專利名稱：植物中提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量和貯存的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及基因構(gòu)建體和使用所述構(gòu)建 體改良植物種子以產(chǎn)生提高量的目的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
種子為人和牲畜提供了膳食蛋白質(zhì)的重要來源。某些種類的種子例如大豆能夠積 累相對(duì)高水平的內(nèi)源蛋白質(zhì)，從而使大豆成為進(jìn)行遺傳修飾以產(chǎn)生引入的蛋白質(zhì)的良好選 擇。盡管許多分子工具是可獲得的，然而種子的遺傳修飾通常受到工程改造的蛋白積累不 足的限制。許多細(xì)胞內(nèi)過程可影響總蛋白質(zhì)積累，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)裝配和折疊、甲基 化、磷酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)水解。一個(gè)或多個(gè)此類過程的干擾可增加在基因工程改造的種子 中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量?；虻囊肟蓪?duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育造成有害作用。在這樣的情況下，基因的表達(dá)可 能需要被限制于期望的靶組織。例如，可能必需以種子特異性方式表達(dá)氨基酸脫調(diào)控基因 以避免可影響產(chǎn)量或其他農(nóng)藝性狀的不期望的表型。大豆種子包含35%至43%的蛋白質(zhì)(基于干重)；該蛋白質(zhì)大部分為貯藏蛋白 (storage protein) 0存在兩種主要的大豆種子貯藏蛋白大豆球蛋白(也稱為IlS球蛋 白)和β伴大豆球蛋白(也稱為7S球蛋白)。它們總共占70至80%的種子總蛋白，或25 至35%的種子干重。大豆球蛋白是具有大約360kDa的分子量的大蛋白。其是由鑒定為Gl、G2、G3、G4 和G5的5個(gè)主要亞基的不同組合組成的六聚物。β伴大豆球蛋白是具有范圍在150至MOkDa之間的分子量的異質(zhì)糖蛋白。其由 鑒定為α、α ‘和β的3個(gè)高度帶負(fù)電荷的亞基的不同組合組成。Kinney 和 Herman(〃 Cosuppression of the α Subunits ofbeta-conglycinin in Transgenic Soybean Seeds Induces theFormat i on of EndoplasmicReticulum-Derived Protein Bodies" PlantCell 13 1165-1178 UOOl))報(bào)導(dǎo)，使用包含 可轉(zhuǎn)錄成β伴大豆球蛋白5'非翻譯前導(dǎo)序列的區(qū)域的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致β伴大豆球蛋 白的α和α ‘亞基的減少。Kirmey和Herman指出，‘‘β伴大豆球蛋白的減少可明顯地 由大豆球蛋白和其他液泡蛋白在ER中的增加的積累補(bǔ)償"，這使得他們推測(cè)，“可能通過共 表達(dá)其他蛋白質(zhì)，可能作為具有可切割間隔子的大豆球蛋白融合蛋白，可能能夠改造大豆 以高水平表達(dá)和積累需要ER介導(dǎo)的折疊和加工事件的外源蛋白。Kirmey和Herman沒有教 導(dǎo)在大豆種子中減少β伴大豆球蛋白的表達(dá)，同時(shí)在大豆球蛋白啟動(dòng)子的控制之下表達(dá) 融合至ER信號(hào)肽的外源蛋白。Oulmassov等(美國(guó)專利申請(qǐng)2005/0079494)描述了在啟動(dòng)子例如大豆球蛋白啟 動(dòng)子的控制下的突變的大豆球蛋白的表達(dá)。Oulmassov等還描述了反義介導(dǎo)的包含低含量 的必需氨基酸，但在特定的組織中仍然以相對(duì)高水平表達(dá)的序列(例如β伴大豆球蛋白和 大豆球蛋白)的抑制。Oulmassov等人沒有教導(dǎo)減少β伴大豆球蛋白的表達(dá)對(duì)于在大豆球 蛋白啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)和積累的任何可能后果，也沒有教導(dǎo)在大豆種 子中抑制β伴大豆球蛋白的表達(dá)，同時(shí)表達(dá)在大豆球蛋白啟動(dòng)子控制之下的融合至ER信 號(hào)肽的外源蛋白的任何可能后果。美國(guó)專利申請(qǐng)2007/0067871)描述了具有增加的種子β伴大豆球蛋白含量的 大豆，其包括提供至少兩個(gè)大豆球蛋白亞基的無義突變表型(null phenotype)的非轉(zhuǎn)基因 突變。mi沒有教導(dǎo)減少β伴大豆球蛋白或大豆球蛋白的表達(dá)或表達(dá)外源蛋白。本領(lǐng)域中需要的是，使用大豆產(chǎn)生高水平的目的蛋白質(zhì)(例如用于食品、燃料、飼 料、工業(yè)酶、生物加工酶、疫苗、治療性蛋白、抗體等的蛋白質(zhì))的方法。發(fā)明概述本文中提供的是在種子中產(chǎn)生增加量的目的異源蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案 中，遺傳抑制種子蛋白的產(chǎn)生引起種子通過增加其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來重新平衡其蛋白質(zhì)組 成以維持正常的種子蛋白含量?？蓪⒃撔?yīng)與基因的“等位基因模擬物(allele mimic)” 的使用組合以驅(qū)動(dòng)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述基因被上調(diào)以重新平衡蛋白質(zhì)含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中提供的是轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，所述植物缺乏一種或多 種植物貯藏蛋白并且具有擁有可操作地連接至貯藏蛋白啟動(dòng)子和ER信號(hào)序列的開放閱 讀框的異源多核苷酸。任選地，異源多核苷酸還包含5'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域(TED)和/或 3' TED。任選地，異源多核苷酸還包含ER滯留序列以誘導(dǎo)異源多核苷酸在ER或ER衍生的 小泡的腔中積累。