專利名稱：：一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
：PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一種20世紀(jì)八十年代處發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，用于富集特定的DNA片段。它運(yùn)用從溫泉細(xì)菌中分離出的DNA聚合酶(DNAPolymerase)，通過變性、復(fù)性(退火)和延伸等三步反應(yīng)，模擬體內(nèi)DNA復(fù)制。能夠?qū)O微量的核酸在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增復(fù)制，獲得大量的目的DNA片段。PCR擴(kuò)增完成后需要通過鑒定，才能確定是否真正準(zhǔn)確可靠獲得了預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳是實(shí)驗(yàn)室最常用的，簡便易行。核酸分子帶負(fù)電，在電場下向正極運(yùn)動(dòng)，不同分子大小的核酸帶電量不同，在凝膠介質(zhì)的分子篩作用下，使分子大小不同的核酸分子出現(xiàn)不同的遷移率，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入染料，在凝膠分析系統(tǒng)中進(jìn)行分析。瓊脂糖凝膠電泳的濃度通常在0.5_2%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來分離小片段的電泳。比如實(shí)驗(yàn)室常用的1%的瓊脂糖凝膠電泳可以分辨的核酸大小為0.5kb-7kb，2X的膠可以分辨0.lkb-3kb的核酸。由此可見，其分辨率不高，當(dāng)核酸片段大小相近(或相同時(shí))就無法區(qū)分，在電泳中這幾條分子大小相近的條帶就可能只顯現(xiàn)出一條帶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供的檢測待測生物樣本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的雙色熒光多重PCR(DFM-PCR，DualFluorescenceMultiplex-PCR)方法，包括如下步驟將待測生物樣本的總DNA作為模板，用引物對甲和引物對乙進(jìn)行多重PCR;將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段甲；引物對甲的5'端用Tamra標(biāo)記，引物對乙的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對甲用于擴(kuò)增DNA片段甲；所述引物對乙用于擴(kuò)增DNA片段乙。所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為0.5-2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，如0.5-1%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1_1.5%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1.5-2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳等。當(dāng)所述瓊脂糖凝膠電泳為1%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差7000bp以下，具體可相差500bp以下。當(dāng)所述瓊脂糖凝膠電泳為2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差3000bp以下，具體可相差lOObp以下。本發(fā)明的方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)DNA檢測所用的的瓊脂糖凝膠電泳-SYBGreenI染色法。所述雙色熒光多重PCR方法可應(yīng)用于檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟將待測生物樣本的cDNA為模板，用引物對A和引物對B進(jìn)行多重PCR，將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；所述引物對A是序列表的序列l(wèi)l所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra(TAMRA)標(biāo)記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記。所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為0.5-2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，如0.5-1%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1_1.5%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1.5-2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳等，具體可為2%瓊脂糖凝膠電泳。所述多重PCR的反應(yīng)條件具體可為95。C、5min;94。C、30s，52°C、60s，72°C、90s，35個(gè)循環(huán)；72°C、10min。所述多重PCR的反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)，每個(gè)所述引物對的上游引物和下游引物的濃度具體均可為0.lmmol/L。本發(fā)明同時(shí)保護(hù)一種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的試劑盒，包括引物對A和引物對B;所述引物對A是序列表的序列l(wèi)l所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測生物樣本中含有中的哪一種亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟將待測生物樣本的總DNA作為模板，用引物對1、引物對n、引物對ni、引物對IV、引物對V、引物對VI和引物對VII進(jìn)行多重PCR，將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有641bp的熒光條帶，待測生物樣本含有Hl亞型禽流感病毒；如果635nm下具有708bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果635nm下具有419bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H5亞型禽