷出白血病。最近10年來(lái)，在用異體或自身造血干細(xì)胞聯(lián)合放療或化療 治療白血病上取得了很大的進(jìn)展。自身移植也用于治療晚期乳癌、卵巢癌和前列腺癌。 干細(xì)胞移植目前正在臨床測(cè)試中測(cè)試其對(duì)嚴(yán)重的、有生命危險(xiǎn)的自身免疫疾病的治療作用。不幸的是，常常不能得到合適的造血干細(xì)胞用于治療這些病況。另一供體的異 體細(xì)胞匹配困難，因而導(dǎo)致需要開(kāi)發(fā)自身移植物，該移植物的治療細(xì)胞衍生自病人自身 的骨髓。自身供給需要時(shí)間，來(lái)準(zhǔn)備用于移植的足夠的細(xì)胞，常常有癌細(xì)胞通過(guò)施用的 細(xì)胞重新引入病人的危險(xiǎn)。進(jìn)行了大量的研究，來(lái)確定存在于人血和骨髓中，據(jù)信不斷補(bǔ)充了對(duì)造血系統(tǒng) 干細(xì)胞特征的 了解。Gunsilius 等(Biomed.Pharmacother.55 186，2001)提供了 一個(gè)綜 覽。美國(guó)專(zhuān)利5,750,397報(bào)道了人造血干細(xì)胞的培養(yǎng)物為CD34陽(yáng)性，能從人骨髓樣品中 產(chǎn)生、增殖和分化。美國(guó)專(zhuān)利5,192,553報(bào)道了胎兒和血液新生干祖細(xì)胞的分離。美國(guó) 專(zhuān)利5,635,386報(bào)道了調(diào)節(jié)人造血細(xì)胞培養(yǎng)物中特定細(xì)胞系的方法。歐洲專(zhuān)利出版號(hào)EP 455,482A3報(bào)道了一個(gè)缺乏CD38但表達(dá)CD34的人祖細(xì)胞亞組。Vaziri 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 9857，1994)報(bào)道了 由于人造血干細(xì)胞老 化引起的端粒 DNA 喪失。Chiu 等(Geron Corporation ； Stem Cells 14 239，1996)描述 了來(lái)自成人骨髓的造血祖細(xì)胞中端粒酶活性的差異表達(dá)。Gaffney等(Blood 91 : 1662， 1998)報(bào)道了 Flt-3配體和骨髓基質(zhì)衍生的因子對(duì)原代人CD34陽(yáng)性骨髓祖細(xì)胞的影響。 Koller等(J.Hematother.5 449，1995)比較了 Flt_3配體與c_kit作為體外造血細(xì)胞擴(kuò)展的 刺激劑。Bhatia 等(Proc.Natl.Acad.Sci.94 5320，1997)報(bào)道了能再次增加免疫缺陷小鼠 的原始人造血細(xì)胞。Bhatia等(Nature Med.4 1038，1998)報(bào)道了一類(lèi)具有SCID再增活 力的人造血細(xì)胞。Gallacher等(Blood 96 1，2000)報(bào)道了新循環(huán)性人胚胎血干細(xì)胞的 分離。國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 99/23205報(bào)道了一群基本均質(zhì)的、CD34陰性和Lin陰性的 人造血干細(xì)胞。Karanu等(J.Exp.Med.192 1365，2000)報(bào)道了作為造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的 Motch 配體 Jagged-1。Bhatia 等(J.Exp.Med.189 1139，1999)報(bào)道了骨形態(tài)發(fā)生蛋 白調(diào)節(jié)人造血干細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。Karanu等(Blood 97 1960，2001)報(bào)道了 Delta_2和 Delta-4的功能是原始人造血細(xì)胞的有絲分裂調(diào)節(jié)劑。Bhardwaj等(Nature Immunol 2 172，2001)報(bào)道了音速刺猬(sonichedgehog)因子能誘導(dǎo)人造血細(xì)胞增殖。已鑒別了人骨髓和臍帶血的重要造血祖細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)了體外操縱它們的有效方 法。但是這些細(xì)胞在整個(gè)捐贈(zèng)的人細(xì)胞群僅占很低的百分?jǐn)?shù)仍然是一個(gè)問(wèn)題。另一種來(lái)源是早期胚胎組織分離的多能細(xì)胞。最近已開(kāi)發(fā)了，用于分離和培 養(yǎng)人ES細(xì)胞的技術(shù)(Thomson等，Science 282 114，1998 ；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,090,622和 6,200,806)。國(guó)際專(zhuān)利出版物 WO 99/20741 和 WO 01/51616 (Geron Corp.)提供了無(wú)飼養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)物中靈長(zhǎng)類(lèi)衍生的原干細(xì)胞培養(yǎng)方法和材料，這種培養(yǎng)方便制備這些細(xì)胞及其 衍生物，用于人的治療。Li 等(Blood 15 98，2001)；美國(guó)專(zhuān)利 6,280,718 (Wisconsin)和 Kaufman 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 10716，2001b)報(bào)道了使人多能干細(xì)胞分化成造血品系的細(xì)
胞的最初嘗試。必須與小鼠骨髓細(xì)胞或卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞一起共同培養(yǎng)，從而產(chǎn)生具有造 血細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。為了使得胚胎干細(xì)胞衍生的造血細(xì)胞能夠進(jìn)入商用，需要開(kāi)發(fā)新的方法，該方 法不需要與基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，從而提供了與來(lái)自骨髓的細(xì)胞相比顯著改善的產(chǎn)率。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種有效生產(chǎn)靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞的系統(tǒng)，所述細(xì)胞是由多能細(xì)胞分化成 的造血細(xì)胞譜系的細(xì)胞。本文描述了相當(dāng)富含造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群。而造血祖細(xì)胞又可 以分化成紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系和淋巴細(xì)胞系細(xì)胞集落。本公 開(kāi)內(nèi)容中描述的組合物、方法和技術(shù)具有各種應(yīng)用前景，包括藥物篩選和各種臨床治療 形式。本發(fā)明的實(shí)施方式之一是一群在培養(yǎng)物中增殖，具有一定的造血細(xì)胞特征的細(xì) 胞。細(xì)胞群是通過(guò)分化靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞(pPS)獲得的，示范性的pPS細(xì)胞是人胚胎干 細(xì)胞建立的細(xì)胞系。包括其中至少細(xì)胞是CD45陽(yáng)性的，具有其它下列造血細(xì)胞的特 征性標(biāo)記，并具有少部分未分化的pPS細(xì)胞。細(xì)胞群可以高接種效率在對(duì)造血細(xì)胞集落 形成單位(CFU)甲基-纖維素試驗(yàn)形成集落，從而當(dāng)重新在第二個(gè)CFU試驗(yàn)中接種時(shí)， 形成次生集落。當(dāng)注射到NOD-SCID小鼠中時(shí)，細(xì)胞可形成循環(huán)性紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單 核細(xì)胞、巨核細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。包括基因改造過(guò)，表達(dá)異源的用于基因治療，或延長(zhǎng) 細(xì)胞復(fù)制能力的基因的細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一群人造血細(xì)胞，具有本文公開(kāi)所述的至少一種特 征，例如至少20%細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源基因產(chǎn)生的CD34 ；至少約2%細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源基因 產(chǎn)生的CD45 ；或其中細(xì)胞以高接種效率在CFU實(shí)驗(yàn)中形成集落。這包括用任何方法制 備得到的人細(xì)胞組合物，但不限于人多能干細(xì)胞分化，或任何其它不涉及用特異性抗體 (例如抗-CD34抗體)或其等價(jià)物細(xì)胞分離的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種通過(guò)分化pPS細(xì)胞制備造血細(xì)胞的方法。例 如，可從無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物收集pPS細(xì)胞，然后通過(guò)形成胚狀體(embryoid body)或其它 方法引發(fā)分化途徑。然后可將引發(fā)的細(xì)胞與造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子的混合物一起培養(yǎng)，從而
4獲得在CFU實(shí)驗(yàn)中形成集落的細(xì)胞。造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子的混合物可包含下列造血細(xì)胞分 化因子的一種或多種干細(xì)胞因子(SCF)、FLT-3配體、IL-3、IL_6、G_CSF、音速刺猬 (sonic hedgehog)或其它本公開(kāi)列出的細(xì)胞因子，還可能與骨形態(tài)發(fā)生蛋白，例如BMP-4 聯(lián)合。通常不需要與外源基質(zhì)細(xì)胞或任何含有不同基因組的細(xì)胞共培育。可用該方法產(chǎn) 生造血細(xì)胞祖細(xì)胞，或成熟的造血細(xì)胞，例如紅細(xì)胞樣細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核 細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種篩選能調(diào)節(jié)造血細(xì)胞功能的化合物的方法。將 該化合物與本發(fā)明的細(xì)胞群混合，并監(jiān)測(cè)所致的細(xì)胞群中細(xì)胞的任何表型或代謝上的改變。本發(fā)明還提供了一種可誘導(dǎo)免疫耐受的系統(tǒng)。給予病人衍生自多能(pPS)細(xì) 胞的端?；?xì)胞群，可賦予病人對(duì)第二種細(xì)胞群的免疫耐受性，從而使缺陷組織功能再 生。示范性的hPS細(xì)胞是人胚胎干(hES)細(xì)胞或其等價(jià)物，例如可以從人胚泡獲得的 細(xì)胞。第一種細(xì)胞群一般是與第二種細(xì)胞群MHC相容的，可能衍生自同樣的hPS細(xì)胞 系。該方法可用于提高組織，例如肝細(xì)胞、神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和其它神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、激素分泌性細(xì)胞，如胰島細(xì)胞和 軟骨細(xì)胞的移植效率。將在下面的描述中進(jìn)一步闡明本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方式。