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，所述植物缺乏一種或多種種子 貯藏蛋白并且具有異源多核苷酸，所述異源多核苷酸具有種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、具有ER信 號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)的開放閱讀框，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源種子 貯藏蛋白相對(duì)于野生型植物的種子貯藏蛋白減少至少50%，其中所述開放閱讀框可操作地 連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子，并且其中轉(zhuǎn)基因植物的種子能夠以高于5%的種子總干重的 水平產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。異源多核苷酸還可具有5'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域和/或3'翻譯增強(qiáng) 子結(jié)構(gòu)域。ER滯留序列可誘導(dǎo)異源蛋白質(zhì)在ER或ER衍生的小泡的腔中積累。雙子葉植物 可以是例如豆科(Fabaceae)，任選地豆目(Fabales)，任選地大豆屬(soya genus)的成員。 雙子葉植物可以是大豆屬(Glycine genus)的成員例如大豆。啟動(dòng)子可來源于例如Kunitz胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、免疫顯性大豆變應(yīng)原PM或Gly m Bd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、 種子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域可來源于Kimitz胰蛋白酶 抑制劑、大豆凝集素、免疫顯性大豆變應(yīng)原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、種子成熟 蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。缺乏的貯藏蛋白可以是例如Kimitz胰蛋白酶抑制劑、 大豆凝集素、免疫顯性大豆變應(yīng)原PM或Gly m Bd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、種子成熟蛋白、大 豆球蛋白或伴大豆球蛋白中的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，缺乏可以因例如編碼種子 貯藏蛋白的核酸的RNAi、反義或有義片段的存在而引起。本文中提供的雙子葉植物種子可具有例如種子內(nèi)源貯藏蛋白的多于75%的缺乏。 異源蛋白質(zhì)可在雙子葉植物的種子中積累至大于大約2%或大于大約4%或大于大約5% 的種子總干重的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)基因種子或獲自所述種子的蛋白質(zhì)。 可純化異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)編碼序列編碼酶或其片段。酶可以是纖維素分解酶例 如β -葡糖苷酶、外切葡聚糖酶1、外切葡聚糖酶II、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、半纖維素酶、 木質(zhì)酶、木質(zhì)素過氧化物酶或錳過氧化物酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了商業(yè)上有用的酶組 合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中提供了轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，所述植物缺乏一種或多種 內(nèi)源植物貯藏蛋白而具有異源多核苷酸，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源植物貯藏蛋白的水平相對(duì) 于野生型植物減少至少50%，所述異源多核苷酸具有可操作地連接至開放閱讀框的補(bǔ)償?shù)?白的基因調(diào)控區(qū)，所述閱讀框編碼具有ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào) 的序列，其中轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生異源蛋白 質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中提供了通過將酶貯藏在種子中而在使用之前穩(wěn)定地 貯藏酶的方法，所述種子來自缺乏一種或多種植物貯藏蛋白但具有異源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因 雙子葉植物，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源種子蛋白減少至少50%，所述異源多核苷酸具有種子 貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱讀框，所述開放閱讀框具有編碼ER信號(hào)序列、目的酶和ER滯留信 號(hào)的核酸，其中所述開放閱讀框可操作地連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子，并且其中轉(zhuǎn)基因植 物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生酶，并且將酶貯藏在轉(zhuǎn)基因雙子葉植物 的種子中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中提供了在雙子葉植物中產(chǎn)生提高量的異源蛋白質(zhì)的 方法，所述方法用多核苷酸(所述多核苷酸具有種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱讀框，所述開 放閱讀框具有ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)，其中所述開放閱讀框可 操作地連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞獲得純 合植物品系，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物品系種質(zhì)滲入(introgress)至缺乏內(nèi)源種子貯藏蛋白的 植物，培養(yǎng)經(jīng)種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子，從種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子獲得異源蛋 白質(zhì)，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源種子貯藏蛋白相對(duì)于野生型植物的內(nèi)源種子貯藏蛋白減少至 少50%，其中種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生異源 蛋白質(zhì)。