流感病毒；如果532nm下具有367bp的熒光條帶，待測生物樣本含有Nl亞型禽流感病毒；如果532nm下具有338bp的熒光條帶，待測生物樣本含有N2亞型禽流感病毒；如果532nm下具有724bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；如果532nm下具有532bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H9亞型禽流感病毒；所述引物對I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對，序列2所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對，序列6所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸組成的引物對，序列8所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸組成的引物對，序列10所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對，序列14所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記。所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為0.5_2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，如O.5-1%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1_1.5%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1.5-2%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳等，具體可為2%瓊脂糖凝膠電泳。所述多重PCR的反應(yīng)條件具體可為95。C、5min;94。C、30s，52°C、60s，72°C、90s，35個(gè)循環(huán)；72°C、10min。所述多重PCR的反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)，每個(gè)所述引物對的上游引物和下游引物的濃度具體均可為0.lmmol/L。本發(fā)明同時(shí)保護(hù)一種檢測待測生物樣本中含有如下哪種亞型禽流感病毒的試劑盒H1亞型禽流感病毒、H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、N1亞型禽流感病毒、N2亞型禽流感病毒、H6亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒；所述試劑盒包括引物對1、引物對n、引物對ni、引物對iv、引物對v、引物對vi和引物對vn;所述引物對i是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對，序列2所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對，序列6所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸組成的引物對，序列8所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸組成的引物對，序列10所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對，序列14所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記。DFM-PCR技術(shù)不僅可以區(qū)分瓊脂糖凝膠電泳中分子大小相同的條帶，而且檢測過程中無需核酸染料，因此還具有環(huán)保安全的優(yōu)點(diǎn)。為檢測病原物提供了簡便、安全和高通量的技術(shù)方法。本發(fā)明的方法基于熒光染料標(biāo)記技術(shù)和多重PCR技術(shù)。多重PCR(MutiplexPCR)就是在同一管中加入多對特異性引物，與PCR管內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，從而在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)DNA分子。熒光物質(zhì)在特定波長激發(fā)條件下，電子吸收能量躍遷到高能激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定，躍遷回基態(tài)，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的波長，發(fā)出熒光。通過給引物加上不同的熒光標(biāo)記(這里稱之為"探針引物")，可以獲得不同熒光的PCR產(chǎn)物，由于分子大小相同(或相近的)的PCR片段是用帶不同熒光標(biāo)記的探針引物擴(kuò)增所得，所以只要通過檢測不同的熒光便可以區(qū)分檢測出這些分子大小相同(或相近)的PCR產(chǎn)物。從而使該具有方便、快捷的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的核酸檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)高通量性運(yùn)用合適的不同熒光探針引物，在不同的激發(fā)波長下，瓊脂糖凝膠電泳上分辨不出的分子大小相近的條帶將發(fā)射不同波長的熒光，根據(jù)條帶的顏色可對瓊脂糖上片段大小相近的條帶做進(jìn)一步區(qū)別判定。因此，DMF-PCR即可把普通PCR幾次的結(jié)果在一次反應(yīng)中分析出來，操作方便省時(shí)。2)高分辨性運(yùn)用DFM-PCR分析時(shí)，由于分析儀器針對熒光探針的高靈敏性，因而熒光探針引物多重PCR可以達(dá)到較高的分辨率。因此，在擴(kuò)增量小的情況下，一般的凝膠成像系統(tǒng)分辨有限，而在用DFM-PCR后，檢測結(jié)果變得更靈敏，為實(shí)驗(yàn)提供更佳的分析依據(jù)。3)可操作性強(qiáng)在普通PCR儀上即可實(shí)現(xiàn)待測片段的擴(kuò)增，熒光探針引物合成條件成熟，擴(kuò)增結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳和熒光掃描儀即可分析。4)適用范圍廣可應(yīng)用于檢疫、科研等領(lǐng)域，尤其是對高通量和高靈敏性有要求的領(lǐng)域。5)省時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行多重PCR，減少單重普通PCR的耗時(shí)，節(jié)省時(shí)間。6)節(jié)省試驗(yàn)耗材由于集中一管反應(yīng)，所以可以節(jié)省相應(yīng)的試驗(yàn)試劑、用品等耗材，節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。