專利名稱：一種啟動(dòng)子BgIosP513、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種單子葉植物例如水稻的啟動(dòng)子，以及所述啟 動(dòng)子的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶0亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) 19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動(dòng)子有Ubi啟動(dòng)子(Plant ubiquitinpromoter)、 Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-1 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的Ubi-1啟動(dòng)子、水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素UbBl啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、 馬鈴薯泛素Ubi7啟動(dòng)子、番茄泛素Ubil-1啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素Ubi-1 啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻 和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。Adh-1啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán) 境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-1啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥
3和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子 提高10-50倍。Adh-1啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng) 子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過對(duì)水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基 因表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的單子葉植物 啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的具體堿基序列長度為415個(gè)堿基，如SEQ ID N0:1所 示TTGTACAAAGTATTCTTTCTAGTGGATTGTGCAAAGAAAAGAGAAGGTGAACAGGGAGGGAAGAAGAAA ATATCTCGGAGGTAGGTTGTTTTCTTACTGCAACATCAACTGCATGCTGTCCTTTTTTGGCTGTGCCTGTTTTGCAA TTTTGTAAGAATTGAGGTAAGATAAGTATGAAGAGATAGGGTAGAAATATCTTTACAAGAGTACAAAGATGCGGGGC ATTGGGGGTGGGGCCCTGTAGCGAGCAAGCCAAATGGGAGAACACCACATATCAGCTGAATCTTATCCATAGAAAAG AGGGAATTGAAGGGGCAGGAAGGATATCCCGGCCTTGTGGCACACTTGACTGGAGATGTATAAAGAGAGGAGGATGT GAAGAAAGAAGATATCTACCACCAAGCTAATTAAGCAA(SEQ ID NO 1)在本發(fā)明中，將SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列稱為啟動(dòng)子BgIosP513，或簡稱為 P513啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，帶有該啟動(dòng)子和GUS的水稻愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因水稻 苗經(jīng)GUS染色實(shí)驗(yàn)后，所述水稻愈傷組織和轉(zhuǎn)基因水稻苗的根、莖、葉等都變藍(lán)色。本發(fā)明的又一方面，涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補(bǔ)的序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明的又一方面，還涉及SEQ ID NO :1所示單子葉植物啟動(dòng)子的具有啟動(dòng)子功 能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性 程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典 型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C;“中等 嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗 滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性； 0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一 或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。
對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn) 室手冊，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊 性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50_65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè)，或者不超 過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動(dòng)子活性。通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核 苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷 酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同 的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷 酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考 序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來源于單子葉植物，具體地，所述單子葉植物為水稻，例 如所述水禾S為日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonicacv. Nipponbare) 0本發(fā)明的又一方面，還涉及一種含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的重組載體。 所述重組載體可以通過將上述啟動(dòng)子插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為P8+P513重組載體。