專利名稱：一種制備尿激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備尿激酶的方法，尤其涉及一種親和膜色譜技術(shù)和親和層析技
術(shù)制備尿激酶的方法。
背景技術(shù)：
尿激酶，簡(jiǎn)稱區(qū)，是人體腎細(xì)胞產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，絲氨酸和組氨酸是 酶活性中心的必需氨基酸。其主要存在于人及哺乳動(dòng)物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然 高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)兩種，高分子量尿激酶溶解血 栓的臨床效果比低分子量的尿激酶約高3倍，國(guó)際上把尿激酶的相對(duì)分子量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 的重要指標(biāo)之一。臨床上主要用于治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓 性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網(wǎng)膜中央靜脈血栓形成。 尿激酶制備方法目前主要有離子交換層析法，凝膠分子篩法、免疫親和層析和對(duì) 氨基苯甲脒-S印harose親和層析等。如陳祥勝等報(bào)道了采用苯甲脒瓊脂糖凝膠親和層析 從尿激酶粗品中精制尿激酶，比活27938IU/mg 'pr，活性回收率62. 96%，純化倍數(shù)4. 03倍； 祝一鋒等報(bào)道了采用S印hadexG-50凝膠過(guò)濾、CM-S印hadex C-50、硫酸銨沉淀以及Bio-Gel P-30凝膠過(guò)濾等制備尿激酶精品，比活34080IU/mg pr，活性回收率60%左右，純化倍數(shù) 50倍。沈金玉等報(bào)道了采用免疫親和層析從尿激酶粗品精制尿激酶。離子交換和凝膠過(guò)濾 純化效率低下，難以獲得高純度的尿激酶精品；免疫親和層析純化尿激酶可獲得較高純度 的尿激酶精品，但由于免疫親和層析需使用生物配基，價(jià)格昂貴，很難獲得工業(yè)化生產(chǎn)使用 的配基；對(duì)氨基苯甲脒-S印harose作為一種較好的尿激酶精品精制方法，但也必須同其他 方法一起使用，而且必須在提取過(guò)程中多次使用才能獲得高質(zhì)量的尿激酶，多次使用造成 生產(chǎn)成本極高、收率低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以尿激酶粗品為原料制備尿激酶的方法，該方法生產(chǎn)工 藝時(shí)間短，易于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低。 本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，首先尿激酶粗品經(jīng)溶解、離心或過(guò)濾，體積較大時(shí)超濾濃 縮等步驟獲得的澄清溶液，調(diào)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱使用的平衡液電導(dǎo)率 一致，再上裝有D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱吸附，再洗滌、洗脫，得到的洗脫液上親和膜純化 柱，經(jīng)洗滌、洗脫得到的洗脫液上親和層析柱，經(jīng)洗滌、洗脫、過(guò)濾得到的濾液進(jìn)行冷凍干 燥，最后得到尿激酶。其具體制備方法如下 (1)取一定量的尿激酶粗品(生物效價(jià)30000 50000IU/g，比活300 600IU/ g *pr)，用8 10倍尿激酶粗品量(體積與重量比)的p朋.0， 0. lmol/L磷酸緩沖液分2 3次加入溶解，每次攪拌溶解0. 5 1. 0小時(shí)，然后離心或過(guò)濾，合并上清或?yàn)V液，體積較大 時(shí)進(jìn)行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用； (2)將步驟(1)得到的澄清溶液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱使用的平衡液電導(dǎo)率一致，再上用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液
平衡的D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱，然后用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷
酸緩沖液洗滌；最后用PH10， 1 3%氨水進(jìn)行洗脫，收集洗脫活性峰； (3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和膜純化柱，用
含0. 45 0. 60mol/L氯化鈉的pH7. 2， 0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 25 0. 35mo1/
L氯化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰； (4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和層析柱，用含
1. 0 2. 0mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 35 0. 45mol/L氯
化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過(guò)濾，最后進(jìn)行冷凍干
燥，得到尿激酶。 本發(fā)明利用D160陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附法，親和膜色譜法與親和層析法等結(jié)合使用，以 尿激酶粗品為原料制備尿激酶，所得到的尿激酶質(zhì)量?jī)?yōu)于現(xiàn)有國(guó)內(nèi)水平，尿激酶比活可達(dá) 到150， 000IU/mg pr以上，高分子尿激酶相對(duì)含量可達(dá)到96%以上，尿激酶生物活性回收 率可達(dá)到65% 。本方法解決了現(xiàn)有尿激酶制備方法普遍存在的操作繁瑣、產(chǎn)品質(zhì)量差，收率 低和生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例l: (1)取100g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液400ml溶解，攪拌50分 鐘，離心，沉淀再用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液400ml溶解，攪拌30分鐘，離心，合并兩次 上清，得到820ml澄清溶液，取樣檢測(cè)，總生物效價(jià)0. 042億單位； (2)將步驟(1)得到的820ml澄清溶液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析 柱使用的平衡液電導(dǎo)率一致，再上用含O. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩沖液平 衡的D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱，然后用含0. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩沖液 洗滌；最后用PHIO， 1 %氨水進(jìn)行洗脫，收集得到190ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 039億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的190ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和膜純化 柱，用含0. 45mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 25mol/L氯化鈉 的pH3. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集得到90ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 035億單 位； (4)將步驟(3)收集得到的90ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和層析柱， 用含1. Omol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 35mol/L氯化鈉的 pH3. 5， 0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過(guò)濾，得到85ml濾液，進(jìn)行冷凍干燥， 得到34. lmg尿激酶，總生物效價(jià)O. 028億單位，比活167000IU/mg. pr，高分子尿激酶相對(duì)含 量97. 0 % ，活性總回收率66. 7 % 。