圖1顯示了未分化人胚胎干細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。門(mén)控用活力(7AAD陰 性；欄i)和大小(ii)選揀，然后篩揀未分化ES細(xì)胞群中的造血細(xì)胞表面標(biāo)記(iii-vi)的 表達(dá)。這些細(xì)胞都不表達(dá)人造血細(xì)胞標(biāo)記CD45，僅1.2%是CD34陽(yáng)性的(原始人造血 細(xì)胞的一種標(biāo)記)。圖2顯示了通過(guò)分化hES細(xì)胞的H系獲得的造血細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。通 過(guò)將hES細(xì)胞條帶在含有20% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成聚集體10天，引發(fā)分化。然后在 含有造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF，是SCF，F(xiàn)lt-3配體、IL_3、IL_6和G_CSF)，含有或不 含骨形態(tài)發(fā)生蛋白4CBMP-4)的無(wú)血清培養(yǎng)基(SF)中培養(yǎng)細(xì)胞。CD45標(biāo)記可鑒定造血 細(xì)胞祖細(xì)胞。圖3是HES方案圖，其中hES細(xì)胞的HI品系分化成造血細(xì)胞祖細(xì)胞。在含 FCS的培養(yǎng)基中分化后，在集落形成(CFU)實(shí)驗(yàn)中，將整個(gè)培養(yǎng)物(左)或單個(gè)胚狀體 (右)置于含干細(xì)胞因子、GM-CSF、IL-3和EP0的甲基纖維素中。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)確 定形成的集落的造血細(xì)胞表型，并在第二次CFU實(shí)驗(yàn)中傳代。圖4顯示了根據(jù)圖3左側(cè)流程圖從整個(gè)胚狀體培養(yǎng)物獲得的造血細(xì)胞。當(dāng)分析 整個(gè)CFU實(shí)驗(yàn)(A)時(shí)，有83-86%為CD45染色，肯定了造血細(xì)胞的存在。B欄顯示了 形態(tài)學(xué)評(píng)估結(jié)果。20,000個(gè)輸入細(xì)胞形成了 47個(gè)集落，接種效率為1/425。C欄顯示的 集落是挑出用于標(biāo)記分析的，其中81-92%的細(xì)胞是CD45陽(yáng)性，73%是CD13陽(yáng)性。圖5顯示了根據(jù)圖3右側(cè)的流程從分離的胚狀體形成的造血細(xì)胞。在CFU實(shí)驗(yàn) 中鑒定了紅細(xì)胞樣、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的集落。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析兩個(gè)紅細(xì)胞集落， 發(fā)現(xiàn)其中93%是血型糖蛋白陽(yáng)性。
圖6顯示了當(dāng)從圖3所示的CFU實(shí)驗(yàn)挑選兩個(gè)集落，在第二次CFU實(shí)驗(yàn)中再 接種的情況。A欄顯示了自含有82,500個(gè)細(xì)胞的原代粒細(xì)胞集落衍生出的不同次生集落 (下文顯示了每個(gè)集落類(lèi)型的數(shù)目)。此次生集落具有粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞樣細(xì)胞 和GEMM集落(造血細(xì)胞類(lèi)型的混合物)的特征。具有高水平的CD45和CD13表達(dá)， 但CD34和CD14水平低。將另一個(gè)原代粒細(xì)胞集落(12,500個(gè)細(xì)胞)在次生CFU實(shí)驗(yàn) (B欄)中傳代，并形成14個(gè)集落，都具有單核細(xì)胞特征。圖7顯示了臍帶血單核細(xì)胞(CBMC)和未分化hES細(xì)胞系HI、H7和H9上主 要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類(lèi)和II類(lèi)的表達(dá)?；揖€表示MHC染色；實(shí)線表示抗體對(duì) 照。未分化的hES細(xì)胞是MHCI類(lèi)陽(yáng)性，但不是MHC II類(lèi)陽(yáng)性-即使用干擾素Y處理 過(guò)(插入)。圖8顯示了混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)中未分化hES細(xì)胞的效果。在A欄，hES細(xì)胞 不能刺激異體移植的外周血或臍帶血單核細(xì)胞增殖。B欄中，全部三種hES細(xì)胞都不能 刺激增殖，即使之前通過(guò)單核細(xì)胞耗竭富集過(guò)相應(yīng)T細(xì)胞群。在C欄，通過(guò)與IFN-Y — 起培養(yǎng)，提高M(jìn)HCI類(lèi)表達(dá)制備hES細(xì)胞，但仍然不能刺激T細(xì)胞的增殖。圖9顯示hES細(xì)胞還能抑制第三方的抗原遞呈細(xì)胞刺激的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 在A欄，當(dāng)用異體移植的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)刺激T細(xì)胞時(shí)，觀察到劇烈的增殖應(yīng)答。在 培養(yǎng)物中加入人成纖維細(xì)胞影響很小，但加入未分化的hES細(xì)胞即消除了該反應(yīng)。在B 欄，顯示抑制效果依賴(lài)于MLR中存在的hES細(xì)胞數(shù)量。少至3X104hES細(xì)胞即能顯著 抑制該反應(yīng)。圖10顯示了將細(xì)胞注射到免疫缺陷型Prk-/-SCID小鼠中所產(chǎn)生的應(yīng)答。 MBA-1基質(zhì)細(xì)胞和胎兒?jiǎn)魏思?xì)胞都能夠誘導(dǎo)粒細(xì)胞滲透應(yīng)答，但未分化的hES細(xì)胞沒(méi)有 觀察到任何效果。圖11顯示了將細(xì)胞注射入野生型CD-I小鼠產(chǎn)生的應(yīng)答。注射僅含內(nèi)毒素的 PBS在注射位點(diǎn)引起了淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞滲出。然而，注射載體和hES細(xì)胞完全消除了 白細(xì)胞浸潤(rùn)(右)，而MBA-1細(xì)胞不能抑制浸潤(rùn)(插入)。未分化的hES細(xì)胞在這種情 況下明顯不能誘導(dǎo)排斥反應(yīng)，而且防止注射位點(diǎn)的宿主細(xì)胞浸潤(rùn)，顯示了抑制炎癥的能 力。圖12顯示了在形成胚狀體后，翌日在細(xì)胞因子和/或BMP-4中培養(yǎng)hPS細(xì)胞獲 得的造血細(xì)胞的表型和功能特征。細(xì)胞因子提高了總的細(xì)胞產(chǎn)率，并且相當(dāng)大的提高了 CD45陽(yáng)性細(xì)胞和產(chǎn)生CFU的細(xì)胞的比例。圖13顯示了次生CFU的結(jié)果，強(qiáng)調(diào)了在最初分化過(guò)程中BMP-4的重要性。用 BMP_4(和或不和細(xì)胞因子)制備的造血細(xì)胞產(chǎn)生高比例的次生集落。這證明在BMP-4 存在下，分化性hES細(xì)胞產(chǎn)生具有可觀自身更新能力的造血祖細(xì)胞。圖14顯示了一種在分化過(guò)程中跟蹤細(xì)胞表型和功能的動(dòng)力學(xué)方案的結(jié)果。第15 天出現(xiàn)CD45陽(yáng)性細(xì)胞，在第22天有更大的增加。第15天時(shí)產(chǎn)生集落的能力很高，而 在第22日該能力的增加不顯著。在這些情況下，前15天代表了指導(dǎo)造血細(xì)胞分化的細(xì) 胞因子和BMP的關(guān)鍵窗口。發(fā)明詳述本發(fā)明解決了如何從多能干細(xì)胞進(jìn)行有效分化，產(chǎn)生大量人造血細(xì)胞的問(wèn)題。
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已發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞可以以非特異性方式引發(fā)分化，然后在分化因子的混合物 中培養(yǎng)引發(fā)的細(xì)胞，誘導(dǎo)沿造血細(xì)胞分化途徑分化。不同的生長(zhǎng)因子組合能有效促進(jìn) 造血細(xì)胞分化。特別有效的組合包括干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3配體、IL-3、IL-6和 G-CSF。在該混合物中培養(yǎng)一段合適的時(shí)間，可產(chǎn)生可觀富集的造血前體細(xì)胞群，其 中各種造血細(xì)胞譜系是多能的，并且在培養(yǎng)物中活躍增殖。該造血前體細(xì)胞可以通過(guò)與 SCF、GM-SCF、IL-3和促紅細(xì)胞生成因子一起培養(yǎng)，沿著骨髓分化途徑下游進(jìn)一步分 化。與Kauftnan等(見(jiàn)上)報(bào)道的不同，本文的公開(kāi)內(nèi)容認(rèn)為在進(jìn)行上述細(xì)胞的衍生
中，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)并不是必需的。相反，用本文公開(kāi)的技術(shù)，可以產(chǎn)生造血細(xì)胞表型相當(dāng)富集的分化細(xì)胞群。 通過(guò)在分化混合物中同時(shí)加入細(xì)胞因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4CBMP-4)，獲得了含有8% CD45陽(yáng)性細(xì)胞(多能造血細(xì)胞標(biāo)記)和22% CD34陽(yáng)性細(xì)胞(原始造血祖細(xì)胞標(biāo)記)的 細(xì)胞群。值得注意的是，5%以上的細(xì)胞同時(shí)是CD45和CD34陽(yáng)性的。CD45標(biāo)記的存 在與CFU試驗(yàn)中測(cè)定的活性集落形成細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。胚胎干細(xì)胞衍生的造血細(xì)胞以非常高 的接種效率產(chǎn)生集落。該發(fā)現(xiàn)是重要的，因?yàn)樗峁┝丝磥?lái)比任何目前的來(lái)源，包括外周血、成年人 骨髓或甚至臍帶血，可獲得的造血祖細(xì)胞都要多的造血細(xì)胞群。用細(xì)胞因子分化的起始 的lX105hES細(xì)胞群得到至少約137個(gè)造血祖細(xì)胞，與人臍帶血(182)或外周血中活動(dòng)的 骨髓祖細(xì)胞(249)相當(dāng)。由于人胚胎干細(xì)胞可導(dǎo)致無(wú)限增殖，本發(fā)明提供了一種可產(chǎn)生 不限量的造血祖細(xì)胞_和定型成為造血細(xì)胞亞型之一的子代，或分化成成熟的紅血細(xì)胞 或白細(xì)胞的系統(tǒng)。下面的公開(kāi)內(nèi)容提供了關(guān)于生產(chǎn)和測(cè)試本發(fā)明的造血細(xì)胞的信息。還提供了有 關(guān)這些細(xì)胞如何用于研究、藥物開(kāi)發(fā)和治療管理血液相關(guān)異常的說(shuō)明。定義就本發(fā)明的目的而言，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“造血細(xì)胞”指任何來(lái)自造血細(xì)胞 途徑的細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)包括造血祖細(xì)胞、定型的能復(fù)制或形成集落的細(xì)胞、以及完 全分化的細(xì)胞的造血細(xì)胞譜系特有的一些已接受的形態(tài)學(xué)特征和表型標(biāo)記(下文例證)。“造血祖細(xì)胞”、“造血前體細(xì)胞”或“造血干細(xì)胞”是能夠產(chǎn)生完全分化的 造血細(xì)胞和具有自我更新的能力的細(xì)胞。典型的，它在體外單獨(dú)培養(yǎng)不能產(chǎn)生胚胎胚層 子代，除非以某些形式分化或重新程序化過(guò)。就細(xì)胞個(gè)體發(fā)育而言，形容詞“分化的”是相對(duì)而言的。與對(duì)照細(xì)胞相比，術(shù) 語(yǔ)“分化細(xì)胞”是進(jìn)展到發(fā)育路徑下游的細(xì)胞。因此，多能胚胎干細(xì)胞可分化成譜系 限制的前體細(xì)胞，例如多能造血祖細(xì)胞，它能形成紅細(xì)胞樣細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨核細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞系之一的細(xì)胞。這些祖細(xì)胞還可以進(jìn)一步分化成自我更新性的細(xì) 胞，定型形成這四種造血細(xì)胞系之一的細(xì)胞。這些細(xì)胞進(jìn)而可以進(jìn)一步分化成終末的分 化細(xì)胞，發(fā)揮其特征性作用，可能或可能不保留進(jìn)一步的增殖能力。紅細(xì)胞樣細(xì)胞、單 核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、血小板、以及淋巴細(xì) 胞是終末分化的細(xì)胞的例子?！胺只瘎痹诒疚闹兄富衔锛现械囊环N，用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生屬于造血細(xì)胞系的分化細(xì)胞(包括前體細(xì)胞和終末分化細(xì)胞)的化合物。對(duì)該化合物的作用方 式?jīng)]有限定。