本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載體的 重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞可以通過將含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載體轉(zhuǎn) 化至宿主細(xì)胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P513o本發(fā)明的又一方面，還涉及一種單子葉植物愈傷組織，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有本發(fā) 明所述的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包括但 不限于，例如中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐 優(yōu)22，黔優(yōu)88、11優(yōu)416、11優(yōu)107、11優(yōu)128、11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖 稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、 皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水 稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)等。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述水稻為 日本晴。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種制備本發(fā)明所述啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì) 相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的方法，所述方法包括用本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子 的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了 前述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P513。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單子葉植物的愈傷 組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。本發(fā)明中，可利用所述單子葉植物啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的所述單子葉植物包 括但不限于，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。本發(fā)明的又一方面，還涉及本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子在單子葉植物中調(diào)控目 的基因表達(dá)的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因 是GUS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地所述水稻為日本睛。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。本發(fā)明的又一方面，涉及本發(fā)明所述啟動(dòng)子在水稻育種中的用途。所述水稻為日 本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔 優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子作為單子葉植物、尤其是水稻轉(zhuǎn)基因的工 具啟動(dòng)子，為開展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而 極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、 甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。發(fā)明的有益效果為了尋找新的單子葉植物啟動(dòng)子，用于調(diào)控單子葉植物目的基因表達(dá)，同時(shí)為研 究單子葉植物基因表達(dá)提供新的工具和選擇，本發(fā)明人通過生物信息學(xué)研究獲得，并采用 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述啟動(dòng)子BgIosP513的功能。具體地，所述啟動(dòng)子能夠在水稻中調(diào)控 ⑶S基因表達(dá)。


圖1是啟動(dòng)子BgIosP513的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果，其中，泳道1 :lkbDNA Ladder Marker,泳道2 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3 IOObp DNA LadderMarker,其右側(cè)的數(shù)字500和400 表示所指向的Ladder Marker的條帶的大小，單位都是bp。
圖2是用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。圖3是p8質(zhì)粒示意圖中多克隆位點(diǎn)和⑶S序列部分的示意圖。圖4是p8質(zhì)粒示意圖。 圖5是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子 P513序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P513轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色； 不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對(duì)照，右)經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化。圖6是經(jīng)過轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng) 子P513序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P513轉(zhuǎn)化的水稻苗(左)經(jīng)⑶S染色后，其根、莖、葉呈 現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8轉(zhuǎn)化的水稻苗(對(duì)照，右)經(jīng)GUS 染色后其根、莖、葉的顏色未發(fā)生變化。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :P513啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P513重組載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-02)提取水稻日本睛(2009年12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC-P200910)的基因 組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本睛gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引 物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn) Pst I和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本睛的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