7)安全由于操作檢測過程中無需核酸染料，使得更加環(huán)保安全。圖1為SYBGreenI染色檢測結(jié)果。圖2為FLA-5100熒光成像分析儀532nm掃描圖。圖3為FLA-5100熒光成像分析儀635nm掃描圖。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。10XPCRbuffer(大連寶生物公司)；dNTP(大連寶生物公司)；Taq酶(大連寶生物公司)；DL2000DNAMarker(大連寶生物公司)；QIAampViralRNAMiniKit(QIAGEN公司)；QIANGENOneSt印試劑盒(QIAGEN公司)；DNA回收試劑盒(美國Omega公司)；T-載體(大連寶生物公司)。熒光探針引物由上海Invitrogen公司合成，序列見表1:表17種A型流感病毒陽性質(zhì)粒構(gòu)建所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>FujifilmFLA-5100熒光/化學(xué)發(fā)光及同位素影像掃描分析儀；PCR儀(MJResearch);電泳儀(Bio_Rad)。實(shí)施例1、禽流感病毒陽性質(zhì)粒的構(gòu)建—、H1陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從HI亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的Hlf'和Hlr'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列15(見序列表的序列15)所示的DNA。二、H3陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從H3亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的H3f'和H3r'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列16(見序列表的序列16)所示的DNA。三、H5陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從H5亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的H5f'和H5r'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列17(見序列表的序列17)所示的DNA。四、H6陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從H6亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的H6f'和H6r'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列18(見序列表的序列18)所示的DNA。五、H9陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從H9亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的H9f'和H9r'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列19(見序列表的序列19)所示的DNA。六、N1陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從Nl亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中的Nlf'和Nlr'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表2)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列20(見序列表的序列20)所示的DNA。七、N2陽性質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAampViralRNAMiniKit按照說明書提供的方法，從N2亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取禽流感病毒基因組RNA。然后用QIANGENOneSt印試劑盒操作說明以表1中9的N2f'和N2r'組成的引物對進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件見表3)。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于T-載體。對回收RT-PCR產(chǎn)物連接后的載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，T-載體中插入了序列表的序列21(見序列表的序列21)所示的DNA。表3步驟一至七中的RT-PCR反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例2、應(yīng)用雙色熒光多重PCR檢測不同亞型的禽流感病毒質(zhì)粒—、多重PCR將七種亞型的陽性病毒質(zhì)?；旌献鳛槟０?；混合物中，HI陽性質(zhì)粒的濃度為1X106拷貝、H3陽性質(zhì)粒的濃度為1.2X105拷貝、H5陽性質(zhì)粒的濃度為8X106拷貝、H6陽性質(zhì)粒的濃度為8X10S拷貝、H9陽性質(zhì)粒的濃度為1Xl(f拷貝、Nl陽性質(zhì)粒的濃度為1.2X106拷貝、N2陽性質(zhì)粒的濃度為6X106拷貝亞型病毒質(zhì)粒。采用表2的7對引物(Hlf、Hlr;H3f、H3r;H5f、H5r;朋f、朋r;H9f、H9r;Nlf、Nlr;N2f、N2r)進(jìn)行多重PCR。多重PCR反應(yīng)體系見表4，循環(huán)參數(shù)見表5。分別采用表2的7對引物(Hlf、Hlr;H3f、H3r;H5f、H5r;H6F、H6R;H9f、H9r;Nlf、Nlr;N2f、N2r)進(jìn)行單重PCR。單重PCR反應(yīng)體系見表6，循環(huán)參數(shù)見表7。表4多重PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>10XPCRBuffer5uLT叫酶0.5uLddH2039uL總計(jì)50uL表7單重PCR循環(huán)參數(shù)變性95°C，5min擴(kuò)增(35個(gè)循環(huán))94。C，30S52°C，60S72°C，90S最終延伸72°C，lOmin取5L多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(5V/cm)(無核酸染料)，電泳完成后用FLA-5100熒光成像分析儀進(jìn)行掃描分析。將7個(gè)單重PCR產(chǎn)物每管取5yL，進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(5V/cm)(無核酸染料)，電泳完成后用FLA-5100熒光成像分析儀進(jìn)行掃描分析。