例如，所述分化劑輔助分化的過(guò)程可以是通過(guò)誘導(dǎo)或輔助表型改變、促進(jìn) 具有特定表型的細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制其它細(xì)胞的生長(zhǎng)，或與其它分化劑通過(guò)未知的機(jī)制協(xié)同作用。原型“靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞”(pPS細(xì)胞)是來(lái)自受精后任何時(shí)間的胚前、胚胎 或胎兒組織的多能細(xì)胞，其特征是能夠在合適的條件下產(chǎn)生數(shù)種不同細(xì)胞類(lèi)型的子代， 它們來(lái)自全部三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)的，這可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)例如在8-12 周齡SCID小鼠內(nèi)形成畸胎瘤的能力來(lái)確定。該術(shù)語(yǔ)包括各種類(lèi)型的已建立的干細(xì)胞系和 根據(jù)上述方式獲自多能原代組織的細(xì)胞。pPS細(xì)胞的定義包括各種類(lèi)型的胚胎細(xì)胞，例如人胚胎干細(xì)胞(hES)，見(jiàn) Thomson等(Science 282 1145，1998)；其它靈長(zhǎng)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，例如恒河猴干細(xì) 胞(Thomson 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 7844，1995)，絨猴干細(xì)胞(Thomson 等， Biol.Reprod.55 254，1996)和人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞(Shamblott 等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95 13726，1998)。該術(shù)語(yǔ)還包括其它類(lèi)型的多能細(xì)胞。包括能產(chǎn)生所有三個(gè)生發(fā) 層的衍生物、子代的任何靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞，不論它們是來(lái)自胚胎組織、胎兒組織還是其它 來(lái)源。pPS細(xì)胞最好不要來(lái)自惡性來(lái)源。通常希望(但非必須)此類(lèi)細(xì)胞核型正常。當(dāng)細(xì)胞群中大部分干細(xì)胞及其后代衍生物顯示明顯區(qū)別于胚胎或成人的分化細(xì) 胞的未分化細(xì)胞形態(tài)特征時(shí)，就稱(chēng)pPS細(xì)胞培養(yǎng)物為“未分化的”。本領(lǐng)域技術(shù)人員很 容易識(shí)別未分化pPS細(xì)胞，一般在二維顯微鏡下表現(xiàn)為具有高核/胞質(zhì)比和明顯核仁的細(xì) 胞集落。應(yīng)理解的是，細(xì)胞群內(nèi)非未分化細(xì)胞的集落通常被臨近的分化細(xì)胞所包圍?！帮曫B(yǎng)細(xì)胞”指一種類(lèi)型的細(xì)胞，當(dāng)與另一種類(lèi)型的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可為第二 種類(lèi)型的細(xì)胞提供可生長(zhǎng)環(huán)境。某些類(lèi)型的pPS細(xì)胞可用原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，無(wú) 限增殖的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或分化自hES細(xì)胞的人成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞來(lái)支持。如果pPS 分裂后細(xì)胞已生長(zhǎng)了至少一個(gè)周期，期間沒(méi)有加新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞來(lái)支持其生長(zhǎng)，則稱(chēng)pPS 細(xì)胞群為“基本無(wú)”飼養(yǎng)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“胚狀體”與“聚集體”同義，指已分化和未分化細(xì)胞的聚集體，出現(xiàn)在 pPS細(xì)胞在單層培養(yǎng)物中過(guò)度生長(zhǎng)或懸浮培養(yǎng)中維持。胚狀體是不同細(xì)胞類(lèi)型(通常源自 不同胚層)的混合物，可根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)別和可用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記?！吧L(zhǎng)環(huán)境”指感興趣的細(xì)胞增殖、分化或成熟的體外環(huán)境。此類(lèi)環(huán)境的特征 包括培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可能存在的任何生長(zhǎng)因子或分化誘導(dǎo)因子，以及可能存在的支 持結(jié)構(gòu)(例如固體表面上的基質(zhì))。當(dāng)用任一合適的人工手段將一段聚核苷酸轉(zhuǎn)移到某細(xì)胞內(nèi)，或該細(xì)胞是遺傳了 多核苷酸的原來(lái)改變的細(xì)胞的后代時(shí)，則稱(chēng)細(xì)胞為“遺傳改變的”或“轉(zhuǎn)染的”細(xì)胞， 或“遺傳轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞。多核苷酸通常包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄序列，使細(xì)胞 能在提高的水平上表達(dá)蛋白質(zhì)。如果改變的細(xì)胞的子代有相同的變化，則稱(chēng)遺傳改變?yōu)?br> “可遺傳的”。通用技術(shù)分子遺傳學(xué)和基因工程中的通用方法可參見(jiàn)“Molecular Cloning A laboratoryManual” (Sambrook 等，Cold Spring Harbor) ； “Gene Transfer Vectors forMammalian Cells” (Miller & Calos 編)禾P "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M.Ausubel等，Wiley & Sons)。細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和抗體技術(shù)可參見(jiàn)"Current Protocolsin Protein Sceince” (J.E.Colligan 等，Wiley & Sons) ； “ Current Protocols in CellBiology”(J.S.Bonifacino 等，Wiley & Sons)禾口 "Current Protocols in Immunology” (J. E.Colligan等，Wiley & Sons)。 試劑、克隆載體和基因操作所用的試劑盒可向例如 BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTeck 禾口 Sigma-Aldrich Co.等廠商購(gòu)買(mǎi)。細(xì)胞培養(yǎng)方法可參見(jiàn)最新版的“Culture of Animal Cells A Manual of BasicTechnique” (R.I.Freshney 編，Wiley & Sons) ； General Techniques of CellCulture (M. A.Harrison & I.F.Rae.， Cambridge Univ.Press)禾口 “Embryonic StemCells Methods and Protocols” (K.Turksen 等，Humana Press)。組織培養(yǎng)物和試劑可向 Gibco/BRL、 Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co.禾口 ICNBiomedicals 等廠商購(gòu)買(mǎi)。與本公開(kāi)有關(guān)的具體文獻(xiàn)包括Blood Cell Biochemistry, Plenum Pub.Corp. 禾口 Kluwer Academic Publishers ; M.R.Koller & B.Palsson 編，PrimaryHematopoietic Cells (Human Cell Culture, Vol.4), Kluwar Academic Publishers, 1999 ； Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of MyeloproliferativeDisease 第 11 次研討會(huì)，Bormio,
1998年 6 月(Acta Haematologica 101/2)，N.G.Abraham 等編，S.Karger Publishing,
1999； The Essential Dracula，B.Stoker, L.Wolf & C.Bing, Penguin Putnam, 1993 ； 禾口 Hematopoiesis ； A DevelopmentalApproach, L.I.Zon 編，第一版，Oxford University Press, 2001。干細(xì)胞來(lái)源本發(fā)明可用各種干細(xì)胞來(lái)實(shí)施。其中，適用于本發(fā)明的有妊娠后形成組織的靈 長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞(pPS)，或妊娠期任何時(shí)間的胚泡或胚胎組織。非限定性例子是胚胎 干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)物或已建立的細(xì)胞系，詳見(jiàn)后文。本發(fā)明也以直接用原代胚胎或胎兒組織來(lái)實(shí)施，即直接由能夠產(chǎn)生造血細(xì)胞的 原代細(xì)胞衍生獲得造血細(xì)胞，而無(wú)需先建立未分化細(xì)胞系。在一些情況下，本發(fā)明的幾 個(gè)方面可以用臍帶血、胎盤(pán)或一些成年組織的多能細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞可自靈長(zhǎng)動(dòng)物的胚泡分離獲得(美國(guó)專(zhuān)利5,843,780 ； Thomson等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 7844，1995)。人胚胎干細(xì)胞(hES)可由人胚泡細(xì)胞制得，方 法參見(jiàn)Thomson等(美國(guó)專(zhuān)利 6,200,806 ； Science 282 1145，1998 ； Curr.Top.Dev.Biol., 38: 133ff, 1998)和 Reubinoff 等，Nature Biotch. 18 399，2000)。與 hES 相當(dāng)?shù)募?xì)胞包 括它們的多能衍生物，例如原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞，參見(jiàn)W001/51610(Bresagen)。hES細(xì)胞可由人植入前胚胎制備。或者，也可用體外授精(IVF)的胚胎，還使 單細(xì)胞人胚胎擴(kuò)增到胚泡階段(Bongso等，HumReprod 4: 706，1998)?？稍贕1.2和 G22.培養(yǎng)基中將胚培養(yǎng)至胚泡階段(Gardner等，F(xiàn)ertil.Steril.69 84，1998)。通過(guò)與鏈 霉蛋白酶(Sigma)的短暫接觸從發(fā)育的胚泡中除去透明帶(zonapellucida)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)通過(guò) 免疫手術(shù)分離獲得，手術(shù)中，胚泡與兔抗人脾細(xì)胞抗血清的1 50稀釋液接觸30分鐘， 然后在DMEM中洗滌三次，每次5分鐘，然后與豚鼠補(bǔ)體(Gibco)的1 5稀釋液接觸3 分鐘(Solter 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72 5099，1975)。DMEM 中再洗滌 2 次后，從完整細(xì)胞團(tuán)(ICM)中用移液管小心去除裂解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，然后將ICM接種在mEF 飼養(yǎng)細(xì)胞層上。