I
組成_體積(μ 1 )
基因組DNA0. 2
dNTPs ( 2. 5 mM )2
Γ 10 χ Ex Buffer (含錢離子)2.5
引物 Fl ( 50 μ Μ)1
引物 Rl ( 50 μ Μ)1
Ex taq0. 2
ddH20 補(bǔ)滿至總體積25 μ 1 -1-
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。其中，上游引物Fl:CCGgaattcTTGTACAAAGTATTC TTTCTAG(SEQ IDNO :2)，其中小寫 字母代表EcoR I酶切位點(diǎn)。下游引物Ri:GCctgcagTTGCTTAATTAGCTTGGTGGTA(SEQ ID NO :3)，其中小寫字母代 表Pst I酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. O %瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小為434bp的條帶(圖1)，使 用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)進(jìn)行純化回收。 PMD18-T+P513重組載體的構(gòu)津?qū)⑷缟鲜龅玫降腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌，挑取陽性克隆測序(如SEQ ID N0:4所示)，證明準(zhǔn)確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系10 μ 1pMD18-T1 μ 12*solution I5μ 1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(回收插入片段)IOng 20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補(bǔ)齊至 10 μ 1于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 PMD18-T+P513重組載體。將經(jīng)過上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞100μ 1 DH5a (中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從 例如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+P513重 組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的SOC培養(yǎng) 基(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕 吹勻，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué) 出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16h 24h。獲得含有pMD18-T+P513克隆載體的重組大腸桿菌，命 名為DH5a -P513。深圳華大基因科技股份有限公司對(duì)pMD18_T+P513克隆載體中的P513
進(jìn)行測序，結(jié)果如下ctcgaattc jTTGTACAAAGTATTCTTTCTAG!. tggattgtgcaaagaaaa
GAGAAGGTGAACAGGGAGGGAAGAAGAAAATATCTCGGAGGTAGGTTGTTTTCTTACTGCAACATCAACTGCATGCT GTCCTTTTTTGGCTGTGCCTGTTTTGCAATTTTGTAAGAATTGAGGTAAGATAAGTATGAAGAGATAGGGTAGAAAT ATCTCTACAAGAGTACAAAGATGCGGGGCATTGGGGGTGGGGCCCTGTAGCGAGCAAGCCAAATGGGAGAACACCAC ATATCAGCTGAATCTTATCCATAGAAAAGAGGGAATTGAAGGGGCAGGAAGGATATCCCGGCCTTGTGGCACACTT
GACTGGAGATGTATAAAGAGAGGAGGATGTGAAGAAAGAAGATATC TACCACCAAGC TAATTAAGCAA丨
CTGCAGGTC(SEQ ID NO 4)上面的序列中，帶下劃線的為酶切位點(diǎn)，帶方框的為引物序列。測序結(jié)果表明，獲得的pMD18-T+P513克隆載體中P513啟動(dòng)子序列正確。實(shí)施例2 載體-P8+P513重組載體的構(gòu)建
按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊，從實(shí)施例 1構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有啟動(dòng)子P513的大腸桿菌DH5ci-P513中提取帶有本發(fā)明P513啟動(dòng)子序列 的克隆載體PMD18-T+P513 ；純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoR I (NEB, B0101S)和Pst KNEB, R0140T)進(jìn)行酶切，回收相應(yīng)的啟動(dòng)子插入片段，并分別與p8質(zhì)粒用相同的限制性 內(nèi)切酶酶切后回收的載體大片段進(jìn)行連接。將所得連接產(chǎn)物p8+P513重組載體轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué) 出版社)所示氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，37°C倒置培養(yǎng)16 24h，待轉(zhuǎn)化子長出菌 落后，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測和酶切鑒定。p8質(zhì)粒構(gòu)津 本發(fā)明中所使用的p8質(zhì)粒是由pCAMBIA-1301質(zhì)粒(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 董楊提供；或者可從例如上海國瑞基因科技有限公司購得，該公司的pCAMBIA-1301質(zhì)粒的 原始來源是The CAMBIABios (biological open source) Licensee，Australia)按照如下方 式改造并構(gòu)建的，具體說明如下用Kpn I/Nco I (NEB)雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA-1301 (參見圖2)，回收大片段。根據(jù)所 采用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCG ACCATGG(SEQ ID NO :5)(包含的酶切位點(diǎn)是 Kpn I/Hind ΙΙΙ/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/ BamH I/Sa II/Nco I)，用Kpn I/Nco I雙酶切后回收，與上述所回收的大片段連接后轉(zhuǎn)化 toplO細(xì)胞(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例如北京索萊寶科技有限 公司購得)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO 6)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQID NO 7)篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR檢測方法，帶有擴(kuò)增片段為350bp的轉(zhuǎn)化子即為含有需要構(gòu)建 的多克隆位點(diǎn)及GUS序列的p8質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子(參見圖4)。