花生AhWRI-1啟動子及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術領域，具體涉及一種花生AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄 因子AhWRI-Ι基因啟動子，同時還涉及一種花生啟動子PAhWRIi的制備方法及其在植物基因 工程中的應用。
【背景技術】
[0002] 通過轉(zhuǎn)基因手段進行作物品種的選育，其優(yōu)勢在于轉(zhuǎn)基因不受生物體親緣關系的 限制，理論上講，用于轉(zhuǎn)化的基因可以來源于任何物種或人工合成的基因。2014年全球轉(zhuǎn)基 因植物種植面積達到1. 8億公頃，年增長率在3% -4%之間，目前轉(zhuǎn)基因技術已成為植物品 種改良的重要手段。
[0003] 在植物轉(zhuǎn)基因中有兩個必需元件，分別是啟動子和基因。啟動子是生物體內(nèi)的一 段DNA片段，是位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的順式調(diào)控序列，與反式作用的識別因子結(jié)合， 通過RNA聚合酶同反式作用因子相互作用，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。它是調(diào)控基因表達過程中的 重要因子，其決定了動植物在發(fā)育過程中基因表達的空間、時間及表達強度的特異性。按照 作用方式和功能，啟動子可分為組成型、特異性和誘導性啟動子，在某些情況下一類啟動子 也會兼有其它類型啟動子的特性。
[0004] 啟動子在構(gòu)建能夠高水平表達異源表達載體的過程中起到關鍵作用，它決定了外 源基因的轉(zhuǎn)錄效率和基因的表達水平。組成型啟動子驅(qū)動的外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的所 有發(fā)育時期和組織中穩(wěn)定表達。對許多雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，通常都使用含花椰菜花葉病毒 (CaMV)的35S啟動子或胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質(zhì)粒載體，而在單子葉植物轉(zhuǎn)化中最 常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子、玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質(zhì)粒載體。但 是很多時候外源基因在受體植物中的持續(xù)高效表達不僅造成生物體內(nèi)能源的浪費，而且在 所有組織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉(zhuǎn)基因安全問題。因此，組織 特異性啟動子和誘導性啟動子的研究和應用日益受到育種工作者的重視。
[0005] 組織特異性啟動子是指驅(qū)動的基因僅在某一特定組織或器官中表達，或者只是在 植物生長發(fā)育過程中的某一個特定階段表達。如根特異性啟動子、擬南芥葉片特異性啟動 子、番茄果實特異性啟動子、水稻花藥特異性啟動子、胚乳特異性啟動子、棉花纖維特異性 啟動子等。特異性啟動子不僅可以使得外源基因在受體中發(fā)揮作用，而且能有效減少對植 物的不利影響。
[0006] 花生是全世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟和油料作物，花生果仁中含有豐富的脂肪酸 和蛋白，是重要的油脂和蛋白來源。花生油中脂肪酸主要是由不飽和脂肪酸油酸和亞油酸 構(gòu)成，兩者占花生油總脂肪酸含量的80%左右，是一種較為健康的食用油，在世界食用油消 費和休閑食品供應中占據(jù)重要地位。隨著人民生活水平的提高，花生的營養(yǎng)保健功能日益 受到重視，食品加工占總產(chǎn)量的比例進一步增加。而隨著城市化的推進，耕地面積不斷減 少，這要求我們需要進一步提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。轉(zhuǎn)基因技術的日益成熟為提高花生產(chǎn) 量和品質(zhì)提供了新的途徑，但是面臨著轉(zhuǎn)基因的安全風險。在轉(zhuǎn)基因研究中使用特異性表 達的啟動子是解決這一風險的可行性方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于：提供一種PAhWRIi啟動子序列及其制備方法。該啟動子的時空 表達模式可用于研究基因的表達形式，優(yōu)點在于，來源于植物內(nèi)源的組織特異性啟動子能 夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動目的基因在轉(zhuǎn)基因植物的特定組織或時期表達，避免造成 植物自身能源和物質(zhì)的浪費，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達效率，限制其表達部位， 更好的發(fā)揮功能，可應用于植物基因工程研究和花生的轉(zhuǎn)基因研究。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于：提供一種花生PAhWRIi的制備方法，該方法通過對花生 基因組DNA進行PCR擴增，獲得花生PAhWRIi啟動子，該方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
[0009] 本發(fā)明的再一個目的在于：提供一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含 有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的標記基因GUS 表達強度高，容易檢測。