9至15天后，通過(guò)與含ImM EDTA的無(wú)鈣、無(wú)鎂的磷酸鹽緩沖液(PBS)接觸， 或分散酶或胰蛋白酶接觸，或用微量移液管機(jī)械分離，將由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的生長(zhǎng)物分散 成小塊；然后，再接種在新鮮培養(yǎng)基中的mEF上。用微量移液管挑出含有未分化形態(tài)的 正在生長(zhǎng)的單集落，機(jī)械分散，再平板培養(yǎng)。ES樣形態(tài)的特征是集落致密，顯著的高 核/質(zhì)比，核仁明顯。然后，通過(guò)胰蛋白酶消化，Dulbecco' s PBS (含2mM EDTA)處 理，IV型膠原酶(約200U/ml，Gibco)處理或用微量移液管挑選單個(gè)集落，使所得ES 細(xì)胞每隔1至2周常規(guī)分散一次。最佳集落塊大小約為50-100細(xì)胞。胚胎牛殖細(xì)胞人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞可由距最后一次月經(jīng)后約8-11周時(shí)采集的人胎材料中的 原始生殖細(xì)胞來(lái)制備。合適的制備方法參見(jiàn)Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 13726，1998 和美國(guó)專(zhuān)利 6,090,622。簡(jiǎn)而言之，處理性腺嵴形成不聚集的細(xì)胞。EG的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是DMEM， 4500mg/L D-葡萄糖，2200mg/L mM NaHC03 ； 15 % ES 級(jí)(ES 合格的)胎牛血清 (BRL) ； 2mM谷氨酰胺(BRL) ； ImM丙酮酸鈉(BRL) ； 1000_2000U/ml人重組白血病 抑制因子(LIF，Genzyme) ； l_2ng/ml 人重組 bFGF (Genzyme)和 10yM 毛喉素(10% 的DMSO溶液)。由亞匯合的飼養(yǎng)細(xì)胞層(例如STO細(xì)胞，ATCC No.CRL1503)制備的 96孔組織培養(yǎng)板，在無(wú)LIF、bFGF和毛喉素的改良EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后用 5000rad的Y -輻射滅活。在每孔中加入約2ml原代生殖細(xì)胞(PGC)。在EG生長(zhǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)7-10天后進(jìn)行第一次傳代，將每孔中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板的孔中，后者 預(yù)先用輻照過(guò)的STO小鼠成纖維細(xì)胞制備過(guò)。培養(yǎng)細(xì)胞，每日更換新鮮培養(yǎng)基，直至觀 察到符合EG細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，一般需7-30天或1-4代。非分化狀態(tài)下pPS細(xì)胞的增殖采用促進(jìn)增殖但不促進(jìn)分化的培養(yǎng)條件，可使pPS細(xì)胞可在培養(yǎng)物中持續(xù)繁 殖。例如采用含血清的ES培養(yǎng)基，其中含80% DMEM(例如敲除DMEM，Gibco), 20%確定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或代血清(W098/30679)，非必需氨基酸， ImM L-谷氨酰胺和0.ImM 巰基乙醇。臨用前，加入4ng/ml人bFGF(W099/20741， Geron Corp.)。通常將ES細(xì)胞培養(yǎng)在一層飼養(yǎng)細(xì)胞上，飼養(yǎng)細(xì)胞一般為衍生自胚組織或胎組織 的成纖維細(xì)胞。從懷孕13天的CF1小鼠收集胚胎，轉(zhuǎn)移到2ml胰蛋白酶/EDTA中，然 后小心切碎，37°C溫育5分鐘。加入10%FBS，使碎片沉淀，細(xì)胞在90%DMEM、10% FBS和2mM谷氨酰胺中增殖。為了制備飼養(yǎng)細(xì)胞層，輻照細(xì)胞以抑制增殖，但允許其合 成支持ES細(xì)胞的因子(約4000rad Y _輻射)。用0.5%明膠包被培養(yǎng)板過(guò)夜，每孔接種 375,000輻射過(guò)的mEF，并在接種5小時(shí)到4天使用。在接種pPS細(xì)胞之前用新鮮hES 培養(yǎng)基置換該培養(yǎng)基。Geron的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，既使不用飼養(yǎng)細(xì)胞也可將pPS細(xì)胞維持于非分化狀態(tài)。無(wú) 飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括合適的培養(yǎng)基質(zhì)，尤其是胞外基質(zhì)，例如Matrigel 或?qū)诱尺B 蛋白。pPS細(xì)胞以> 15,000個(gè)細(xì)胞/cm2(最佳是90,000cm2_170,000cm2)接種。通常，在細(xì)胞完全分散前終止酶解(例如，用IV膠原酶處理約5分鐘)。然后將約10-2000個(gè) 細(xì)胞左右的細(xì)胞塊不再進(jìn)一步分散直接接種在基質(zhì)上。另外，在板達(dá)到匯合之前，可通 過(guò)用0.5mMEDTA的PBS溶液溫育5分鐘，不用酶收集細(xì)胞。從培養(yǎng)容器中洗下后，將 細(xì)胞鋪在新的培養(yǎng)物中，不用進(jìn)一步分散。用含有支持細(xì)胞增殖但不支持分化的因子的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基來(lái)支持無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 物。可通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分泌此類(lèi)因子的細(xì)胞，將這類(lèi)因子引入培養(yǎng)基中，例如輻照 過(guò)的(約4000rad)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、端粒化的小鼠成纖維細(xì)胞或衍生自pPS細(xì) 胞的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞?？蓷l件化培養(yǎng)基，例如在無(wú)血清培養(yǎng)基(例如補(bǔ)充了 20%代血 清和4ng/ml bFGF的KO DMEM)中以約5_6 X 104/cm2的密度接種飼養(yǎng)細(xì)胞。已條件化 1-2天的培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充bFGF，然后用于支持1-2天的pPS細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，還 可加入其它因子，來(lái)幫助增殖而不分化，例如FGF-2或FGF-4受體的配體，c_kit (例如 干細(xì)胞因子)的配體，與gpl30相關(guān)受體的配體、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂類(lèi)、膽固醇、核 苷、丙酮酸和還原劑如巰基乙醇。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)法的其它特征可參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利出 版物 WOO 1/51616 和 Xu 等，Nat.Biotechnol.19 971，2001 中所述。顯微鏡下，ES細(xì)胞呈高核/質(zhì)比，核仁明顯，形成的集落致密，細(xì)胞連接看不 清楚。靈長(zhǎng)動(dòng)物ES細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA) 3和4，以及可用抗體測(cè)知的 標(biāo)記 Tra-1-60 和 Tra-1-81 (Thomson 等，Science 282 1145，1998)。小鼠 ES 細(xì)胞可用 作SSEA-1的陽(yáng)性對(duì)照和SSEA-4、Tra-1-60和Tra_l_81的陰性對(duì)照。SSEA-4也存在 于人胚胎性癌(hEC)細(xì)胞上。pPS的體外分化不表達(dá)SSEA-4、Tra-1-60和Tra_l_81， 但提高了 SSEA-1的表達(dá)，這也見(jiàn)于hEG細(xì)胞。制備造血細(xì)胞及其衍生物的材料和方法可通過(guò)在特殊的、能夠富集具有所需表型的細(xì)胞(通過(guò)所需細(xì)胞生長(zhǎng)，或者抑 制或殺死其它細(xì)胞類(lèi)型)的生長(zhǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)、分化或重新對(duì)干細(xì)胞程序控制，獲得本 發(fā)明的造血細(xì)胞。這些方法可用于許多類(lèi)型的干細(xì)胞，包括前面所述的靈長(zhǎng)類(lèi)多能干細(xì) 胞。當(dāng)從已建立的pPS細(xì)胞譜系衍生時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞群和分離的細(xì)胞與衍生出它 們的細(xì)胞系具有相同的基因組。這意味著除了核型異常外，在pPS細(xì)胞和造血細(xì)胞之間 的染色體DNA有90%以上是相同的，如果造血細(xì)胞是通過(guò)正常有絲分裂過(guò)程從未分化的 細(xì)胞系獲得的，這是不言而喻的。用重組方法處理過(guò)，以引入轉(zhuǎn)基因或敲除一個(gè)內(nèi)源基 因的造血細(xì)胞也還是被認(rèn)為與衍生出它們的細(xì)胞系具有相同的基因組，因?yàn)樗袥](méi)有操 作的基因元件都被保留了。分化過(guò)程的引發(fā)雖然對(duì)于本發(fā)明造血細(xì)胞的衍生不是必需的，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行衍生的一種有效方法是 以非特異性方式引發(fā)分化。一種方法是導(dǎo)致pPS細(xì)胞形成胚狀體或聚集體例如，通過(guò) 使供體pPS細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)度生長(zhǎng)，或在具有低粘著性基質(zhì)的培養(yǎng)容器中懸浮培養(yǎng)pPS細(xì) 胞，從而形成胚狀體。從培養(yǎng)物收集未分化的pPS細(xì)胞，分離成簇，然后將它們鋪在非 粘附細(xì)胞培養(yǎng)板上，在支持分化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(實(shí)施例1)。在該方法的一個(gè)變化形式 中，從未分化的細(xì)胞培養(yǎng)物中以條狀剝下pPS細(xì)胞，然后在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，聚集形 成圓形的細(xì)胞團(tuán)塊(實(shí)施例2)。