所述p8質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)和⑶S序列的長度2353堿基，如SEQID NO 8所 示(參見圖 3) :GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTC ATTA ATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGT TAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAAT
TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GAATTC； GAGCTC GGTACC aagctt [ACTAGTjc[CTGCAG|G^CTAGA( ggatcc 同’
\CQKZ\Q ATGGTA GA TCTGA GGG_AAT滅CTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGG
A CCCTTTTCTCTTTTTA TTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAA CTGA TCTA TTTTTT AA TTGA TTGGTTA TGGTGMAA TATTACATAGCTTTAA CTGATAATCTGA TTA GTTTAT TTCGTGTGTCTATGATGA TGA TGA TAGTMCAGAA CCGA CGA CTCGTCCGTCCTGTA GA AA CCCCAA CCCGTGAAA TCAAAAAA CTCGA CGGCCTGTGGGCA TTCA GTCTGGA TCGCG AAA ACTGTGGAA TTGA TCA GCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTA CAAGAAA GCCGGGCAA TTGCTGTGCCA GGCA GTTTTA ACGA TCAGTTCGCCGA TGCAGA TA TTCGTAA TTA TGCGGG CAA CGTCTGGTA TCA GCGCGAA GTCTTTA TA CCGAAA GGTTGGGCA GGCCA GCGTA TCG TGCTGCGTTTCGA TGCGGTCA CTCA TTA CGGCAAA GTGTGGGTCAA TAA TCA GGAA GTG A TGGA GCA TCA GGGCGGCTA TA CGCCA TTTGAA GCCGA TGTCA CGCCGTA TGTTA TTGC CGGGAAAA GTGTA CGTA TCA CCGTTTGTGTGAA CAA CGAA CTGAA CTGGCA GA CTA TCC CGCCGGGAA TGGTGA TTA CCGA CGAAAA CGGCAA GAAAAA GCA GTCTTA CTTCCA TGA T TTCTTTAA CTA TGCCGGAA TCCA TCGCA GCGTAA TGCTCTA CA CCA CGCCGA AC A CCTG GGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAA GA CTGTAA CCA CGCGTCTGTTG A CTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAG GTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTG GCAA CCGGGTGAA GGTTA TCTCTA TGAA CTCGAA GTCA CA GCCAAAA GCCA GA CA GA GT CTGA TATCTA CCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCA GTGGCAGTGAAGGGCCA AC A GTTC CTGA TTAA CCA CAAA CCGTTCTA CTTTA CTGGCTTTGGTCG TCA TGAA GA TGCGGA CTT A CGTGGCAAA GGA TTCGA TAA CGTGCTGA TGGTGCA CGA CCA CGCA TTAA TGGA CTGGA TTGGGGCCAA CTCCTA CCGTA CCTCGCA TTA CCCTTA CGCTGAA GA GA TGCTCGA CTGG GCA GA TGAA CA TGGCA TCGTGGTGA TTGA TGAAA CTGCTGCTGTCGGCTTTCA GCTGTC TTTA GGCA TTGGTTTCGAAGCGGGCAA CAAGCCGAAAGAA CTGTA CA GCGAA GA GGCA G TCAA CGGGGAAA CTCA GCA AGCGCA CTTA CA GGCGA TTAAA GA GCTGA TA GCGCGTGA C AAAAA CCA CCCAA GCGTGGTGA TGTGGA GTA TTGCCA ACGA A CCGGA TA CCCGTCCGCA A GGTGCA CGGGAA TA TTTCGCGCCA CTGGCGGAA GCAA CGCGTAAA CTCGA CCCGA CGC GTCCGA TCA CCTGCGTCAA TGTAA TGTTCTGCGA CGCTCA CA CCGA TA CCA TCA GCGA T CTCTTTGA TGTGCTGTGCCTGAA CCGTTA TTA CGGA TGGTA TGTCCAAAGCGGCGA TTT GGAAA CGGCA GA GAA GGTA CTGGAAAAA GAA CTTCTGGCCTGGCA GGA GAAA CTGCA TC A GCCGA TTA TCA TCA CCGAA TA CGGCGTGGA TA CGTTA GCCGGGCTGCA CTCAA TGTA C A CCGA CA TGTGGA GTGAA GA GTA TCA GTGTGCA TGGCTGGA TA TGTA TCA CCGCGTCTT TGA TCGCGTCA GCGCCGTCGTCGGTGAA CA GGTA TGGAA TTTCGCCGA TTTTGCGA CCT CGCAA GGCA TA TTGCGCGTTGGCGGTAA CAA GAAA GGGA TCTTCA CTCGCGA CCGCAAA CCGAA GTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAA CGCTGGA CTGGCA TGAA CTTCGGTGAAAA ACCGCAGCAGGGAGGCAAACAAGCTAGCCACCACCACCACCACCA CGTGTGA ( s E Q
IDNO 8) 如上序列所示本發(fā)明中所構(gòu)建的p8質(zhì)粒，其多克隆位點(diǎn)中的EcoRI/Sac Ι/ΚρηI/Hind ΙΙΙ/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sa II/Nco I 限制性酶切位點(diǎn)分別用加框 和下劃線表示，篩選轉(zhuǎn)化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(艮口 SEQ ID NO :6和7)用雙下劃線表示，GUS序列用斜體表示，其內(nèi)含子序列分別用斜體加底紋
示出。