內(nèi)源種子貯藏蛋白的缺乏可因例如編碼種子貯藏蛋白的核酸的RNAi、反義或有義 片段的存在而引起。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在雙子葉植物中產(chǎn)生增加量的異源蛋白質(zhì)的方法，其包括用多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多核苷酸具有種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱讀 框，所述開放閱讀框包含ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)；其中所述開 放閱讀框可操作地連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子；其中所述核苷酸還包含能夠下調(diào)內(nèi)源種子 貯藏蛋白的RNAi序列；獲得純合植物品系，和培養(yǎng)植物的種子以獲得異源蛋白質(zhì)。附圖概述

圖1是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)至蛋白質(zhì)貯藏液泡或蛋白質(zhì)體(protein body) (PB)的亞細(xì) 胞定位的不同途徑的模型。圖2是顯示經(jīng)設(shè)計(jì)用于抑制大豆球蛋白的RNAi構(gòu)建體的示意圖。大豆球蛋白基 因和fad2(脂肪酸去飽和酶)基因的區(qū)段包括在RNAi構(gòu)建體中。加入fad2區(qū)段作為構(gòu)建 體的任選特征，從而提供了用于另外的篩選的標(biāo)記。圖3是電子顯微照片，其顯示來自種子蛋白缺乏品系"SP-"植物的細(xì)胞形成蛋 白質(zhì)貯藏液泡(PSV)(圖框A)，所述蛋白質(zhì)貯藏液泡在大小和外觀上與在來自WT種子的細(xì) 胞中形成的PSV(圖框B)明顯相似。PSV 蛋白質(zhì)貯藏液泡；OB 油體；AV :自噬泡；ER 內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)；Nucl 細(xì)胞核；G 高爾基體。條棒相當(dāng)于1 μ m。圖4是野生型(WT)品種"Jack"與SP-種子的蛋白質(zhì)組之間的雙向等電聚焦/ 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF/SDS-PAGE)比較的照片。圖5是使用Affymetrix DNA陣列平臺(tái)測(cè)定進(jìn)行的SP-與WT品種‘‘Jack"相比較 的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測(cè)定的散布圖。圖6是顯示W(wǎng)T(" Jack")對(duì)SP-大豆品系的種子中種子蛋白質(zhì)組成的變化的餅 圖。圖7是顯示GFP-kdel構(gòu)建體的詳細(xì)情況的示意圖。標(biāo)示了大豆球蛋白啟動(dòng)子、大 豆球蛋白5' UTR(" TED" )、ER信號(hào)序列、GFP編碼序列、kdel ER滯留信號(hào)序列和大豆球 蛋白3' UTR(" TED")。標(biāo)示了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和翻譯終止位點(diǎn)。圖8是顯示兩個(gè)純合親本品系和雜交的純合后代的大豆種子的白光(圖框A)和 藍(lán)光(圖框B)圖像的一組照片。顯示的種子已被破裂，從而暴露子葉組織(圖框A和B)。 圖框C和D是WT背景(圖框C)和GFP-kdel χ β CS (圖框D)的種子中來自GFP-kdel (添 加了 C末端KDELER滯留標(biāo)簽的GFP蛋白)的貯藏薄壁組織細(xì)胞的偽彩色GFP圖像。條棒 相當(dāng)于10 μ m。圖9是來自β CS種子(β伴大豆球蛋白被抑制的；圖框A) ,GFP-kdel種子(圖框 B)和GFP-kdel χ β CS種子(圖框C)的蛋白質(zhì)裂解物的2D IEF-PAGE分離以及針對(duì)GFP 進(jìn)行探測(cè)的重復(fù)裂解物凝膠的免疫印跡(圖框D)的一組照片。GFP-kdel (圖框B和C)或 GFP對(duì)照蛋白質(zhì)點(diǎn)包封在所標(biāo)記的盒中。GFP-kdel性狀至β CS品系內(nèi)的種質(zhì)滲入導(dǎo)致增 加的GFP-kdel的積累。使用商業(yè)單克隆抗體探針通過印跡上的免疫反應(yīng)性來確定GFP點(diǎn) 的身份(identity)(圖框D)。圖10顯示β CS,WT中的GFP-kdel或GFP-kdel χ β CS的熒光顯微鏡檢查(圖框 A)、1D PAGE(圖框B)和β伴大豆球蛋白免疫印跡(圖框C)。圖11是從β CS、WT中的GFP-kdel或GFP-kdel χ β CS種子制備并且使用商業(yè) GFP作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定的種子裂解物中GFP-kdel豐度的熒光分析的條形圖。圖12是顯示W(wǎng)T(〃 Jack" )、β CS和GFP-kdel χ β CS中大豆球蛋白的加工的分級(jí)分離的種子蛋白質(zhì)的單向PAGE的照片。掃描所獲得的染色的凝膠，并顯示總計(jì)的前大豆 球蛋白(proglycinin)的前大豆球蛋白級(jí)分、大豆球蛋白A4、大豆球蛋白酸性亞基和大豆 球蛋白堿性亞基的相對(duì)分布。結(jié)果顯示大豆球蛋白群體的前大豆球蛋白級(jí)分的大于3倍的 降低。標(biāo)示了分子量標(biāo)記和貯藏蛋白同種型。圖13是SP-植物(圖框A)、在WT背景中轉(zhuǎn)化的GFP-kdel (圖框B)和用GFP_kdel 種質(zhì)滲入的SP-植物(圖框C)中蛋白質(zhì)產(chǎn)量的2-D凝膠分析的照片。圖14是從SP-植物、用GFP-kdel轉(zhuǎn)化的WT植物和GFP-kdel χ SP-雜種的種子 制備的種子裂解物中GFP-kdel豐度的熒光分析的條形圖。