收回抑制分化的因子(例如可能存在于培養(yǎng)pPS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中)是分化 過(guò)程的一部分。在某些情況下，逐漸回收這些因子，例如通過(guò)使用較低密度的飼養(yǎng)細(xì)胞 調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基是有益的(實(shí)施例3)。以非特異方式分化pPS細(xì)胞的其它方法是已知的， 而且也適合引發(fā)產(chǎn)生造血細(xì)胞的過(guò)程例如，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入視黃酸(RA)或二甲 亞砜(DMSO)；通過(guò)從培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)胞外介質(zhì)中回收(W001/51616)，或形成原始外 胚層樣細(xì)胞(Rathjen 等，J.Cell Sci.112 601，1999)。驅(qū)動(dòng)向造血細(xì)胞分化為了將培養(yǎng)物引向造血細(xì)胞途徑，在造血細(xì)胞分化因子混合物中培養(yǎng)未分化的 或引發(fā)的pPS細(xì)胞。各因子單獨(dú)或聯(lián)合可以指導(dǎo)細(xì)胞沿造血細(xì)胞途徑下游分化，導(dǎo)致 生長(zhǎng)出有造血細(xì)胞表型的細(xì)胞，抑制其它細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)，或以另一種形式富集造血細(xì) 胞實(shí)施本發(fā)明不需要知道作用機(jī)制。造血細(xì)胞因子組合的例子包括干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素-3(IL_3)、白 細(xì)胞介素-6(IL_6)、粒細(xì)胞-集落-刺激因子(G-CSF)-單獨(dú)或與骨形態(tài)發(fā)生蛋白，例 如BMP-2、BMP-4或BMP-7組合。SCF通過(guò)c_kit配體介導(dǎo)的二聚化誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)， 它是與血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-SCF)、Flt-3配體和 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體有關(guān)的受體酪氨酸激酶。其它感興趣的因子包括刺猬蛋 白(SHH)、Delta-1> Jagged-1和促血小板生成素(TPO)。如實(shí)施例9和10所示，看來(lái) 細(xì)胞因子能促進(jìn)CD45表型(造血前體細(xì)胞)的形成，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白能促進(jìn)具有自我 更新能力的前體細(xì)胞擴(kuò)增。通常合用至少兩種、三種或三種以上這樣的因子來(lái)建立分化混合物。優(yōu)選人蛋 白，但也可使用物種同源物和變體。讀者可以用能結(jié)合相同受體或刺激相同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑的其它配體，例如受體特異性抗體來(lái)替換任意的這些因子。另外，可在培養(yǎng)基中加入 其它成分，以中和其它因子(這些因子可能存在，以驅(qū)動(dòng)沿不同途徑下游分化)的效果。 一個(gè)例子是神經(jīng)生長(zhǎng)因子的抗體，據(jù)信它幫助最大程度減少沿神經(jīng)原性分化方向的細(xì)胞 損失。以能支持所需細(xì)胞群擴(kuò)增的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，例如含有牛清蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白 的無(wú)血清培養(yǎng)基(SF)配制分化混合物。未分化或已引發(fā)的pPS細(xì)胞在因子混合物中培養(yǎng)足夠的時(shí)間，使得所需表型出 現(xiàn)。選擇營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)物是重要的，因?yàn)槟承┡浞礁С址只^(guò)程。在培養(yǎng)基中加入胎牛血 清(或其等價(jià)物)增強(qiáng)造血細(xì)胞分化因子的活性，比僅含清蛋白和激素的簡(jiǎn)單混合物高得 多。在某些情況下，對(duì)此種培養(yǎng)物的好處超過(guò)支持造血細(xì)胞增殖的纖連蛋白等底物。與先前的預(yù)測(cè)相反，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有共同培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞情況下，可高效的進(jìn)行pPS 細(xì)胞到造血細(xì)胞的分化。因此，本發(fā)明包括一種形成造血細(xì)胞的方法，該方法中在沒(méi)有 含基因組的細(xì)胞(至少直到在細(xì)胞群的大部分中出現(xiàn)造血表型以前)的情況下，培養(yǎng)分 化的pPS細(xì)胞子代。這意味著在培養(yǎng)物中沒(méi)有同種異型或異種細(xì)胞，例如飼養(yǎng)細(xì)胞、基 質(zhì)細(xì)胞或其它能提供分化因子或支持基質(zhì)的細(xì)胞。然而，允許在該培養(yǎng)基中包括這些細(xì) 胞，作為該方法的輔助手段，除非明顯被排除?？纱龠M(jìn)分化過(guò)程的細(xì)胞包括從人骨髓分 離的原代基質(zhì)細(xì)胞，和MS-5小鼠基質(zhì)細(xì)胞系的細(xì)胞。用本發(fā)明的技術(shù)，可從pPS細(xì)胞衍生出具有攜帶祖細(xì)胞表型的造血細(xì)胞群，而 這種祖細(xì)胞表型的比例是無(wú)先例的。SHH、BMP-4、SCF、IL_3、Flt_3L和IL_6的不同組合能夠誘導(dǎo)表型和功能性造血祖細(xì)胞。在實(shí)施例3-5中，通過(guò)培養(yǎng)胚狀體10天，然 后在含有 100-300ng/ml 的 SCF 和 Flt_3L、10_50ng/ml IL-3、IL-6 和 G-CSF、lOOng/mL SHH和5-lOOng/mL BMP_4(全都在含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基中或含有清蛋白、轉(zhuǎn)鐵 蛋白和胰島素的無(wú)血清培養(yǎng)基中)的環(huán)境中接種，引發(fā)pPS細(xì)胞分化。8-15天后，造血 細(xì)胞出現(xiàn)，其中8%CD45陽(yáng)性、22%CD34陽(yáng)性、5.6%對(duì)于兩種標(biāo)記都是陽(yáng)性的。當(dāng) 在CFU試驗(yàn)中測(cè)試時(shí)，接種效率是350個(gè)中有一個(gè)，具重復(fù)性。在實(shí)施例9和10中， 在胚狀體形成后翌日，在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子和BMP-4，然后在15-22日后進(jìn)一步增 加CD45陽(yáng)性細(xì)胞的比例。BMP-4的存在使得用戶(hù)能夠獲得細(xì)胞群，其中每個(gè)原代CFU 形成4、10或更多的次生CFU，表明自身更新性造血祖細(xì)胞存在。pPS衍生的造血細(xì)胞的進(jìn)一步成熟根據(jù)上面的描述獲得了含有高比例的祖細(xì)胞pPS衍生的造血細(xì)胞，這對(duì)于治療 彌散性造血細(xì)胞不足和體外研究造血細(xì)胞分化具有特別的意義。本發(fā)明還包括可用于治 療特定病況和某些體外藥物篩選應(yīng)用的更成熟的細(xì)胞群。有兩種方法可獲得本發(fā)明的成熟造血細(xì)胞。在一種方法中，通過(guò)在含有合適的 成熟因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)一步分化上面獲得的造血細(xì)胞群。在另一種方法中，以非 特異性方式引發(fā)分化的細(xì)胞群被直接進(jìn)入成熟步驟。所用的促成熟細(xì)胞因子視最終的細(xì)胞類(lèi)型而定。如實(shí)施例4所述，可通過(guò)在含 有SCF、GM-CSF、IL-3和促血小板生成素(EPO)的環(huán)境中培養(yǎng)，從胚狀體產(chǎn)生造血細(xì) 胞集落。這驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)物朝骨髓細(xì)胞衍生，得到含有約66%的紅細(xì)胞樣細(xì)胞集落、約19% 單核細(xì)胞集落、和約15%粒細(xì)胞集落的培養(yǎng)物?？捎玫钠渌蜃影＜?xì)胞的G-CSF、 單核細(xì)胞的M-CSF、淋巴樣細(xì)胞的IL-2和IL-4、巨核細(xì)胞的TPO和紅細(xì)胞樣細(xì)胞的 EPOo造血細(xì)胞的特征可根據(jù)許多表型標(biāo)準(zhǔn)特征分析細(xì)胞。這些標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于顯微鏡觀察形態(tài)特 征、檢測(cè)或定量表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記、體外可測(cè)定的功能性標(biāo)準(zhǔn)、和灌注入宿主動(dòng)物后的行 為。表型標(biāo)志未分化的hES 細(xì)胞SSEA-4、Oct_4原始造血細(xì)胞CD34、AC133、c_kit、CD38。成熟多能造血細(xì)胞CD45紅細(xì)胞樣細(xì)胞血型糖蛋白A早期骨髓細(xì)胞CD33單核細(xì)胞CD14、CD64、HLAII類(lèi)粒細(xì)胞CD13、CD15淋巴樣細(xì)胞CD 19、免疫球蛋白(B細(xì)胞)、CD3(T細(xì)胞)巨核細(xì)胞CD56可用任何合適的免疫學(xué)技術(shù)，例如細(xì)胞表面標(biāo)記的流式免疫細(xì)胞化學(xué)，或胞內(nèi) 或細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫組織化學(xué)(例如固定細(xì)胞或組織切片)，來(lái)檢測(cè)組織特異性標(biāo)記。 Gallacher等，Blood 96: 1740，2000提供了詳細(xì)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的方法。如果在標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞計(jì)數(shù)中，任選在細(xì)胞固定后，和任選使用標(biāo)記的二抗或其它 偶聯(lián)物放大標(biāo)記后，顯著可檢測(cè)量的抗體與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，定義細(xì)胞表面抗原的 表達(dá)為陽(yáng)性。還可通過(guò)Northern印跡分析、斑點(diǎn)印跡雜交分析或通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶引發(fā)的聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，用序列特異性探針，以標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法在mRNA水平檢測(cè)組織特異 性基因產(chǎn)物的表達(dá)。見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,843,780。該公開(kāi)文獻(xiàn)中列出的具體標(biāo)記的序列數(shù)據(jù) 可從公共數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GenBank中獲得。本發(fā)明的一些實(shí)施例涉及的造血細(xì)胞中至少5%、10%, 20%或40%CD34陽(yáng) 性；1 %、2%、5 %或10 % CD45陽(yáng)性(或與CD34雙陽(yáng)性)；50 %、70 %或90 %為 CD14、CD14、CD19陽(yáng)性；和不到5%、1 %或0.2%以下對(duì)SSEA-4陽(yáng)性或Oct_4陽(yáng)性。 這些特征的不同組合可存在于特定的細(xì)胞群中。功能性特征可用功能標(biāo)準(zhǔn)確定本發(fā)明的細(xì)胞的特征。見(jiàn)T.A.Bock(Stem Cells 15Suppl 1 185，1997)對(duì)于造血祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)回顧。常用的復(fù)制性造血細(xì)胞測(cè)試是這些細(xì)胞在集落形成(CFU)試驗(yàn)中形成集落的能 力。經(jīng)典試驗(yàn)是Till和McCulloch(Ser.Haematol 5 15，1972)的脾集落形成試驗(yàn)。現(xiàn)
在，集落形成試驗(yàn)通常在補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子的甲基纖維素基質(zhì)中進(jìn)行。除了另有特別要求 外，本文所指的CFU試驗(yàn)是如實(shí)施例2所述進(jìn)行的。一旦形成集落，可通過(guò)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估并分類(lèi)成爆發(fā)集落形成單位_紅 細(xì)胞樣細(xì)胞(BFU-E)、集落形成單位_粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞(CFU-GM)、集落形成單位-巨 核細(xì)胞(CFU-M)、集落形成單位_紅細(xì)胞樣細(xì)胞(CFU-E)和可產(chǎn)生全部4種細(xì)胞類(lèi)型的 多能集落(CFU-GEMM)。接種效率是輸入細(xì)胞對(duì)形成集落之比。根據(jù)本發(fā)明的方法制 備的造血細(xì)胞可具有大于1/2000、1/500，在某些情況下大于1/100的接種效率?？筛鶕?jù)這些細(xì)胞的已知特征確定最終分化的細(xì)胞的功能標(biāo)準(zhǔn)例如，巨噬細(xì)胞 吞噬顆粒、遞呈抗原或響應(yīng)合適的細(xì)胞因子的能力；粒細(xì)胞和血小板釋放合適的介質(zhì)的 能力；和淋巴細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，響應(yīng)受過(guò)輻射的同種異體刺激細(xì)胞的增殖能 力。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)對(duì)造血細(xì)胞在臨床中具有可觀興趣是由于細(xì)胞群重建宿主動(dòng)物的造血系統(tǒng)的能 力?？捎脦追N完全建立的動(dòng)物模型測(cè)試重建?？稍诮?jīng)過(guò)基因改造，預(yù)防異植體排斥的小鼠中評(píng)估造血活性細(xì)胞的重建。特別 推薦的是NOD/SCID小鼠，它含有非肥胖性糖尿病(NOD)基因型，與具有重度聯(lián)合免疫 缺損(SCID)的小鼠雜交。Larochelle 等，Nat.Med.2 1329，1996 ； Dick 等，Stem Cells 15: 199，1997 ；和 Vormoor 等，J.Hematother.2 215，1993 描述了該模型的用途。簡(jiǎn)單