重組載體D8+P513的構(gòu)建根據(jù)限制性內(nèi)切酶EcoR I(NEB，B0101S)和Pst I (NEB，R0140T)操作說明，按照如 下條件處理實(shí)施例1中所得到的克隆載體PMD18-T+P513，以及如上所述構(gòu)建的p8質(zhì)粒。其中，克隆載體pMD18-T+P513及p8質(zhì)粒的酶切條件如下酶切體系50 μ 1無菌水34. 8 μ 110氺buffer H5μ 1EcoR I0. 1 μ 1 (IOU)Pst I0. 1 μ 1 (IOU)克隆載體pMD18-T+P513 或 ρ 8 質(zhì)粒 10 μ 1 ( < IOOOng)使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA收試劑盒(目錄號(hào)DP209_03)分別回收經(jīng)酶切的 P8質(zhì)粒，以及啟動(dòng)子P513插入片段，根據(jù)T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操作說明，按照如下 條件進(jìn)行連接連接體系10 μ 110*T4buffer1 μ 1 酶切后的ρ8質(zhì)粒1 μ 1 (20ng)回收的啟動(dòng)子P513插入片段10 20ng，根據(jù)其濃度確定無菌水補(bǔ)齊至9. 5μ1Τ4 ligase(TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1T4buffer冰上融化，酶切后的ρ 8質(zhì)粒載體加入量約20ng，本發(fā)明中的P513片段 加10ng。于16°C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上。將100 μ 1氯化鈣法制得的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α從超低溫冰箱取出，冰上融化后，力口 入10 μ 1上面的連接產(chǎn)物，輕輕攪勻，冰浴3011^11，421熱激608，冰浴51^11，加入60(^1 4°C預(yù)冷的S0C，37度220rpm復(fù)蘇45min，8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，輕輕吹勻， 玻璃珠涂布LB (kan)，37°C倒置培養(yǎng)16 24h。得到重組載體p8+P513。分別以Fl (即SEQ ID NO 2)和Rl (即SEQ ID NO 3)為引物對(duì)所得重組載體 P8+P513進(jìn)行PCR檢測，以確證所得重組載體P8+P513中含有所需啟動(dòng)子P513。通過EcoR I/Pst I酶切篩選含有重組載體P8+P513轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P513細(xì)胞的制備將如實(shí)施例2所述方法構(gòu)建的P8+P513重組載體和作為對(duì)照的p8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)中所述氯化鈣方法制備的根癌農(nóng)桿菌 EHA105(2009年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M 209315)的感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105于超低溫冰箱中取出，至于冰上解凍。融化 后，分別加入5μ 1的ρ8+Ρ513重組載體和ρ8質(zhì)粒以及作為對(duì)照的ρ8空載體，輕輕混勻，冰浴lOmin，放入液氮中冷凍5min，37°C解凍5min，加入800 μ 1常溫的LB液體培養(yǎng) 基，28°C 160rpm復(fù)蘇3h，8000rpm離心30s，吸去上清，留下200 μ 1吹勻，涂布于加有 kan-rif (卡那霉素-利福平)雙抗的YM培養(yǎng)基平板上(50mg/lKan，10mg/l Rif，具體配方 參見表4)。28°C倒置培養(yǎng)2-3天。以Fl (即SEQ ID NO 2)禾口 Rl (艮P SEQ ID NO :3)為引物進(jìn)行PCR檢測和通過EcoR I/Pst I酶切篩選轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增出約434bp條帶和酶切出約427bp條帶的為重組載體p8+P513的重組根 癌農(nóng)桿菌。本發(fā)明中，按照如上述方法得到的帶有重組載體P8+P513的重組農(nóng)桿菌，命名為 重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P513。按照本發(fā)明所述方法，得到的帶有p8質(zhì)粒的對(duì)照重組農(nóng)桿菌，命名為重組根癌農(nóng) 桿菌 EHA105-p8。實(shí)施例4 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化 按照如下步驟誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P513和重組 根癌農(nóng)桿菌EHA105-p8轉(zhuǎn)化所述愈傷組織。1)將水稻日本晴種子去殼，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5%的次氯酸 鈉消毒30min，期間劇烈搖動(dòng)，消毒后用滅菌水清洗5次；將消毒后的種子置于N6D培養(yǎng)基 (具體配方參見表2)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養(yǎng)3 4周；2)選取活躍生長的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑1 3mm)，在新N6D培養(yǎng)基上 29. 5°C光照培養(yǎng)3天；3)分別挑取如實(shí)施例3所構(gòu)建的重組根癌農(nóng)桿菌單菌落(重組根癌農(nóng)桿菌 EHA105-P513或重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p8)，于添加抗生素(50mg/l Kan, 10mg/l Rif)的 YM培養(yǎng)基(具體配方參見表3、表4)上劃線培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度28 V ；分別刮取上述重組 根癌農(nóng)桿菌置于添加了 30 μ 1 IOOmM的AS (Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM 培養(yǎng)基(具體配方參見表5)中，溫和重懸所述重組根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(重組根癌農(nóng)桿菌 EHA105-P513或重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p8)；4)將繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于滅菌培養(yǎng)皿中；將如步驟3制備的重組根癌農(nóng)桿菌 懸液倒入培養(yǎng)皿中，將愈傷組織浸入其中15min ；5)倒掉重組根癌農(nóng)桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于 N6-AS培養(yǎng)基(配方參見表6)上放一張滅菌濾紙，加Iml如上述含AS的AAM培養(yǎng)基，將愈 傷組織轉(zhuǎn)移至濾紙上；密封培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)48 60h ；6)將受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動(dòng)清洗，直至上清液變 澄清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無菌水中以殺死重組根癌農(nóng)桿 菌；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉(zhuǎn)移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培養(yǎng)基上；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3 4周。