商業(yè)GFP用作對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。圖15是顯示β CS χ GFP-kdel植物的晚熟種子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)體的豐度 的電子顯微照片。圖框A 蛋白質(zhì)體包含分散的基質(zhì)并且被ER膜包圍。圖框B:顯示蛋白質(zhì) 體的ER來源的圖像。PSV;蛋白質(zhì)貯藏液泡；OB=油體。條棒相當(dāng)于1 μ m。發(fā)明詳述本文中提供的是經(jīng)遺傳改良的雙子葉植物，其具有產(chǎn)生大量的異源目的蛋白質(zhì)的 種子。在某些實(shí)施方案中，種子缺乏至少一種內(nèi)源種子貯藏蛋白，從而允許在其中產(chǎn)生增加 量的外源蛋白質(zhì)?？蓪⒕幋a異源蛋白的核酸序列可操作地連接至來自種子蛋白質(zhì)的調(diào)控 區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該調(diào)控區(qū)來源于響應(yīng)內(nèi)源種子蛋白的缺乏而天然上調(diào)的種子蛋白。在一些實(shí)施方案中，可將雙子葉植物中的遺傳編程(geneticprogramming)成功 地用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，例如在質(zhì)量和數(shù)量上優(yōu)良的蛋白質(zhì)(例如，重組蛋白)。在一些實(shí)施方案中，修飾植物的遺傳背景以便一種或多種貯藏蛋白的量(例如按 重量計(jì))存在缺乏。通過使用一種或多種貯藏蛋白啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)靶蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，植物的 重新平衡機(jī)制可導(dǎo)致特別高水平的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在該實(shí)施方案中，不希望受理論束縛，響應(yīng)引起主要種子貯藏蛋白喪失的遺傳缺 陷，種子通過增加其他種子貯藏蛋白的產(chǎn)量來“重新平衡”。通過將目的異源基因連接至被 上調(diào)以重新平衡種子中蛋白質(zhì)的總量的內(nèi)源種子蛋白的基因調(diào)控元件，可在種子中產(chǎn)生高 水平的異源蛋白質(zhì)。由于外源蛋白質(zhì)的該高水平的積累，該“等位基因模擬物”法可用于在 大豆或其他雙子葉植物種子中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，特別是具有商業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)。此外，異源蛋白質(zhì)至ER的任選靶向允許其穩(wěn)定地以甚至更高的水平在種子中積 累?？稍诋愒吹鞍踪|(zhì)上對(duì)信號(hào)進(jìn)行工程改造，這可導(dǎo)致靶蛋白被扣留在ER衍生的小泡中， 無論植物是否天然產(chǎn)生生理學(xué)上的蛋白質(zhì)體。此類ER衍生的小泡令人驚訝地不含其他蛋 白質(zhì)例如蛋白酶、糖苷酶等，從而以較少被降解或較不可降解的形式積累更高水平的蛋白 質(zhì)。如本文中所使用的，使用下列縮寫和定義。術(shù)語(yǔ)"大豆球蛋白"意指也稱為IlS球蛋白的主要種子貯藏蛋白，其存在于大豆 種子中。術(shù)語(yǔ)"β伴大豆球蛋白"意指也稱為7S球蛋白的主要種子貯藏蛋白，其存在于 大豆種子中。術(shù)語(yǔ)“GBP”意指葡萄糖結(jié)合蛋白。術(shù)語(yǔ)〃 KTI 〃意指Kunitz胰蛋白酶抑制劑。術(shù)語(yǔ)〃 LE"意指大豆凝集素。術(shù)語(yǔ)〃 Ρ;34〃意指免疫顯性大豆變應(yīng)原Ρ;Μ或Gly m Bd 3。
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縮寫〃 fad2〃意指編碼〃脂肪酸去飽和酶〃基因的一部分的序列。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“植物”包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、植物胼胝體、植物 塊(plant clump)和在植物或植物部分例如花粉、花、胚、種子、莢果、葉、莖等中完整的植物 細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"PB"意指蛋白質(zhì)體。此類單層膜小泡能夠貯藏蛋白，并且直接來源于內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)(與下面描述的PSV相反)。術(shù)語(yǔ)"PSV"意指蛋白質(zhì)貯藏液泡。在種子中，這些小泡通常在種子的成熟和干燥 過程中通過液泡的分隔形成。因此，通常存在于液泡中的降解蛋白質(zhì)的酶也可存在于PSV 中。在正常大豆種子中，大多數(shù)積累的蛋白質(zhì)位于這些細(xì)胞器中。術(shù)語(yǔ)“SMP “意指種子成熟蛋白。術(shù)語(yǔ)"貯藏蛋白"意指特異性在植物例如種子中積累的蛋白質(zhì)?？s寫〃 BBI"意指〃包曼-畢爾克抑制劑(bowman birk inhibitor)“，其是絲氨 酸蛋白酶抑制劑。術(shù)語(yǔ)〃 β CS"意指只缺乏貯藏蛋白β伴大豆球蛋白的植物。術(shù)語(yǔ)"SP-"意指貯藏蛋白敲低，即，缺乏大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白的植物。術(shù)語(yǔ)"種子"通常包括種子本身(proper)、種皮和/或種殼或其任何部分?！胺N子成熟“意指始于受精且終止于種子干燥的時(shí)期，在此期間中可代謝的貯藏 物例如淀粉、糖、寡糖、酚類化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)沉積至種子的不同組織，從而導(dǎo)致種子 增大、種子填充(seed filling)。術(shù)語(yǔ)"WT"意指野生型和意指植物的天然存在的背景，或，根據(jù)使用的上下文很 明顯地，WT可以指具有天然存在的遺傳背景但用于本發(fā)明的基因操作的植物。術(shù)語(yǔ)"0RF"意指開放閱讀框；即編碼肽(例如，“靶蛋白質(zhì)”)的序列。一般地， 該序列不被編碼氨基酸序列的起始密碼子與終止密碼子之間的內(nèi)含子中斷。