取5L多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(5V/cm)(有核酸染料)，電泳完成后進(jìn)行SYBGreenI染色檢測。將7個(gè)單重PCR產(chǎn)物每管取5yL，進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳(5V/cm)(有核酸染料)，電泳完成后進(jìn)行SYBGreenI染色檢測。三、單重PCR和多重PCR擴(kuò)增結(jié)果比較SYBGreenI染色檢測結(jié)果見圖1。FLA-5100熒光成像分析儀532nm掃描圖見圖2。FLA-5100熒光成像分析儀635nm掃描圖見圖3。多重PCR產(chǎn)物的SYBGreenI染色圖中顯示6條電泳條帶。通過與單重PCR條帶對比分析，可以判斷由于H3、H6亞型PCR產(chǎn)物條帶分子量相接近(分別為708bp和724bp)，多重PCR產(chǎn)物中，H3亞型和H6亞型PCR產(chǎn)物條帶重合，因而無法通過普通PCR以及瓊脂糖凝膠電泳得以區(qū)分。在532nm下，多重PCR產(chǎn)物檢測出4條帶(圖2)。與單重PCR產(chǎn)物對照，可知檢測出的四條條帶分別為5'Tamra標(biāo)記的H6、H9、N1和N2四種亞型。在635nm下，多重PCR產(chǎn)物檢測出三條帶(圖3)。與單重PCR產(chǎn)物對照，可知檢測出的三條條帶分別為CY5標(biāo)記的Hl、H3和H5亞型。序列表〈110〉中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院〈120〉一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒〈130〉CGGNARY92749〈160>21〈210>1〈211>4012<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1tcacttgcttccgttgagggg3gC朋ttg3gttcagtatc〈210>2〈211〉41〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2ggtttcggatgttacagcgtgacactctcctattgtgactg〈210>3〈211>39〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3tcacttgcttccgttgaggtgttacccttatgatgtgcc〈210>4〈211>40〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>4ggtttcggatgttacagcgtccctgttgcc朋tttC3g3g〈210>5〈211>42〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5tcacttgcttccgttgaggagtg肌ttggaatatggt朋ctg〈210>613:0119]〈211>43:0120]〈212>DNA:0121]〈213>人工序列:0122]〈220〉:0123]<223>:0124]〈400〉6:0125]ggtttcggatgttacagcgtaactgagtgttcattttgtcaat43:0126]〈210>7:0127]〈211>39:0128]〈212>DNA:0129]〈213〉人工序列:0130]〈220〉:0131]〈223〉:0132]〈400>7:0133]tcacttgcttccgttgaggtcccacttggaatgcagaac39:0134]〈210>8:0135]〈211>42:0136]〈212>DNA:0137]〈213>人工序列:0138]〈220〉:0139]<223>:0140]〈400〉8:0141]ggtttcggatgttacagcgtcacatgcacattcagactcttg42:0142]〈210>9:0143]〈211>39:0144]<212>DNA:0145]〈213〉人工序列:0146]〈220〉:0147]〈223〉:0148]〈400>9tcacttgcttccgttgaggatagcatggtccagctcaag39〈210>10〈211>39〈212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉〈400>10ggtttcggatgttacagcgtacatgctgagcacttcctg39〈210〉11〈211>39〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>〈400>11tcacttgcttccgttgaggaaggcacttattggatcagg〈210〉12<211〉42〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉12ggtttcggatgttacagcgtgtcctctagtttcaatctgtgg〈210〉13〈211〉40〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉13tcacttgcttccgttgagga卿g朋tggtcctatatcgt〈210>14〈211〉41〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉<400〉14ggtttcggatgttacagcgtggatcttactcgcaatgtct.g<210〉15〈211>602〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400>1515gg3gc朋ttgagttcagtatcttcatttgagaggttcg^atettcccc3^gagagctc60atggcccaatcacaccgtaaccggagtatc3gcatcatgctcccateacggg3皿3gc3g120tttttacagaaatttgctatggctgacgggg33g皿tggtttgteccc^3cctgagc皿180gtcctatgcaccttgtactatggggtgttcatcacccgcc240t朋categggg3CC3朋gggccctctetcatacagaaaatgcttatgtctctgtegtgtc300ttcacattat3gC3g朋g3ttcaccccaga■tegcc^a3gaccc^ggtg3g3gatc3360ggElElggEl卿atcaactactactggactctgctgg^cccggggatec^teatetttga420ggC3朋tgg3cgccaaggtatgctttcgcactgagtagaggctttggatc4803gg朋tcatcacctcaaatgcaccaatggatg33tgtg3tgCg33gtgtC^3C3CCtC3540ggg3gctete朋C3gC3gtCttcctttccag^tgtecacccagtcac^teggagagtg600tc602〈210>16〈211>669〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