[0010] 本發(fā)明還有一個目的在于：提供一種花生PAhWRIi啟動子在種子中的應用。
[0011] 為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種分離的花生轉(zhuǎn)錄因子AhWRI-l基因的啟動子，其序列為下列核苷酸序列之一： (a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列； (b) 在嚴謹條件下能與（a)的DNA序列雜交并且具有相同功能的核苷酸序列； (c) 與（a)或（b)的DNA序列具有90%以上的同源性，并且具有啟動子功能的核苷酸 序列。
[0012] -種花生啟動子PAhWRIi的制備方法，包括以下步驟： (1) 利用SDS裂解法提取基因組DNA，所用引物為： Pahwri 1s：5;-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC; -3;； Pahwri1A：5 ; -CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3;； (2) 以基因組DNA為模板，以PAhWRi#、ΡΑΜΚΙ 3為引物進行PCR擴增，反應體系為25μL， 包括：1XPCRbuffer、MgCl2 1. 5mmol/L、dNTP0· 2mmol/L、PfuTaq酶 1. 5 單位、模板 30 ~ l〇〇ng，體系中每種引物的濃度均為0· 5mol/L; 擴增過程為：95°C預變性lmin;94°C變性10s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35個循 環(huán)；72°C延伸lOmin; (3)PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，用凝膠回收試劑盒回收目的片 段；按目的片段、PMD18-T載體3:1的摩爾比混合，加入5個單位的T4DNA連接酶，10X反 應緩沖液2. 5μL，用無菌水補充體積至25μL，16°C連接過夜，獲得連接液； (4) 用凍融法轉(zhuǎn)化DH5a菌株的感受態(tài)細胞，將連接液涂布于含有氨芐青霉素50mg/L的 LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑選白斑，進行菌落PCR檢測，將陽性重組子接種于 含氨芐青霉素50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，用小量堿法提 取質(zhì)粒，SalI/XbaI雙酶切1yg質(zhì)粒，用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測；將檢測正確的 陽性重組質(zhì)?？寺?，將目的片段連入PMD18-T載體，獲得載體pMD18-PAhWRIi，即得到所述的 PaIiWRI1 啟動子。
[0013] 其中LB固體培養(yǎng)基的制備方法如下：分別稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、 log氯化鈉和8g瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于lOOOmL;然后分裝于500mL三角瓶中， 121°C、6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘，4°C冷藏備用。
[0014] 其中LB液體培養(yǎng)基的制備方法如下：分別稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取 物和l〇g氯化鈉溶解于蒸餾水中，定容于l〇〇〇mL，然后分裝于500mL三角瓶中，121 °C、 6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘，4°C冷藏備用。
[0015] -種含有AhWRI-Ι基因的啟動子的重組載體。
[0016] 所述的花生AhWRI-Ι基因啟動子的重組載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： 首先用SalI/XbaI雙酶切克隆載體pMD18-PAhWRIi，同時用Sall/Xbal雙酶切 pBI-PAhsAD_GUS質(zhì)粒；酶切反應在37°C培養(yǎng)箱中進行，反應4~6小時后用質(zhì)量體積比為1 % 的瓊脂糖膠電泳檢測； 將克隆載體pMD18-PAhWRIi酶切下的3Kb的小片段和pBI-PAhsAD-GUS酶切下的10Kb的大 片段用DNA凝膠回收試劑盒回收；按3Kb的小片段、10Kb的大片段以摩爾濃度3:1的比例 混合，加入T4DNA連接酶5個單位、10X反應緩沖液2μL，用無菌水補充體積至20μL，16°C 過夜； 用凍融法轉(zhuǎn)化DH5a菌株的感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選， 16小時后挑取正常生長的菌斑進行菌落PCR檢測，挑取陽性菌落提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證對正 確的重組質(zhì)粒命名為pBI-PAhWRIρ
[0017] 所述的啟動子在種子中的應用。
[0018] 本發(fā)明的積極有益效果（優(yōu)點）： 1、本發(fā)明的啟動子的時空表達模式可用于研究基因的表達形式，優(yōu)點在于，來源于植 物內(nèi)源的組織特異性啟動子能夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動目的基