實(shí)施例2: (1)取200g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液1000ml溶解，攪拌60分 鐘，離心，沉淀再用P朋.0， 0. lmol/L磷酸緩沖液1000ml溶解，攪拌30分鐘，過(guò)濾，合并兩次 上清，超濾濃縮，得到320ml濃縮液，取樣檢測(cè)，總生物效價(jià)0. 080億單位；
(2)將步驟(1)得到的320ml濃縮液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱 使用的平衡液電導(dǎo)率一致，再上用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液平 衡的D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱，然后用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷酸緩沖液 洗滌；最后用PH10， 2 %氨水進(jìn)行洗脫，收集得到260ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 074億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的260ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和膜純化 柱，用含0. 50mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 30mol/L氯化鈉 的pH4. 0，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集得到100ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 068億單 位； (4)將步驟(3)收集得到的100ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和層析 柱，用含0. 50mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 40mol/L氯化鈉 的pH4. 0，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過(guò)濾，得到105ml濾液，進(jìn)行冷凍干 燥，得到62. 8mg尿激酶，總生物效價(jià)0. 054億單位，比活176000IU/mg *pr，高分子尿激酶相 對(duì)含量97.2%，活性總回收率67. 5 % 。
實(shí)施例3 (1)取500g尿激酶粗品，用p朋.0， 0. lmol/L磷酸緩沖液2000ml溶解，攪拌60分 鐘，離心；沉淀用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液2000ml溶解，攪拌50分鐘，離心；第二次沉 淀用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液1500ml溶解，攪拌30分鐘，離心；合并三次上清，超濾濃 縮，得到400ml濃縮液，取樣檢測(cè)，總生物效價(jià)0. 22億單位； (2)將步驟(1)得到的400ml濃縮液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱 使用的平衡液電導(dǎo)率一致，再上用含O. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液平衡 的D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱，然后用含0. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液洗 滌；最后用pH10， 3%氨水進(jìn)行洗脫，收集得到450ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 20億單位；
(3)將步驟(2)收集得到的450ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和膜純化 柱，用含O. 6mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 35mol/L氯化鈉的 pH4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集得到120ml洗脫活性峰，總生物效價(jià)0. 18億單位；
(4)將步驟(3)收集得到的120ml洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7. 2，然后上親和層析 柱，用含2. Omol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 45mol/L氯化鈉的 pH4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過(guò)濾，得到110ml濾液，進(jìn)行冷凍干燥， 得到162. 9mg尿激酶，總生物效價(jià)0. 145億單位，比活182000IU/mg 'pr，高分子尿激酶相對(duì) 含量98. 0 % ，活性總回收率65.9%。
權(quán)利要求
一種制備尿激酶的方法，其特征在于該方法依次包括如下步驟(1)取一定量的尿激酶粗品，用8～10倍尿激酶粗品量的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液分2～3次加入溶解，每次攪拌溶解0.5～1.0小時(shí)，然后離心或過(guò)濾，合并上清或?yàn)V液，體積較大時(shí)進(jìn)行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用；(2)將步驟(1)得到的澄清溶液調(diào)電導(dǎo)率，使其與D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱使用的平衡液電導(dǎo)率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液平衡的D160陽(yáng)離子樹(shù)脂層析柱，然后用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌；最后用pH10，1～3％氨水進(jìn)行洗脫，收集洗脫活性峰；(3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和膜純化柱，用含0.45～0.60mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0.25～0.35mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰；(4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和層析柱，用含1.0～2.0mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0.35～0.45mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過(guò)濾，最后進(jìn)行冷凍干燥，得到尿激酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備尿激酶的方法，其特征在于步驟(3)使用的親和膜純化 介質(zhì)是以聚砜為載體，對(duì)氨基苯甲脒為親和配基，采用干噴_濕法紡絲制膜技術(shù)制備成的 中空纖維親和膜；步驟(4)使用的親和層析介質(zhì)是以瓊脂糖為載體，對(duì)氨基苯甲脒親和配 基偶聯(lián)制備的。
全文摘要
一種制備尿激酶的方法，其特征在于采用了D160陽(yáng)離子樹(shù)脂交換法、親和膜色譜法及親和層析法相結(jié)合，以尿激酶粗品為原料制備尿激酶。所得到的尿激酶質(zhì)量?jī)?yōu)于現(xiàn)有國(guó)內(nèi)水平，尿激酶比活可達(dá)到150,000IU/mg.pr以上，高分子尿激酶相對(duì)含量可達(dá)到96％以上，尿激酶生物活性回收率可達(dá)到65％。本方法解決了現(xiàn)有尿激酶制備方法普遍存在的操作繁瑣、產(chǎn)品質(zhì)量差，收率低和生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N9/72GK101701215SQ200910186618
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者劉蘭花, 張志武, 曾英, 朱月華, 楊益輝 申請(qǐng)人:南昌市萬(wàn)華生化藥業(yè)有限公司