>16tgttecccttatgatgtgccagattetgcctccctteggtcactegttgcctcatcaggc60accctggagtttetcaatgaagacttteattggactggagtcgctcagaatgggg織gc120tetgcttgca3朋ggggatcttctttegtegattg皿ttg180tcag朋tec3aatetccagcgctg雄gtgactetgccaa240ttgtecatttggggggttC3ccacccgagc3Cgg3C3g3gcctetetett300cgagcatcaggg朋3gtC3Cagtctctecc皿皿g皿gccaatcccgaat360atcgggtccagaccctgggt皿ggggtctgtccagteg皿teagcatctettggac皿te420gtea朋ccggg3gacatecttttgatteat3gC3CCggg3atcteattgctcctcggggt■tecggactggg皿皿gctcg3teatgaggtcagatgcacccattggcacc540tgcagttctgaatgcatcacagcatcccca600gte朋caggatcacatetggggcatgtcccagatetgttetctgaaattg660gC3織ggg669〈210>17〈211>380〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>17agtg朋ttgg朋tetggteactgcaacaccctccaatgggggcgate皿c60tctegtetgccattccacaacatecaccctctcaccatcgggg皿tgccc120gattegtccttgcgactgggctc3ga皿tegccctcaaag3g3gag皿g3180gaggactetttggagctetegcaggttttet卿ggg郷240atggt卿tggttggtetgggteccaccat3gC皿tg3gC郷gg解tggatecgctgca300ggc皿tegatgg3gtC3CC3ateaggtc皿ctcgatcatt360acactcagtt380〈210〉18〈211〉685〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉18皿ggcacttegg腿gggteg卿ggtttgagatgtttccc皿gagtec360tgggc郷agtgg3C3CC3gacaagctcttgttcctttggtegtggttca120tctttctecaggaatctcctatggateatecatc3gg3tetccagteatt180皿ggg皿ctttggagac皿gtcagttctctatttttggggtgtgcaccat240cctectgacaC皿Ctg3gC3aaacattctgtetggttctggteatcgatecgtteg皿tg300gg皿ctga皿gcatgaattttgccaggagccggc皿ggcctgctgtgaat360ggtrag卿gttetttctggtccgttttea皿CC3gggg3aaccttgaat420gteg皿tcte3tggg皿tttagtegccccttggtetgcatacagatttgt■3gte皿ggagccgtgttcaggtcteattteCC皿tCg3g3actgtgatgccacatgccag540actettg皿gg3gtgat皿gacatttcagaatgtgagccctctgtggate600ggag皿tgccagtcteaggcttgc皿cagg3cteagg皿t660gttccacaaa〖鄉(xiāng)acl385〈210〉19〈211〉493〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉19皿gag皿tggtcctetetcgtcg皿agaccatcggctgtt皿tggattgtgtteccccgg60皿ccteg皿g皿cteaggtcactttttegttctgctegttctteccaaag120aatccagatctttccagacatgtgtcttetgC皿3gC3tg180ttcagattcattctecaggagratg卿tggttgactcaa皿g皿c皿cgctteccctgt240tcaagacgcc3teategaggctgttcatgtggggtet腿300tC3CCC3CCCactgatectgCgC3g3C皿3tctgtecacac皿c皿c皿g360tgtggc皿cag皿gateteaateggaccttcaaacccttgategggcc皿ggcctcttgt420caatggtctgC皿gg皿gg3ttgggcggtegtcagacatt■17gcgagteagatec493〈210>20〈211>328〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>20tcccacttgg朋tgcag朋ctttcttttte3CtC3ggg3gccttgctg皿tg3C皿gC3C60tcc朋tgggactgtte朋gacagaagccctc3C3g皿catteatgagttgtccggtgggt120gaggctccttccccateteactcaaggtttgagtctgttgcttggtcagcaagtgcttgc180catgatggcaccagttggttgac皿ttggaatttctggcccagacaatggggctgtggct240gtettg朋gt3C朋tggC3t皿te3C3gac3ctetc皿gagttggagg皿c皿catectg300ag朋ctc朋gagtctg朋tgtgcatgtg328〈210>21〈211>299〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>21ategcatggtccagctcaagttgtcacgatgg皿皿gcatggctgcatgtttgtgteacg60gggg3tg3tg朋朋tgc朋ctgctegcttcatttec皿tgggaggcttgtagategtett120ggttcatggtcctcaggacccaggagtcgg皿tgcgtttgtetc皿tgga180acttgtecagtegteatgactgatgggagtgcttcagg皿皿gctgatectea皿tecte240ttcattgaggagggg朋朋tcgttcatectagctcattgtcaggaagtgctcagcatgt299權(quán)利要求一種檢測待測生物樣本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的雙色熒光多重PCR方法，包括如下步驟將待測生物樣本的總DNA作為模板，用引物對甲和引物對乙進(jìn)行多重PCR；將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段甲；引物對甲的5’端用Tamra標(biāo)記，引物對乙的5’端用Cy5標(biāo)記；所述引物對甲用于擴(kuò)增DNA片段甲；所述引物對乙用于擴(kuò)增DNA片段乙。2.