一種定量檢測(cè)人感染禽流感病毒(a/h7n9)的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬病毒檢測(cè)領(lǐng)域，涉及人感染禽流感病毒（A/H7N9)檢測(cè)方法，具體涉及一 種定量檢測(cè)人感染禽流感病毒（A/H7N9)的實(shí)時(shí)英光RT-PCR的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)報(bào)道,2013年3月在中國(guó)某地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)人感染禽流感病毒（avianinfluenza virus,AIV)H7N9亞型。截止到10月24日已監(jiān)測(cè)到100余例人感染禽流感病毒（A/H7N9)， 其中40余例死亡。該突發(fā)疫情引起WK)和全世界各國(guó)政府的高度關(guān)注。此前報(bào)道由家禽 直接傳染給人的AIV亞型主要有冊(cè)N1，H7N2,H7N3,H7N7,H9N2和化0N7 ;研究顯示，除了高 致病性禽流感病毒（hi曲lypathogenicavianinfluenza,HPAI)冊(cè)N1亞型能引起感染者高 達(dá)60%死亡率W外，其他幾種亞型主要引起結(jié)膜炎或者上呼吸道感染癥狀，僅在芬蘭報(bào)道 過(guò)1例人感染H7N7死亡病例。上述發(fā)現(xiàn)的H7N9病毒是全球范圍內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的新型人感染 禽源流感病毒。有研究表明該病毒來(lái)自于長(zhǎng)H角地區(qū)的雞鴨群，它可W在家禽內(nèi)有效傳播 但并不致病，和禽類(lèi)有密切接觸史的人容易感染該病毒。人感染H7N9-般表現(xiàn)為流感樣癥 狀，而重癥患者病情發(fā)展迅速，表現(xiàn)為重癥肺炎，出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，死亡率約30% 左右。早期使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑類(lèi)抗流感病毒藥物對(duì)H7N9禽流感病毒感染表現(xiàn)為是有 效的，但治療方案仍需優(yōu)化。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)H7N9禽流感病毒的疫苗。
[000引實(shí)時(shí)英光RT-PCR的方法因其快速（2~3小時(shí)），靈敏度高（1~10拷貝DNA/反 應(yīng)），特異性好等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和鑒定。但是，根據(jù)化等人研究發(fā)現(xiàn)H7N9 病毒在達(dá)菲治療過(guò)程中可發(fā)生耐藥突變而導(dǎo)致病毒持續(xù)陽(yáng)性，因此需要密切關(guān)注病人在 抗病毒治療過(guò)程中的病毒載量變化趨勢(shì)，W便及時(shí)判斷抗病毒治療效果，為臨床優(yōu)化治療 方案提供依據(jù)。盡管?chē)?guó)家流感中必和國(guó)外研究小組VMCorman等人已經(jīng)建立了實(shí)時(shí)英光 RT-PCR方法分別檢測(cè)H7和N9基因，但均沒(méi)有對(duì)臨床標(biāo)本中的病毒載量進(jìn)行定量研究；為 了應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情，有關(guān)防治部口迫切需要建立一種快速鑒定檢測(cè)新型禽流感A/H7N9的方 法，尤其是急需建立一種特異、靈敏、可靠的并適用于臨床大規(guī)模檢測(cè)的H7N9病毒載量監(jiān) 測(cè)方法。
[0004] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0005] [l]GaoR,CaoB,HuY,etal. .HumanInfectionwithaNovelAvian-Origin InfluenzaA(H7N9)Virus.N化glJMed. 2013.
[0006] [2]Hu Y, Lu S, Song Z, et al. . Association between adverse clinical outcome in human disease caused by novel influenza A H7N9virus and sustained viral shedding and emergence of antiviral resistance. Lancet. 2013 ;381:2273-79.