說(shuō)，對(duì)小鼠進(jìn)行亞致死輻照，然后通過(guò)尾靜脈注射約3-4X106CD34陽(yáng)性細(xì)胞。8周后， 從股、脛或髂嵴收集骨髓細(xì)胞，進(jìn)行表面表型和CFU試驗(yàn)分析，證明用施用的人細(xì)胞重 建。由于重建產(chǎn)生了嵌合現(xiàn)象和一定程度的免疫耐受，可在較不嚴(yán)重受損的免疫系統(tǒng)， 例如(為了增加精確性)未輻照的NOD/SCID小鼠、常規(guī)SCID小鼠、裸鼠和有免疫能力 的小鼠中測(cè)試該造血細(xì)胞。
可在其它動(dòng)物模型中對(duì)造血能力進(jìn)行進(jìn)一步的臨床前研究。合適的大型動(dòng)物異 植體模型是綿羊，利用其胎兒骨髓中胎兒免疫力未成熟和發(fā)育空間使得可移植造血干細(xì) 胞，而不需要條件化骨髓。這避免了與輻照、化療或遺傳缺陷性宿主有關(guān)的可能基質(zhì)異 常。在該模型中，人干細(xì)胞在骨髓中定居并持續(xù)多年，能夠多譜系分化，顯示對(duì)人細(xì)胞 因子的應(yīng)答性，并保留移植到次代受體的能力。見(jiàn)Zanjani等，IntJ.Hematol.63: 179， 1996 ；和Zanjani等，J.Clin.Invest.Med.93 1051，1994。C.E.Dunbar, J.Intern.Med.249 329，2001 和 Donahue 等，Hum.Gene Ther.12 607，2001 提供了靈長(zhǎng)類(lèi)模型。還可在 非人靈長(zhǎng)類(lèi)中，用匹配的非人pPS細(xì)胞制備物測(cè)試本發(fā)明的細(xì)胞群能否分化成造血細(xì) 胞。見(jiàn) Thomson 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 7844，1995 ；和 Thomson 等，Bio. Reprod.55 254，1996。造血細(xì)胞的基因修飾本發(fā)明的造血細(xì)胞具有顯著的增殖能力。如需要，可通過(guò)提高細(xì)胞中的端粒酶 反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)水平，或提高內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或引入轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步增強(qiáng)其復(fù)制能力。 特別合適的是國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W098/14592中的人端粒酶(hTERT)的催化成分。Bodnar 等，Science 279: 348，1998 和 Jiang 等，Nat.Genet.21: 111，1999 描述了人細(xì)胞中端粒 酶的轉(zhuǎn)染和表達(dá)?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)RT-PCR、端粒酶活性(TRAP分析)、hTERT 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、或復(fù)制能力評(píng)估基因改變的細(xì)胞的hTERT表達(dá)。還考慮了無(wú)限增 殖細(xì)胞的其它方法，例如用編碼myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞(美國(guó) 專(zhuān)利 5,869,243，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng) W097/32972 和 WOO 1/23555)。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞群顯著沒(méi)有未分化的pPS細(xì)胞。如需要，可體外 制備本發(fā)明的細(xì)胞，或進(jìn)一步處理以除去未分化的細(xì)胞，或保護(hù)避免體內(nèi)成為回復(fù)體。 從細(xì)胞群中消除未分化干細(xì)胞的一種方法是用一種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞群，其中效應(yīng)基因在一 啟動(dòng)子控制下，該啟動(dòng)子導(dǎo)致在未分化細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)_例如TERT啟動(dòng)子或OCT-4啟 動(dòng)子。效應(yīng)基因可以是指導(dǎo)細(xì)胞分揀的報(bào)道基因，例如綠色熒光蛋白。效應(yīng)物可以直接 裂解細(xì)胞，編碼例如毒素或凋亡的介體，例如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Shinoura 等，Cancer GeneTher.7 739，2000)。效應(yīng)基因可以使得細(xì)胞對(duì)外源藥劑，例如抗體 或前藥的毒性效果敏感。一個(gè)例子是單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因，它導(dǎo)致表達(dá)它 的細(xì)胞對(duì)更昔洛韋敏感(WO 02/42445)?；蛘撸?yīng)物可以導(dǎo)致細(xì)胞表面表達(dá)一種外 源決定簇，該決定簇能使任何回復(fù)成未分化表型的細(xì)胞對(duì)體內(nèi)天然存在的抗體敏感(GB 0128409.0)。本發(fā)明的細(xì)胞可以經(jīng)基因改造而增強(qiáng)它們參與組織再生的能力，或?qū)κ艿街委?的個(gè)體傳遞治療性基因。用所需基因的已知編碼序列，與組成型或在造血細(xì)胞中特別活 躍的啟動(dòng)子操縱性連接，設(shè)計(jì)載體。下文描述了基因治療中轉(zhuǎn)基因的用途。造血前體細(xì)胞及其衍生物的用途本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生大量紅細(xì)胞樣細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞和淋 巴樣細(xì)胞系的造血前體細(xì)胞和造血細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞群可用于許多重要的研究、開(kāi) 發(fā)和商業(yè)目的。本發(fā)明的細(xì)胞可用于制備一種cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)相對(duì)不含有在其它細(xì)胞系細(xì) 胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的cDNA。本發(fā)明的分化細(xì)胞還可用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備對(duì)造血前體細(xì)胞的標(biāo)記及其衍生物具有特異性的單克隆或多克隆的抗體。特別感興趣的是本發(fā)明的組合物可用于造血細(xì)胞病理學(xué)的藥物開(kāi)發(fā)、臨床治 療、和在其它類(lèi)型移植治療中誘導(dǎo)選擇性免疫耐受。藥物篩選本發(fā)明的造血細(xì)胞可用于篩選能影響造血前體細(xì)胞及其各種子代的特性的因子 (例如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸)或環(huán)境條件(例如培養(yǎng)條件或操作條件)。在一些應(yīng)用中，用pPS細(xì)胞(未分化或加入分化樣式)篩選促使造血細(xì)胞成熟， 或促使這樣的細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)物中增殖或維持的因子。例如，可通過(guò)將其加入不同孔的 細(xì)胞中，然后測(cè)定其導(dǎo)致的表型改變，根據(jù)所需的進(jìn)一步培養(yǎng)和細(xì)胞用途的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)試 候選的成熟因子或生長(zhǎng)因子。本發(fā)明的其它篩選應(yīng)用涉及測(cè)試藥物組合物對(duì)造血細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育或毒性的潛 在影響。進(jìn)行這類(lèi)篩選是因?yàn)橐O(shè)計(jì)對(duì)造血細(xì)胞具有藥物療效的化合物，或者是因?yàn)橐?設(shè)計(jì)對(duì)與造血系統(tǒng)有不良副作用的化合物。讀者一般可參考標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”， Academic Press, 1997，和美國(guó)專(zhuān)利5,030,015。候選藥物化合物活性的評(píng)估一般涉及將本 發(fā)明的分化的細(xì)胞與候選化合物單獨(dú)混合或與其它藥物混合。本研究者可通過(guò)測(cè)定該化 合物引起的細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)記表型、或功能活性的任何改變(與未處理的細(xì)胞或用惰性化 合物處理的細(xì)胞相比)，然后將該化合物的作用與觀察到的改變相關(guān)聯(lián)?？墒紫韧ㄟ^(guò)對(duì)細(xì)胞活力、存活、形態(tài)和某些標(biāo)記和受體的表達(dá)的影響來(lái)測(cè)定細(xì) 胞毒性?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定DNA合成或修復(fù)來(lái)確定藥物對(duì)染色體DNA的作用。[3Hh胸腺嘧 啶或BrdU摻入法，尤其是在細(xì)胞周期中不定時(shí)間的摻入，或高于細(xì)胞復(fù)制所需的水平 是與藥效一致的。不良影響還包括用中期涂布法確定的姐妹染色單體交換的異常速率。 讀者可參考 A.Vickers ( "In vitro Methods inPharmaceutical Research” , Academic Press, 1997” pp.375-410)的進(jìn)一步詳述?？捎萌魏螛?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)觀察表型或造血細(xì)胞活性，評(píng)估細(xì)胞功能的影響。包括對(duì)表 型標(biāo)記的分析和衡接觸藥物導(dǎo)致的各種表型平衡中的變化。還包括前述集落形成試驗(yàn)和