實(shí)施例5 水稻愈傷組織中的GUS的表達(dá)為檢測經(jīng)過實(shí)施例4所述轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達(dá)情況，按照 Chen SY等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742_751 所述的方法， 對(duì)分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P513或重組農(nóng)桿菌EHA105_p8轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織進(jìn)行染色。GUS 染色液的配方(Iml) 610 μ 1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。將分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P513或重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_p8轉(zhuǎn)化的水稻 愈傷組織浸泡在GUS染色液中，37°C保溫至出現(xiàn)藍(lán)色，拍照，結(jié)果如圖5所示，經(jīng)含有啟動(dòng)子 的p8+P513重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(圖5左)經(jīng)染色后呈現(xiàn) 藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動(dòng)子的p8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(作為對(duì)照，圖 5右)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明的P513啟動(dòng)子對(duì)⑶S基因表達(dá)具 有調(diào)控作用。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因水稻苗中⑶S的表汰 將實(shí)施例4中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培養(yǎng) 基(具體配方見表7)分化苗；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；待幼苗長至 3-4cm時(shí)轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素B (HmB)的1/2MS生根培養(yǎng)基(具體配方參見表8)進(jìn)行生 根篩選。轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色過程同實(shí)施例5中愈傷組織的染色過程。結(jié)果如圖6 所示，經(jīng)含有啟動(dòng)子的P8+P513重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根、莖、葉 (圖6左)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動(dòng)子的p8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻 苗的根、莖、葉(作為對(duì)照，圖6右)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明的 P513啟動(dòng)子對(duì)⑶S基因表達(dá)具有調(diào)控作用。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的相關(guān)培養(yǎng)基配方說明如下以下有關(guān)培養(yǎng)基中所稱的“常規(guī)滅菌”是指如下條件的滅菌121°C下蒸氣滅菌20 分鐘。表2N6D培養(yǎng)基
_^_0. 5 L_2_L_
N6Iiiacro 母液(20X) 50 ml 25 ml 100 ml Fe2EDTA 貯存液(100X) 10 ml 5 ml 20 ml N6Inicro 母液(1000X) 1 ml 0.5 ml 2 ml N6 維生素貯存液(1000X) 1 ml 0.5 ml 2 ml 肌醇(500X) 2 ml 1 ml 4 ml 2,4-D 貯存液(1 mg/ml ) 2 ml 1 ml 4 ml 脯氨脧(Proline) 2. 88 g 1. 44 g 5. 76 g 水解酪蛋白(CH) 0. 30 g 0. 15 g 0. 6 g 蔗糖(sucrose ) 30 g 15 g 60 g 植物凝膠(Phytagel )3 g _ 1. 5 g_ 6 g_
-ζ—------------------
用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，封口后按常規(guī)方法滅菌。N6Hiacro母液(20X)硝酸鉀56. 60g,磷酸二氫鉀8. OOg,硫酸銨9. 26g，硫酸鎂 3. 70g，氯化鈣3. 32g，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。N6Hiicro 母液(1000X)碘化鉀 0. 80g，硼酸 1. 60g，硫酸錳 3. 33g，硫酸鋅 1. 50g，蒸 餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)將3. 73g 乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和 2. 78g FeSO4. 7H20分別溶解，混合并用。用蒸餾水定容至1000ml，70°C溫浴2h，冷卻后4°C 保存不超過1個(gè)月。N6維生素貯存液(1000X)維生素B1O. IOg,維生素B6O. 05g,煙酸0. 05g,甘氨酸 0. 20g，加蒸餾水定容至100ml，過濾除菌，4°C保存不超過1周。表3YM 液體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif) 表4YM 固體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif) 表5AAM培養(yǎng)基
加IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5. 2，常規(guī)滅菌。AAM macro (IOX) 2. 5g七水硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)，1. 5g二水氯化鈣(CaCl2 ·2Η20)， 1. 33g 二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4. 2H20)，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆谩AM micro (100X) 0. 7g 單水硫酸錳(MnSO4 ·Η20)，0. 2g 七水硫酸鋅(ZnSO4 ·7Η20)， 0. 075g 碘化鉀(KI)，0. 3g 硼酸(H3BO3)，25mg 二水鉬酸鈉(Na2MoO4. 2H20)，2. 5mg 五水硫酸銅 (CuSO4. 5H20)，2. 5mg六水氯化鈷(CoCl2. 6H20)，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆谩AM 有機(jī)(1000X) :0· 75g 甘氨酸(Glycine)，0. Ig 煙酸(Nicotinic acid) ,0. Ig VB6(Pyridoxine), Ig VB1 (Thiamine)，蒸餾水定容至 100ml，4°C保存?zhèn)溆?。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)見表2。表6N6-AS共培養(yǎng)基 調(diào)pH 至 5. 2。N6Hiacro 母液(20X)，N6Hiicro 母液(1000X)，鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)，N6 維