[0007] [3]CormanVM,EickmannM,Landt0,etal. .Specificdetectionbyreal-time reverse-transcriptionPCRassaysofanovelavianinfluenzaA(H7N9)strain associatedwithhumanspilloverinfectionsinChina.EuroSurveill. 2013 ;18:20461.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種快速鑒定檢測(cè)新型禽流感 A/H7N9的方法，具體涉及一種定量檢測(cè)人感染禽流感病毒（A/H7N9)的實(shí)時(shí)英光RT-PCR的 方法。本方法可特異、靈敏、可靠的定量檢測(cè)人感染禽流感病毒（A/H7N9)，適用于臨床大規(guī) 模監(jiān)測(cè)并檢測(cè)H7N9病毒載量。
[0009] 本發(fā)明根據(jù)Genbank中目前現(xiàn)有的人感染H7N9病毒的血細(xì)胞凝集素基因（HA) 全長(zhǎng)序列，建立了一種定量檢測(cè)人感染禽流感病毒（A/H7N9)載量的實(shí)時(shí)英光RT-PCR方法 (quantitativereal-timeRT-PCR,qRT-PCR)，既可W用于人感染H7N9病毒的快速診斷，同 時(shí)可對(duì)樣本的病毒載量進(jìn)行定量分析。進(jìn)一步為人感染禽流感病毒（A/H7N9)的臨床診斷 和治療及疫情防控提供參考依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明方法基于Genbank中收錄的人感染H7N9的HA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)合成了檢測(cè) H7N9病毒核酸的特異性英光定量PCR引物和探針，可特異、靈敏、可靠的定量檢測(cè)人感染禽 流感病毒（A/H7N9)疑似標(biāo)本，
[0011] 具體的，本發(fā)明的定量檢測(cè)人感染禽流感病毒（A/H7N9)的實(shí)時(shí)英光RT-PCR的方 法，其特征在于，其包括步驟：
[001引 1)引物設(shè)計(jì)
[0013] 根據(jù)Genbank中收錄的人感染H7N9的HA全長(zhǎng)序列，使用PrimerE邱ress3. 0設(shè)計(jì) 合成了檢測(cè)H7N9病毒核酸的特異性英光定量PCR引物和探針；使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST 工具和BioEdit軟件（version?. 0.9)分析新設(shè)計(jì)引物和探針的保守性。
[0014] 引物和探針由上海Invitrogen公司合成。
[0015] 2)病毒培養(yǎng)，核酸提取，qRT-PCR
[0016] 選取來(lái)自不同患者的咽拭子樣本，接種在犬腎上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）培養(yǎng)兩代W 上，H7N9陽(yáng)性培養(yǎng)物通過(guò)空斑形成試驗(yàn)進(jìn)行滴定病毒濃度（P化/ml);
[0017]用QIAampViralRNAMiniKit(250) (Qiagen52906)提取病毒基因組RNA;
[0018]qRT-PCR采用試劑盒（TakaraRR064A)進(jìn)行；
[0019]PCR反應(yīng)條件；42°C反轉(zhuǎn)錄，lOmin;95°C預(yù)變性 30s;95°C10s，6(TC45s，運(yùn)行45 個(gè) 循環(huán)，在6(TC進(jìn)行英光采集。反應(yīng)在實(shí)時(shí)英光定量PCR儀（A卵liedBiosystems，ViiA?7系 統(tǒng)）上進(jìn)行；
[0020] 引物和探針序列如表1所示；
[0021] 表1引物和探針序列
[0022] Primer/ProbeSequ電蔚億思皆to.3' ) Position* H7-1507F GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA 1507-1532 II7-1593R CCCGAAGCTAAACCARAGTATCA 1593-1571 117-1540P FAM-CCAGTCAAACTAAGCAGYGGCTACAAA-BnQl 1540-1566
[0023] * 參考的H7N9 病毒株為A/aian曲ai/4664T/2013(GenbankNo.KC853228)
[0024] 3)T-A克隆
[00巧]RT-PCR采用試劑盒（TakaraRR064A)進(jìn)行；
[0026]其中，上游引物HA-1144(5' -GGAATGATAGATGGNTGGTAYGG-3'），
[0027]下游引物HA-Reverse(5, -ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3,），
[0028]PCR反應(yīng)條件；42°C反轉(zhuǎn)錄，20min;95°C預(yù)變性 30s;95°C15s，50°C30s，72°C40s 運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5分鐘；
[0029]反應(yīng)在E：ppendo;rfMaster巧clerepgradientPCR儀上進(jìn)行，
[0030] 取一份RT-PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，采用割膠純化試劑盒 (Invitrogen，K2100-12)回收PCR產(chǎn)物，通過(guò)T-A克隆試劑盒燈akara，D101A)將PCR產(chǎn)物 克隆進(jìn)PMD18-T載體，通過(guò)M13引物測(cè)序獲得克隆片段序列，然后使用BLAST工具對(duì)克隆片 段進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)插入目的片段的正確性。
[0031] 4)建立qRT-PCR定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
[0032] 采用T-A克隆質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)品，建立H7N9病毒核酸定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，首先微量紫外 分光光度計(jì)燈hermo,NanoDropND-2000C)對(duì)克隆質(zhì)粒進(jìn)行核酸定量，然后進(jìn)行10倍模板 稀釋?zhuān)谱?〇9~l〇3copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，W標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行qRT-PCR，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0033] 5)方法的靈敏度測(cè)試
[0034] 6)方法的特異性測(cè)試
[0035] 7)與參比方法學(xué)的符合率測(cè)試
[0036] 采用中國(guó)CDC提供的H7N9病毒核酸rRT-PCR(realtimeRT-PCR)檢測(cè)方法（參比 方法）進(jìn)行平行檢測(cè)。通過(guò)分析兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，不符合 的標(biāo)本采用WHO提供的檢測(cè)流感病毒A型的rRT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
[0037] 上述檢測(cè)結(jié)果顯示：
[003引 （1)引物和探針序列保守性分析
[0039] 選取Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中人感染H7N9病毒株的HA核酸序列，共16株，使用Bioedit 軟件中ClustalW程序?qū)⑸舷掠我颳及探針?lè)謩e與選取的HA核酸序列進(jìn)行alignment分 析。結(jié)果顯示，上游引物H7