—種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟將待測生物樣本的cDNA為模板，用引物對A和引物對B進(jìn)行多重PCR，將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；所述引物對A是序列表的序列l(wèi)l所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述多重PCR的反應(yīng)條件為95°C、5min;94°C、30s，52°C、60s，72°C、90s，35個(gè)循環(huán);72。C、10min。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述多重PCR的反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)，每個(gè)引物對的上游引物和下游引物的濃度均為0.lmmol/L。5.—種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的試劑盒，包括引物對A和引物對B;所述引物對A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記。6.—種檢測待測生物樣本中含有如下哪一種亞型禽流感病毒的方法H1亞型禽流感病毒、H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、N1亞型禽流感病毒、N2亞型禽流感病毒、朋亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒，包括如下步驟將待測生物樣本的cDNA作為模板，用引物對1、引物對11、引物對111、引物對IV、引物對V、引物對VI和引物對VII進(jìn)行多重PCR，將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有641bp的熒光條帶，待測生物樣本含有Hl亞型禽流感病毒；如果635nm下具有708bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果635nm下具有419bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H5亞型禽流感病毒；如果532nm下具有367bp的熒光條帶，待測生物樣本含有Nl亞型禽流感病毒；如果532nm下具有338bp的熒光條帶，待測生物樣本含有N2亞型禽流感病毒；如果532nm下具有724bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；如果532nm下具有532bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H9亞型禽流感病毒；所述引物對I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對，序列2所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對，序列6所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸組成的引物對，序列8所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列IO所示核苷酸組成的引物對，序列10所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對，序列14所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述多重PCR的反應(yīng)條件為95°C、5min;94°C、30s，52°C、60s，72°C、90s，35個(gè)循環(huán);72。C、10min。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述多重PCR的反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)，每個(gè)引物對的上游引物和下游引物的濃度均為0.lmmol/L。9.一種檢測待測生物樣本中含有如下哪種亞型禽流感病毒的試劑盒H1亞型禽流感病毒、H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、N1亞型禽流感病毒、N2亞型禽流感病毒、H6亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒；所述試劑盒包括弓I物對I、引物對11、引物對111、引物對IV、引物對V、引物對VI和引物對VII;所述引物對I是序列表的序列l(wèi)所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對，序列2所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對，序列6所示核苷酸的5'端用Cy5標(biāo)記；所述引物對IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸組成的引物對，序列8所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列IO所示核苷酸組成的引物對，序列10所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記；所述引物對VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對，序列14所示核苷酸的5'端用Tamra標(biāo)記。10.權(quán)利要求1所述方法在檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明的方法包括如下步驟將待測生物樣本的cDNA作為模板，用引物對A和引物對B進(jìn)行多重PCR，將多重PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進(jìn)行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；引物對A是序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5′端用Tamra標(biāo)記；引物對B是序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5′端用Cy5標(biāo)記。本發(fā)明的方法具有高通量性、高分辨性、可操作性強(qiáng)、適用范圍廣、省時(shí)、節(jié)省試驗(yàn)耗材和安全等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12Q1/70GK101724713SQ200910243330公開日2010年6月9日申請日期2009年12月21日優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日發(fā)明者侯立華,朱水芳,王慧煜,韓雪清,黃新申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院