生素貯存液(1000X)均見表2表7MS-R分化培養(yǎng)基 調(diào)PH值至5. 8，常規(guī)方式滅菌。MS macro (20X)硝酸銨33. Og，硝酸鉀38. Og，磷酸二氫鉀3. 4g，硫酸鎂7. 4g，氯化 鈣8. Sg逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1L，4°C保存。MS micro (1000X)硫酸錳 16. 90g，硫酸鋅 8. 60g，硼酸 6. 20g，碘化鉀 0. 83g，鉬酸 鈉0. 25g，硫酸銅0. 025g，氯化鈷0. 025g，上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1L，4°C保存。MS維生素貯存液(1000X)維生素B1O. 010g，維生素B6O. 050g，煙酸0. 050g，甘氨 酸0. 200g，加蒸餾水定容至100ml，過濾除菌，4°C保存不超過1周。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)見表2。表81/2MS生根培養(yǎng)基 調(diào)PH 值至 5. 8。MS macro (20X)見表 7。MS micro (1000X) MS 維生素C存液(1000X)見表 7。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)見表2。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。序列表<110>深圳華大基因科技有限公司<120> 一種啟動(dòng)子BgIosP513、其制備方法及用途<130>IDC090131<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>415<212>DNA<213> /JcfS H^Hf (Oryza sativa L. ssp. japonica cv.)<400>1ttgtacaaag tattctttct agtggattgt gcaaagaaaa gagaaggtga acagggaggg 60aagaagaaaa tatctcggag gtaggttgtt ttcttactgc aacatcaact gcatgctgtc 120cttttttggc tgtgcctgtt ttgcaatttt gtaagaattg aggtaagata agtatgaaga 180gatagggtag aaatatcttt acaagagtac aaagatgcgg ggcattgggg gtggggccct 240gtagcgagca agccaaatgg gagaacacca catatcagct gaatcttatc catagaaaag 300agggaattga aggggcagga aggatatccc ggccttgtgg cacacttgac tggagatgta 360taaagagagg aggatgtgaa gaaagaagat atctaccacc aagctaatta agcaa415
<210>2<211>31<212>DNA
<213>人工序列<400>2ccggaattct tgtacaaagt attctttcta g31<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3gcctgcagtt gcttaattag cttggtggta30<210>4<211>433<212>DNA<213>人工序列<400>4ctcgaattct tgtacaaagt attctttcta gtggattgtg caaagaaaag agaaggtgaa 60cagggaggga agaagaaaat atctcggagg taggttgttt tcttactgca acatcaactg 120catgctgtcc ttttttggct gtgcctgttt tgcaattttg taagaattga ggtaagataa 180gtatgaagag atagggtaga aatatctcta caagagtaca aagatgcggg gcattggggg 240tggggccctg tagcgagcaa gccaaatggg agaacaccac atatcagctg aatcttatcc 300atagaaaaga gggaattgaa ggggcaggaa ggatatcccg gccttgtggc acacttgact 360ggagatgtat aaagagagga ggatgtgaag aaagaagata tctaccacca agctaattaa 420gcaactgcag gtc433<210>5<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>5ggtaccaagc ttactagtcc tgcaggtcta gaggatccgt cgaccatgg49<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gcttccggct cgtatgttgt20<210>7<211>19
<212>DNA〈213〉人工序列<400>7gagtcgtcgg ttctgtaac19<210>8
<211>2353<212>DNA〈213〉人工序列〈400>8gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat60taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt120aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt180atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat240tacgaattcg agctcggtac caagcttact agtcctgcag gtctagagga tccgtcgacc300atggtagatc tgagggtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt360ttctcttttt atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat420tggttatggt gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg480tctatgatga tgatgatagt tacagaaccg acgactcgtc cgtcctgtagccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg600aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg660cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta720tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga780tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg840cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg900tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat960taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg1020aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt1080ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa1140tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg1200cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct1260ctatgaactc gaagtcacag ccaaaagcca gacagagtct gatatctacc cgcttcgcgt1320cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta1380ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt1440gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc1500gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat1560tgatgaaact gctgctgtcg gctttcagct gtctttaggc attggtttcg aagcgggcaa1620caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt1680acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga
ccaagcgtgg tgatgtggag1740tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc1800
ggaagcaacgcgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg 1860cgacgctcacaccgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta 1920cggatggtatgtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact1980tctggcctggcaggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac2040gttagccgggctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg2100gctggatatgtatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg 2160 gaatttcgccgattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg 2220gatcttcactcgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac2280tggcatgaacttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caagctagcc accaccacca 2340ccaccacgtgtga235權(quán)利要求
一種具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，優(yōu)選地， 所述重組載體為P8+P513重組載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述重組載體的重組細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的重組細(xì)胞，其為重組農(nóng)桿菌EHA105-P513。
5.一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1所述的啟 動(dòng)子，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，更優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花9、中花 10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、 II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、 皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖 稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本 晴。
6.一種制備權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQID NO :1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，具體地，所述PCR擴(kuò)增 引物對(duì)為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
7.—種調(diào)控單子葉植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，特別優(yōu)選地， 所述水稻為日本晴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了權(quán) 利要求4所述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P513。
9.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的用途，其中所述目的 基因?yàn)镚US，所述單子葉植物為水稻，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
10.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在水稻育種中的用途，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花 9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II 優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻 為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種單子葉植物例如水稻的啟動(dòng)子，以及所述啟動(dòng)子的制備方法及用途。本發(fā)明所述啟動(dòng)子具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子的制備方法以及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)和水稻育種中的用途。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101864418SQ20091024957
公開日2010年10月20日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者李華, 李寧, 束禮平, 黃三文 申請人:深圳華大基因科技有限公司