重建試驗(yàn)。造血細(xì)胞重建本發(fā)明還提供了用造血前體細(xì)胞或其衍生物恢復(fù)需要該治療的病人體內(nèi)的造血 功能。可用造血祖細(xì)胞群和衍生的細(xì)胞群治療急性或慢性造血功能紊亂。這些病況包 括先天或后天的紅細(xì)胞樣細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞、或淋巴樣細(xì)胞譜系的基 因缺陷，不健全的造血能力導(dǎo)致的貧血、或免疫缺陷、或造血細(xì)胞中毒。例子是鐮刀細(xì) 胞貧血、再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良綜合征、偶爾接觸輻射、和有生命危險(xiǎn)的自身 免疫性疾病，例如狼瘡。特別感興趣的是治療癌癥，例如白細(xì)胞、淋巴瘤和某些化療敏感的和轉(zhuǎn)移活躍 的實(shí)性腫瘤，例如骨髓瘤和乳癌。病人經(jīng)歷骨髓燒蝕輻射(1200cGy)或用環(huán)磷酰胺、塞 替哌或依托泊甙等藥物的化療，然后用本發(fā)明的造血細(xì)胞重建。預(yù)先培養(yǎng)大量的這些細(xì) 胞的能力節(jié)約了自體骨髓移植的時(shí)間限制，并消除了由于自身細(xì)胞制備物中殘留的腫瘤細(xì)胞重新引入腫瘤的危險(xiǎn)。只要可能，待給予細(xì)胞的組織相容性和待治療病人的組織相容性相匹配是有益 的。相同的匹配、或在HLA-A、HLA-B,和HLA-DR座位匹配的細(xì)胞是優(yōu)選的。大 獲得型pPS細(xì)胞衍生的造血細(xì)胞祖細(xì)胞庫(kù)，尤其是HLA等位基因純合子細(xì)胞使得匹配更容易。當(dāng)不能得到精確匹配時(shí)，在一個(gè)或兩個(gè)I類(lèi)或II類(lèi) 基因座的匹配也是有幫助的。在某些這樣的情況下，進(jìn)一步操縱細(xì)胞可幫助最大程度減 少移植物抗宿主疾病(GVHD)-例如給予去除了 T細(xì)胞的細(xì)胞群(例如用針對(duì)CD2、CD3 或CD4的抗體去除T細(xì)胞)。通常將要施用的造血細(xì)胞以無(wú)菌等滲緩沖液配制成濃縮細(xì)胞懸液。融化冷藏或 低溫保藏的袋裝干細(xì)胞，并以20-50ml等份通過(guò)中央靜脈導(dǎo)管灌注。粗略的說(shuō)，每公斤 3.5X106CD3陽(yáng)性細(xì)胞的劑量可能是合適的，視CFU試驗(yàn)接種效率而定。在重度骨髓抑 制后，嗜中性細(xì)胞計(jì)數(shù)可能下降到100個(gè)細(xì)胞/微升以下，而輸液依賴(lài)性血小板減少癥低 于10000/微升，病人應(yīng)補(bǔ)充血小板和匹配的紅細(xì)胞。移植物首先出現(xiàn)在約7-21日，其 標(biāo)志是在血液中觀察到嗜中性粒細(xì)胞和早期的造血細(xì)胞重建。一旦移植確立，造血細(xì)胞 重建是迅速的，在14-28天出現(xiàn)足夠的嗜中性粒細(xì)胞(1000/微升)和血小板(20,000/微 升)。生長(zhǎng)因子，例如G-CSF和GM-CSF可增強(qiáng)治療效果。標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)，例如Textbook of Internal Medicine，第三版，W.N.Kelley 編， Lippincott-Raven, 1997提供了造血細(xì)胞及其前體在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的一般方法；具 體的參考文獻(xiàn)可見(jiàn)例如 Hematopoietic Stem Cell Transplantation, A.D.Ho 等編，Marcel Dekker, 2000 ； Hematopoietic Cell Transplantation, E.D.Thomas 等編，Blackwell Science Inc., 1999 ； Hematopoietic Stem CellTherapy, E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。臨床治療中造血干細(xì)胞的應(yīng)用是正在進(jìn)展的領(lǐng)域，對(duì)于臨床醫(yī)師來(lái)說(shuō)可存在其 它用途。本發(fā)明的細(xì)胞的用途和劑量的最終責(zé)任由主治醫(yī)師負(fù)責(zé)?；蛑委煴景l(fā)明的細(xì)胞不僅可用于重建造血功能，還可以用于矯正或補(bǔ)充其它可通過(guò)基 因治療而改善的缺陷。造血細(xì)胞作為基因表達(dá)的儲(chǔ)存庫(kù)，具有一些優(yōu)點(diǎn)它們可在整個(gè) 體內(nèi)循環(huán)和持續(xù)再生。細(xì)胞可以在施用前體外基因修飾并測(cè)試，避免了對(duì)病人施用基因 載體的不確定性。為了進(jìn)行本發(fā)明的基因治療，可用含有治療性編碼區(qū)(在組成型或造血細(xì)胞特 異性啟動(dòng)子控制下)的轉(zhuǎn)基因，以能建立穩(wěn)定修飾的技術(shù)；例如反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載 體，或通過(guò)同源重組修飾所述細(xì)胞。修飾可以在造血細(xì)胞的增殖性培養(yǎng)物上進(jìn)行，也可 以在pPS細(xì)胞未分化時(shí)進(jìn)行修飾，然后分化。然后評(píng)估細(xì)胞的造血功能和轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)。在充分測(cè)試后，對(duì)需要基因治療的病人施用細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行生物化學(xué)和臨 床監(jiān)測(cè)缺陷的矯正。當(dāng)組合物與要治療的個(gè)體HLA相容時(shí)，不需要在治療之前對(duì)病人進(jìn) 行重度骨髓抑制，如果病人自身的細(xì)胞和基因改變的細(xì)胞的混合物提供了表達(dá)治療基因 的充足儲(chǔ)存庫(kù)。見(jiàn)Murdoch等(FASEB J.15 1628，2001)描述了造血干細(xì)胞作為子宮基因治療的新目標(biāo)。一般文獻(xiàn)包括 Stem Cell Biology and Gene Therapy, P.J.Quesenberry 等 編，John Wiley & Sons，1998 ； 禾口 Blood CellBiochemistrytherapy Hematopoiesis and Gene Therapy (Blood CellBiochemistry, 卷 8), L.J.Fairbairn & N.G.Testa 編，Kluwar AcademicPublishers, 1999。這些參考文獻(xiàn)討論了干細(xì)胞作為基因治療載體的治療可能 性；基因治療的傳遞系統(tǒng)和示范性臨床應(yīng)用。在再生醫(yī)學(xué)中誘導(dǎo)特異性免疫耐受的細(xì)胞組合物本發(fā)明的細(xì)胞還可以誘導(dǎo)對(duì)特定組織類(lèi)型的免疫耐受，用于準(zhǔn)備與病人不匹配 的同種異體移植物的移植。所選擇的耐受細(xì)胞應(yīng)與同種異體移植物具有相同的組織相容 性標(biāo)記，在用一類(lèi)能使病人所需要的細(xì)胞功能再生的細(xì)胞治療之前或之中施給病人。導(dǎo) 致的免疫耐受隨后減少了同種異體移植物急性或慢性排斥的危險(xiǎn)。有效的細(xì)胞組合含有兩種成分第一類(lèi)細(xì)胞用于誘導(dǎo)免疫耐受；第二類(lèi)細(xì)胞用 于再生所需的功能。可從pPS細(xì)胞和其它來(lái)源衍生出各種臨床上有用的細(xì)胞類(lèi)型，用于 再生性醫(yī)學(xué)。例如，可根據(jù)國(guó)際專(zhuān)禾IJ出版物WO 01/18804和申請(qǐng)PCT/ US02/19477 (GeronCorporation)中所述的方法從pPS細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞。在含有一種或多 種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和一種或多種有絲分裂原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的pPS細(xì)胞或胚狀體細(xì) 胞，產(chǎn)生一群細(xì)胞，其中至少約60%細(xì)胞表達(dá)A2B5、聚唾液?；鵑CAM、或Nestin，至 少能在培養(yǎng)物中倍增20次。示范性的有絲分裂原是EGF、堿性FGF、PDGF和IGF-1。 示范性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是NT-3和BDNF。然后讓正在增殖的細(xì)胞通過(guò)與不含有絲分裂原 的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子一起培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)終末分化。可產(chǎn)生含有高比例酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的 細(xì)胞群，這是產(chǎn)多巴胺神經(jīng)元的特征。可通過(guò)將pPS細(xì)胞作為細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)在含有有絲分裂原(例如FGF)，和 少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化因子(例如三碘甲腺原氨酸、硒和視黃酸)中產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞。然后將細(xì)胞鋪在固體表面，除去視黃酸，擴(kuò)增細(xì)胞群?？赏ㄟ^(guò)鋪在聚-L-賴(lài)氨酸 上，除去所有的生長(zhǎng)因子進(jìn)行終末分化?？色@得90%以上的細(xì)胞都是GalC陽(yáng)性的細(xì)胞群?？捎胮PS 根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利 6,458,589 和 PCT 出版物 WO 01/81549 (GeronCorporation)
所述的方法產(chǎn)生肝細(xì)胞。在組蛋白脫酰酶抑制劑存在下培養(yǎng)未分化的pPS細(xì)胞。在示范 性方法中，用1%DMS0(4天)，然后2.5mM組蛋白脫酰酶抑制劑正丁酸酯引發(fā)分化。 可將獲得的分化細(xì)胞在含正丁酸酯DMSO加生長(zhǎng)因子(例如EGF)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和 TGF-a的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天使其成熟?？筛鶕?jù)PCT/US02/22245中提供的方法從pPS細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞前 體。在含有影響DNA甲基化的心臟營(yíng)養(yǎng)因子，例如5-氮胞苷的生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)pPS細(xì) 胞。然后將細(xì)胞群的其它細(xì)胞通過(guò)密度離心與自發(fā)性收縮的細(xì)胞分開(kāi)。其它處理步驟可 包括在含有肌酸、卡尼汀或氨基乙磺酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞?？捎肞CT/US02/20998中所述的方法從pPS細(xì)胞產(chǎn)生成骨細(xì)胞及其祖細(xì)胞。在 含有成骨因子(例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白，特別是BMP-4、人TGF-0受體的配體、或人維生 素D受體的配體)的培養(yǎng)基中分化pPS衍生的間充質(zhì)細(xì)胞。可通過(guò)在例如活化素A、煙 酰胺等因子和其它美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/338,885中列出的其它因子中培養(yǎng)pPS細(xì)胞及其衍生物，產(chǎn)生分泌胰島素或其它胰臟激素的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/339,043中列出 的分化因子的有效組合一起，以微聚集體培養(yǎng)pPS細(xì)胞，產(chǎn)生軟骨細(xì)胞或其祖細(xì)胞。為了誘導(dǎo)對(duì)要植入同種異體移植受體體內(nèi)的這些分化細(xì)胞的耐受，用“耐受” 細(xì)胞(能導(dǎo)致對(duì)同種異體移植細(xì)胞較低的炎癥或免疫學(xué)反應(yīng)的細(xì)胞)預(yù)先處理或共處理病 人，例如可通過(guò)注射位點(diǎn)的白細(xì)胞浸潤(rùn)、抗體或MLR活性的誘導(dǎo)、或同種異體移植細(xì)胞 的存活時(shí)間增加測(cè)定的。當(dāng)目的是促進(jìn)同種異型特異性耐受時(shí)，所選耐受性細(xì)胞應(yīng)是與 同種異體移植細(xì)胞“MHC相容”。這意味著至少耐受細(xì)胞與同種異體移植細(xì)胞在A、B 或C基因座處至少有一個(gè)相同的MHCI類(lèi)單元型。更優(yōu)選相匹配，即耐受細(xì)胞攜帶有同 種異型移植物的A單元型和/或B單元型之一或兩者。在不能精確匹配時(shí)，可通過(guò)建立 來(lái)自不同譜系的MHC相容性細(xì)胞混合物，制備含有同種異體移植細(xì)胞群多種單元型的耐 受性細(xì)胞。還可以通過(guò)從同一 pPS細(xì)胞系衍生兩種細(xì)胞群，將耐受細(xì)胞基因裁剪成同種 異體移植細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，耐受性細(xì)胞是如上所述獲得的pPS衍生的造血細(xì) 胞，攜帶一種或多種特征性表型或功能特征。特別感興趣的造血細(xì)胞群，是含有或可以 產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞及其前體，或能在施用后形成免疫嵌合性的細(xì)胞。另 一實(shí)施例中，用于誘導(dǎo)免疫耐受的細(xì)胞(或其一部分)仍然具有未分化pPS細(xì)胞的特征。 如實(shí)施例6-8所示，未分化的pPS細(xì)胞常常缺乏明顯的MHC II類(lèi)抗原。