術(shù)語(yǔ)"異源多核苷酸"通常意指除了作為轉(zhuǎn)化事件的結(jié)果外不同等地存在于宿 主植物中的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)〃異源DNA"、‘‘異源基因〃或〃外源DNA"意指DNA，通常意 指DNA編碼序列(“異源編碼序列”)，其已被從另一個(gè)來源(即，非植物來源或來自另一個(gè) 植物物種，或被置于通?？刂屏硪粋€(gè)編碼序列的植物啟動(dòng)子的控制之下的相同物種的編碼 序列)引入植物細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源"基因意指通常在其基因組的天然位置上發(fā)現(xiàn)的天然基因，并且不是 分離的?！巴庠?基因意指通常不在宿主生物中發(fā)現(xiàn)而是通過基因轉(zhuǎn)移引入的基因。術(shù)語(yǔ)"編碼序列"或"編碼區(qū)"意指編碼特定蛋白質(zhì)的DNA序列。在本發(fā)明的說明書中，“嵌合基因"或"表達(dá)盒"意指可操作地連接至編碼期望 的基因產(chǎn)物的DNA序列的啟動(dòng)子序列和優(yōu)選地轉(zhuǎn)錄終止序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合基 因還包含在啟動(dòng)子與基因產(chǎn)物編碼序列之間與基因產(chǎn)物編碼序列符合翻譯框地可操作地 連接的信號(hào)肽編碼區(qū)。該信號(hào)序列幫助將蛋白質(zhì)定位至ER。所述序列還可包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元 件，例如上述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及翻譯調(diào)控信號(hào)例如終止密碼子?！翱刹僮鞯剡B接"意指表達(dá)盒的組分被連接以用作表達(dá)異源蛋白質(zhì)的單位。例 如，可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的異源DNA的啟動(dòng)子促進(jìn)相應(yīng)于異源DNA的功能性mRNA的產(chǎn)生。
“ RNA轉(zhuǎn)錄物“意指因RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)〃信使RNA(mRNA)“通常意指可被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。術(shù)語(yǔ)"有義"RNA通常意指包括mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄物。術(shù)語(yǔ)"反義RNA"意指與靶 初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部分互補(bǔ)并且可抑制靶基因的表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物。反義RNA 的互補(bǔ)性可針對(duì)特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或 編碼序列。術(shù)語(yǔ)"反義抑制"意指能夠阻止靶蛋白質(zhì)的表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)〃 RNAi"或〃 RNA干擾〃通常意指通過將RNA片段引入細(xì)胞來抑制蛋白質(zhì)的 表達(dá)的方法。RNA可由整合入基因組的DNA片段編碼。RNAi還可通過本領(lǐng)域已知的任何其 他方法來制備。RNAi片段可以是任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，可以是單鏈或雙鏈。通常，“調(diào)控序列"是在內(nèi)源或異源(嵌合)基因中位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)的上游 (5')、內(nèi)部或下游(3')的核苷酸序列。此類調(diào)控序列或“調(diào)控區(qū)”可調(diào)控轉(zhuǎn)錄和/或翻 譯。“轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)"或"啟動(dòng)子"意指影響和/或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始的核酸序列。啟動(dòng) 子通常被認(rèn)為包括調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子或誘導(dǎo)子元件(inducerelement)。術(shù)語(yǔ)"上游調(diào)控區(qū)"通常意指在蛋白質(zhì)翻譯起始密碼子上游的區(qū)域。因此，“上游 調(diào)控區(qū)”可包括例如啟動(dòng)子，或其可包括啟動(dòng)子和5' UTR0上游調(diào)控區(qū)還可意指遠(yuǎn)在經(jīng)典 啟動(dòng)子序列上游的區(qū)域，例如“增強(qiáng)子元件”。術(shù)語(yǔ)〃 TED"意指翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域。5' TED(或5‘非翻譯區(qū)(UTR))通常意指編碼位于翻譯起始位點(diǎn)5‘端(上游) 的mRNA的區(qū)域。因此，所述區(qū)域在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始位點(diǎn)之間。5' TED可以是“上 游調(diào)控區(qū)”的一部分。3' TED(或3'非翻譯區(qū)(UTR))通常意指mRNA上的位于蛋白質(zhì)編碼序列的終止 密碼子的下游的區(qū)域。該區(qū)域可包含例如多腺苷酸化信號(hào)和/或能夠影響mRNA加工或基 因表達(dá)的任何其他調(diào)控信號(hào)?！捌鹗济艽a子"和"終止密碼子"意指編碼序列中分別指定蛋白質(zhì)序列的起始 和鏈終止的3個(gè)相鄰核苷酸的單位。下面利用不同的實(shí)施例，任選的技術(shù)特征和一般教導(dǎo)來舉例說明本發(fā)明的范圍。貯藏蛋白許多植物物種的種子包含貯藏蛋白。已基于其大小和可溶性對(duì)此類蛋白進(jìn)行了分 類(Higgins, T. J. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35 191-221)。雖然并非每一個(gè)種類都 發(fā)現(xiàn)于每一個(gè)物種中，但大多數(shù)植物物種的種子包含多于1個(gè)種類的蛋白質(zhì)。特定可溶性 或大小種類中的蛋白質(zhì)通常在結(jié)構(gòu)上與其他物種中相同種類的成員比與相同物種中不同 種類的成員更相關(guān)。在許多物種中，給定種類的種子蛋白通常由多基因家族編碼，有時(shí)所述 家族是這樣復(fù)雜以至其可基于序列同源性分成亞類。大豆種子具有相對(duì)高的蛋白質(zhì)含量，其主要由兩種貯藏蛋白(β伴大豆球蛋白和 大豆球蛋白)組成。在野生型種子中，β伴大豆球蛋白占大約15-20%的總大豆蛋白質(zhì)。 這兩種蛋白質(zhì)都由來源于基因家族的多個(gè)同種型組成。關(guān)鍵貯藏蛋白(Pivotal storage protein)在本文中已被鑒定為參與植物的程序 化發(fā)育。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)可通過功能、結(jié)構(gòu)或序列同源性容易地鑒定其他靶植物中的其他貯藏蛋白。在鑒定此類貯藏蛋白后，此處描述的敲低實(shí)驗(yàn)可鑒定參與蛋白質(zhì)重新平 衡的其他貯藏蛋白。根據(jù)本發(fā)明，調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子、TED等)可用于產(chǎn)生高水平的 期望的蛋白質(zhì)。因此，本文中顯示的許多實(shí)例現(xiàn)可用于對(duì)商業(yè)或人類具有潛在重要性的其 他植物。遺傳缺陷本發(fā)明的植物包含缺陷例如遺傳缺陷，從而導(dǎo)致顯著部分的植物內(nèi)源種子貯藏蛋 白含量的減少。例如，在各種特定的實(shí)施方案中，植物的種子可包含小于大約75%、70%或 小于大約60%或小于大約50%或小于大約40%或小于大約25%或小于15%的量的種子中 總可溶性蛋白。在其他特定實(shí)施方案中，遺傳缺陷導(dǎo)致這樣的量的特定種子貯藏蛋白，其小于通 常存在于WT大豆種子中的內(nèi)源種子貯藏蛋白的量的大約1<%、大約2%、大約5(%、大約 10%,大約25 %、大約50 %、大約75 %或大約85 %。例如，本發(fā)明的植物可缺乏大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP和SMP或 其他種子貯藏蛋白中的1種或2種或3種或4種或更多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，可利用方法例如共抑制、反義、RNAi或其他方法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生種子 貯藏蛋白的缺乏的基因操作。美國(guó)專利5，190，931描述了使用反義構(gòu)建體下調(diào)基因的示例 性方法。美國(guó)專利5，231，020描述了使用有義核酸構(gòu)建體下調(diào)基因的示例性方法。通過使 用雙鏈mRNA來遺傳抑制基因產(chǎn)物的表達(dá)公開于美國(guó)專利6，506，559中。在其他實(shí)施方案中，聚集物中特定的一種或多種種子貯藏蛋白的缺乏可通過常規(guī) 育種方法，然后就低水平的一種或多種種子蛋白進(jìn)行篩選而獲得。種子貯藏蛋白的缺乏還 可通過天然突變或引入的突變，然后通過鑒定具有低水平的一種或多種種子貯藏蛋白的植 物的篩選方法來獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺乏種子貯藏蛋白的植物可以例如從公共可 獲得的種子庫(kù)或種子儲(chǔ)庫(kù)(i^pository)獲得。種子中一種蛋白質(zhì)的遺傳缺陷導(dǎo)致通過其他種子蛋白來補(bǔ)償(重新平衡)如本文中所描述的，一種種子蛋白的抑制可導(dǎo)致通過其他種子蛋白的產(chǎn)量的增加 來補(bǔ)償，這稱為“補(bǔ)償”或“重新平衡”。本文中在缺乏大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白的植 物品系("SP-"；實(shí)施例1)中和在只缺乏β伴大豆球蛋白的植物(實(shí)施例11)中顯示了 該重新平衡。由序列介導(dǎo)的基因沉默導(dǎo)致的種子蛋白β伴大豆球蛋白的抑制通過大豆球蛋白 的增加的豐度來補(bǔ)償(實(shí)施例11)。也如實(shí)施例11中所述，β伴大豆球蛋白α/α ‘抑制 還可使用RNAi技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。該方法導(dǎo)致a/a' β伴大豆球蛋白的完全沉默。部分增加產(chǎn) 生的大豆球蛋白以其前體前大豆球蛋白的形式保持并且被扣留在PB中。蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì) 體而非PSV中的積累顯示2個(gè)重要的點(diǎn)1)ER衍生的PB可在大豆種子中被誘導(dǎo)，并積累蛋 白質(zhì)以及，2)內(nèi)源貯藏蛋白的抑制導(dǎo)致增加的另一種貯藏蛋白的積累以補(bǔ)償質(zhì)量損失。該 現(xiàn)象維持大豆種子的總蛋白質(zhì)含量至_40%，并且被稱為‘重新平衡’。如實(shí)施例1中所示，制備缺乏β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的植物品系 (“SP-")。在β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白中都具有遺傳缺陷的這類種子中，蛋白質(zhì)的 損失由其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)生來補(bǔ)償。蛋白質(zhì)產(chǎn)量的變化可見于圖4，該圖是WT(" Jack")的 種子蛋白質(zhì)提取物與SP-品系的種子蛋白質(zhì)提取物相比較的IEF-PAGE。圖5顯示兩個(gè)品系之間的轉(zhuǎn)錄組的差異。圖6是顯示存在于WT(" Jack")對(duì)SP-品系的大豆種子中的幾種 主要貯藏蛋白的百分比的餅圖。SP-種系中種子蛋白β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的除去 明確地導(dǎo)致由其他蛋白質(zhì)來補(bǔ)償。重新平衡現(xiàn)象可用于在種子中產(chǎn)生大量外源蛋白質(zhì)本文中提供的是具有內(nèi)在生物學(xué)(intrinsic biology)的種子，其通過使外源蛋 白質(zhì)參與重新平衡過程和通過將外源蛋白質(zhì)積累在穩(wěn)定的PB群體中而可被開發(fā)為蛋白質(zhì) 生產(chǎn)平臺(tái)的基礎(chǔ)?？傊@是將雙子葉植物種子開發(fā)為蛋白質(zhì)生產(chǎn)平臺(tái)的基礎(chǔ)。