它們能夠活躍 的抑制炎癥反應(yīng)和同種異體移植及異種免疫反應(yīng)(針對(duì)其自身，和針對(duì)第三方的刺激性 細(xì)胞)。在某些情況下，擔(dān)心未分化的pPS細(xì)胞或早期祖細(xì)胞可能在施用后以失控方式 生長(zhǎng)或分化，產(chǎn)生惡性腫瘤或其它不良增生物。處理該擔(dān)心有幾種解決方法。一種方 法是對(duì)未分化的細(xì)胞裝配一個(gè)自殺基因(例如胸腺嘧啶激酶)，使得前藥更昔洛韋對(duì)細(xì)胞 具有毒性(WO 02/42445)。誘導(dǎo)耐受后，可通過(guò)施用該前藥從個(gè)體中剔除未分化的pPS 細(xì)胞。另一種方法是將未分化pPS細(xì)胞滅活到一定程度，使其不再能夠在體內(nèi)增殖， 但仍然可以具有免疫抑制所需的活性(實(shí)施例7和8)。未分化的pPS細(xì)胞可通過(guò)輻照 (約1000-3000RadS)或用絲裂霉素c或其它滅活性化療、交聯(lián)、或烷基化劑處理，事先滅 活，以抑制或預(yù)防細(xì)胞分裂。本節(jié)所述的細(xì)胞組合物為再生醫(yī)學(xué)提供了一種重要的新系統(tǒng)。國(guó)際專(zhuān)利出版物 WO 02/44343提供了幾種嚙齒類(lèi)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型，用于評(píng)估耐受性方案的存活率和隨 后的組織再生。通過(guò)施用第一群細(xì)胞，以誘導(dǎo)對(duì)第二群細(xì)胞的耐受，對(duì)人個(gè)體進(jìn)行治療。為了 幫助平息局部炎癥，可對(duì)接受再生性同種異型移植物的同一部位給予所述耐受性細(xì)胞。 或者，為了幫助產(chǎn)生造血細(xì)胞嵌合體，可系統(tǒng)性給予該耐受性細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)在單向混合 的淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，用同種異體移植細(xì)胞作為刺激劑，測(cè)試病人的血液淋巴細(xì)胞，以確 定是否有耐受誘導(dǎo)(實(shí)施例7)。增殖應(yīng)答降低顯示了成功的耐受誘導(dǎo)?？赏ㄟ^(guò)評(píng)估循環(huán) 單核細(xì)胞的HLA型和造血細(xì)胞表面標(biāo)記評(píng)價(jià)受體的造血嵌合性。同時(shí)或隨后對(duì)病人施用相容的神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì) 胞、間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、激素分泌性細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造血細(xì)胞或一些其它的細(xì)胞 類(lèi)型以治療其疾病。在該過(guò)程后，病人受到必需的支持護(hù)理，并用合適的生物化學(xué)標(biāo)記和臨床標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)其功能的改進(jìn)。對(duì)于本公開(kāi)中描述的任何治療目的，本發(fā)明的造血或免疫耐受性細(xì)胞通常是以 藥物組合物的形式提供的，其中含有用于人給藥的在充分無(wú)菌的條件下制備的等滲賦形 劑。可獨(dú)立包裝并銷(xiāo)售有效的細(xì)胞組合，或采用置于藥盒中的獨(dú)立容器形式，或可以互 相混合(為了同時(shí)對(duì)同一位點(diǎn)給藥)。本發(fā)明還包括制造、銷(xiāo)售或使用過(guò)程中的細(xì)胞組。 細(xì)胞組含有本文所述的兩種或多種細(xì)胞群的任意組合，例如但不限于一類(lèi)分化的pPS-衍 生的細(xì)胞(造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等)聯(lián)合未分化的pPS細(xì)胞或其它分化的細(xì)胞類(lèi)型，有時(shí) 具有相同基因組或MHC單元型。該組中的各細(xì)胞類(lèi)型可包裝在一起，或裝在同一設(shè)備的 不同容器中，或在不同位置，處于同一企業(yè)，或有商業(yè)關(guān)系的不同企業(yè)控制下。對(duì)于細(xì)胞組合物的藥物制劑的基本原則，讀者可以參考G.Morstyn &W.Sheridan 編，Cell Therapy Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, Cambridge University Press, 1996。用于藥物銷(xiāo)售和使用的本發(fā)明的產(chǎn)品可任選的包裝在 合適的容器或藥盒中，配有用于所需目的，例如重建血液功能、基因治療或免疫耐受誘 導(dǎo)的說(shuō)明書(shū)。下列實(shí)施例提供了本發(fā)明具體實(shí)施方式
的非限制性說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例1 :胚胎干細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞繁殖將未分化的人胚胎干細(xì)胞(hES)的已建立細(xì)胞系維持在基本無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng) 環(huán)境中。事先按照標(biāo)準(zhǔn)方法(WO 01/51616)用分離的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)制
備條件培養(yǎng)基。在Matrigel 包被的平板上傳代hES培養(yǎng)物。接種后約一周，培養(yǎng)物變得匯 合，可以傳代。在這些條件下維持培養(yǎng)物超過(guò)180天，并持續(xù)顯示ES樣形態(tài)。hES集落 表達(dá)SSEA-4、Tra-1-60、Tra_l_81和堿性磷酸酶，如免疫化學(xué)評(píng)估的，但集落之間的分 化的細(xì)胞不表達(dá)。通過(guò)將集落用于產(chǎn)生特定細(xì)胞類(lèi)型的已建立的方法，確定了多能性。實(shí)施例2 未分化的hES細(xì)胞培養(yǎng)物中缺乏造血細(xì)胞表型用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和集落形成試驗(yàn)(CFU)分析HI hES細(xì)胞系中未分化的細(xì)胞，以 確定處于未分化狀態(tài)的造血細(xì)胞的特征。用胰蛋白酶_EDTA(1%胰蛋白酶、2%EDTA，Gibco)在室溫下10分鐘，或細(xì)胞 分離緩沖液(CDB)37°C 10分鐘(EDTA和高鹽，Gibco)處理從無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物中收集 細(xì)胞。離心沉淀收集細(xì)胞，重新懸浮在含有10%FCS的IMDM(Iscove改良Dulbecco培養(yǎng) 基)中，然后濾過(guò)85微米的尼龍篩。將其重新懸浮在含有3% FCS的200微升PBS中， 在室溫下與2微升抗體保溫15分鐘。洗滌細(xì)胞兩次，用15微升/ml 7AAD (Immunotech) 在室溫下染色15分鐘。圖1顯示了結(jié)果。活細(xì)胞(門(mén)控7AAD陰性；i欄)進(jìn)一步用大小(ii)門(mén)控篩 選，以分析未分化ES細(xì)胞群中造血細(xì)胞表面標(biāo)記(iii-vi)的表達(dá)?；谂囵B(yǎng)基對(duì)照，排 除150以下的具有正向散射特征的細(xì)胞。根據(jù)各圖頂部標(biāo)出的獨(dú)立試驗(yàn)個(gè)數(shù)(n)，細(xì)胞百 分?jǐn)?shù)表示成平均值士SEN。用基于各目的同種型對(duì)照(插頁(yè))劃分的四象限分析未分化HI (A, B)和H9細(xì)胞(C，D)的各人造血細(xì)胞標(biāo)記(iii-vi)的表達(dá)。沒(méi)有細(xì)胞表達(dá)人造血細(xì)胞標(biāo)記CD45，僅 1.2%是CD34陽(yáng)性(原始人造血細(xì)胞的標(biāo)記，欄iii)。分析了這些細(xì)胞的其它原始造血細(xì) 胞標(biāo)記，包括c-kit(iv)、CD38 (ν)和AC133 (ν)的表達(dá)。事實(shí)上沒(méi)有細(xì)胞表達(dá)CD38，但 22-33%是 c-Kit 陽(yáng)性，13-52%是 AC133 陽(yáng)性。12-38%表達(dá) MHC I 類(lèi)抗原(HLA-A， B 和 C) (vi)。如下進(jìn)行CFU試驗(yàn)。收集未分化的細(xì)胞，將2X105臺(tái)盼藍(lán)陰性細(xì)胞接種在 含有 50ng/ml SCF、10ng/ml GM—CSF (Novartis)、10ng/ml IL—3 (Novartis)禾Π 3U/ml EPO (Amgen)的 Methocult H4230 甲基纖維素(StemCell TechnologiesInc., Vancouver
BC)中。在該生長(zhǎng)因子混合物中加入25ng/ml BMP-4和300ng/ml Flt_3L，沒(méi)有提高未分 化hES細(xì)胞系中所測(cè)到的造血細(xì)胞克隆形成性祖細(xì)胞。培養(yǎng)物在37°C、5% C02,濕潤(rùn) 空氣中培育，并監(jiān)測(cè)集落形成達(dá)40天。用形態(tài)特征(如紅細(xì)胞系)和微紅色指示的血紅 蛋白可區(qū)別集落的亞型。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 未分化hES細(xì)胞的CFU能力
權(quán)利要求
1.一種抑制個(gè)體炎癥反應(yīng)的方法，其特征在于，對(duì)個(gè)體施用一群靈長(zhǎng)類(lèi)多能干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是建立的細(xì)胞系。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎癥反應(yīng)是通過(guò)同種異體刺激細(xì)胞刺 激的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎癥反應(yīng)是通過(guò)異種刺激細(xì)胞刺激的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是滅活的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是通過(guò)輻照滅活的。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是用絲裂霉素處理滅活的。
8.—種抑制淋巴細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，包括使淋巴細(xì)胞與pPS細(xì)胞接觸。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是來(lái)自建立的細(xì)胞系的hES 細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞被滅活。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是通過(guò)輻照滅活的。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是用絲裂霉素處理滅活的。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞是pPS細(xì)胞的同種異型細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生造血細(xì)胞系細(xì)胞的系統(tǒng)。在造血原性細(xì)胞因子和本公開(kāi)內(nèi)容中所列的其它因子存在下進(jìn)行分化。獲得的細(xì)胞群顯著富含CD45陽(yáng)性細(xì)胞，該標(biāo)記是有自我更新功能的早期造血前體細(xì)胞的標(biāo)記。在分化過(guò)程中，摻入骨形態(tài)發(fā)生蛋白增強(qiáng)了細(xì)胞群形成次生代集落的能力。由于胚胎干細(xì)胞的強(qiáng)大復(fù)制能力，提供了造血細(xì)胞重要的新商業(yè)來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102008503SQ200910174800
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2002年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日
發(fā)明者A·S·馬宗達(dá), I·A·赫伯, J·馬登斯, M·巴蒂亞 申請(qǐng)人:杰龍公司, 羅巴茨研究所