因此，在一些實(shí)施方案中，如上所述減少一種(或多種)種子貯藏蛋白，并且在種 子中產(chǎn)生期望的異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子可操作地連接至編 碼異源蛋白的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼異源蛋白的序列是種子特異性啟動(dòng)子。啟 動(dòng)子可以例如選自大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP或SMP的啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)異源蛋白的基因序列可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)(其在大 豆種子中響應(yīng)上述遺傳缺陷而被上調(diào))的基因的啟動(dòng)子時(shí)，可發(fā)生增加的異源蛋白質(zhì)表 達(dá)。對(duì)于從種子中除去的每一種特定蛋白質(zhì)，另一種(或多種)蛋白質(zhì)可代替其產(chǎn)生。通 過使用該“補(bǔ)償”蛋白質(zhì)的基因調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子、終止子和任選地其他區(qū)域)來驅(qū)動(dòng)目 的異源基因的表達(dá)，可在種子中獲得甚至更高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，被抑制的種子蛋白質(zhì)是β伴大豆球蛋白，同時(shí)異源蛋 白質(zhì)的表達(dá)受到大豆球蛋白的調(diào)控區(qū)的至少一部分控制。在一個(gè)實(shí)施方案中，該調(diào)控區(qū)在 異源序列的上游。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控區(qū)在異源序列的下游或3'端。在一個(gè)實(shí)施 方案中，調(diào)控區(qū)包含大豆球蛋白啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控區(qū)是大豆球蛋白上游調(diào)控 區(qū)，其可包括例如啟動(dòng)子和/或5' UTR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆球蛋白調(diào)控區(qū)還包括 大豆球蛋白3'調(diào)控區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被抑制的種子蛋白質(zhì)是β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白兩 者，同時(shí)異源蛋白質(zhì)受到來自KTI、LE、P34、GBP或SMP之一的調(diào)控區(qū)的至少一部分(5'、 3'或兩者)控制。通過構(gòu)建具有報(bào)告蛋白GFP的轉(zhuǎn)基因(其側(cè)翼于ER轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列和滯留信號(hào)序 列(KDEL)，處于大豆球蛋白元件的調(diào)控下)來測(cè)試蛋白質(zhì)重新平衡和蛋白質(zhì)在PB中的扣留 的概念框架(實(shí)施例9)。通過將GFP-kdel構(gòu)建體置于大豆球蛋白基因元件之下，GFP-kdel 轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)將模擬大豆球蛋白基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)和調(diào)控，從而可能參與牽涉大豆球蛋白 基因的上調(diào)的營(yíng)養(yǎng)分配。表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的大豆在種子中積累了 1.6%的GFP-kdel。然而， 當(dāng)將GFP-kdel植物在遺傳上與β CS植物雜交時(shí)，GFP-kdel表達(dá)的水平在種子中增加幾乎 4倍，達(dá)到大約7% (實(shí)施例12)。因此，β CS種子中GFP-kdel積累的增加顯示，模擬參與 蛋白質(zhì)重新平衡的基因的等位基因可導(dǎo)致目的異源蛋白的積累的大量增加。因此，在實(shí)施方案中，可在種子中產(chǎn)生大量目的蛋白質(zhì)。例如，異源蛋白質(zhì)的表 達(dá)在種子中可達(dá)到大約 1%、2%、5%、7%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、70%或更多的總可溶性蛋白質(zhì)。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的干重可達(dá)到，大約0. 5 %、1 %、2 %、 4%、5%、7%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或更多的種 子總干重?？梢岳缫源蠹s50、100、150、200、250或更多毫克蛋白質(zhì)/種子的量產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可基于每顆植物測(cè)量產(chǎn)生的異源蛋白的量。可以例如以大約 3g、6g、8g、10g、15g或20g或更多的異源蛋白質(zhì)/植物的量產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)?？梢岳缫悦考久坑€大約25、50、100、200、300、400、500、600、700、850、1，000、 1，500、2，000或更多磅的量產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。實(shí)際產(chǎn)量可取決于許多參數(shù)例如每英畝植物、 植物品種、土壤質(zhì)量、栽培措施、植物脅迫以及待產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的純度水平。啟動(dòng)子在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中提供的異源多核苷酸包括獲自或源自植物貯藏蛋白基 因的啟動(dòng)子。在多種實(shí)施方案中，啟動(dòng)子源自與用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物相同目、科、 屬或種的植物。可使用任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是早期種子特異性啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是晚期 種子特異性啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來自補(bǔ)償種子蛋白遺傳缺陷的基因。啟動(dòng)子序列可終止于起始密碼子或其附近并且包括上游(5')的連續(xù)核苷酸。啟 動(dòng)子序列可以是至少大約500個(gè)核苷酸或至少大約1000個(gè)核苷酸或至少大約1500個(gè)核苷 酸。雖然確切長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定和優(yōu)化啟 動(dòng)子長(zhǎng)度(例如，通過測(cè)量和比較轉(zhuǎn)錄水平)。在一個(gè)實(shí)施方案中，上游調(diào)控序列或啟動(dòng)子序列可與SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8 之 一的至少部分具有至少80%、85%、90%、95%、97%、99. 5%或更高的核酸同一性。在具體的實(shí)施方案中，如下所述包含啟動(dòng)子和5' UTR的上游調(diào)控區(qū)選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7。SEQ ID NO :1和2來源于大豆球蛋白，而SEQ ID NO :3_8分別代表伴大豆球蛋白、KTI、 LE、P34、GBP和SMP的上游調(diào)控區(qū)。UTR翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域本發(fā)明的異源多核苷酸任選地包含來自植物貯藏蛋白的翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域 (TED)。在一些實(shí)施方案中，這是mRNA轉(zhuǎn)錄物的非翻譯區(qū)。此類非翻譯區(qū)可以在基因的 5'(上游)或3'(下游)端。TED或UTR的序列還可來源于另一種生物或可以是完全合 成的序列。5' UTR(或“5' TED”)本發(fā)明的構(gòu)建體可包含來自編碼植物貯藏蛋白例如大豆 球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P;34、GBP或SMP的mRNA的5'區(qū)的5' TED。5' TED通常 可在植物貯藏蛋白的啟動(dòng)子與起始密碼子之間被鑒定。5' TED可以是至少大約5、10、25、 30,35,40或更多個(gè)核苷酸或至少大約50個(gè)核苷酸、或至少大約100個(gè)核苷酸、或至少大約 150個(gè)核苷酸。雖然確切長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定 和優(yōu)化終止子長(zhǎng)度(例如，通過測(cè)量和比較翻譯水平)。在具體的實(shí)施方案中，公開于SEQ ID NO :1(大豆球蛋白)、SEQ ID NO :2 (可選擇的大豆球蛋白序列)、SEQ ID N0:3(伴大豆 球蛋白)、SEQ ID NO 4 (KTI)、SEQ ID NO 5 (LE)、SEQ ID NO :6(P34)、SEQ ID NO 7 (GBP) 和SEQ ID NO=S(SMP)中的上游調(diào)控序列的3'末端的部分分別包含5' UTR序列。3' UTR(或〃 3' TED〃或〃終止子〃)TED可源于例如編碼植物貯藏蛋白例如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、01、1^、？；34、68 或5]\^的1111 離的3'區(qū)。這樣的3' TED可 始于終止密碼子或其附近并且包括下游(3‘)的連續(xù)核苷酸。3' TED可以是至少大約10、 25、40、50、75、100、150個(gè)核苷酸或至少大約250個(gè)核苷酸或至少大約500個(gè)核苷酸。雖然 確切長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定和優(yōu)化終止子長(zhǎng)度 (例如，通過測(cè)量和比較翻譯水平)。在一個(gè)實(shí)施方案中，終止子序列選自SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQID NO: 19、SEQ ID NO :20 禾口 SEQ ID N0:21。這些序列分別代表大豆球蛋白、可選擇的大豆球蛋白終止子序列、β伴大豆球蛋 白、可選擇的β伴大豆球蛋白終止子序列、KTI、LE、P 34、GBP和SMP的3' TED序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，終止子序列可以與SEQ ID NO 13-21之一具有至少80 %、 85%,90%,95%,97%,99. 5%或更高的核酸同一性。在另外的實(shí)施方案中，嵌合構(gòu)建體還可包含遠(yuǎn)在目的基因的上游或下游的基因調(diào) 控序列例如增強(qiáng)子序列。例如，轉(zhuǎn)錄“增強(qiáng)子”區(qū)域可遠(yuǎn)在目的基因的上游或下游。例如， 增強(qiáng)子區(qū)域可距序列的5'(上游)末端1，000-2, 000個(gè)核苷酸或甚至1個(gè)或更多個(gè)1Λ， 或也可存在于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)的下游1，000-2，000個(gè)核苷酸或甚至1個(gè)或更多個(gè)1Λ的位置。 因此，在一些實(shí)施方案中，植物貯藏蛋白例如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP 和SMP的此類更遠(yuǎn)的增強(qiáng)子序列也存在于嵌合序列中。在某些實(shí)施方案中，此類增強(qiáng)子序 列的存在增加在種子中產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是內(nèi)膜系統(tǒng)(真核生物中高度保守的系統(tǒng))的一部分。將蛋 白質(zhì)靶向ER是非常有益的，因?yàn)镋R中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被運(yùn)輸至其他細(xì)胞器并且也與ER本身 保持結(jié)合。ER衍生的區(qū)室具有不同的功能，例如貯藏蛋白、油以及用于響應(yīng)病原體攻擊的水 解酶。貯藏蛋白運(yùn)輸至ER的機(jī)制的日益增加的知識(shí)已導(dǎo)致植物用作蛋白質(zhì)生物工廠的用 途的改進(jìn)。除了其他內(nèi)膜區(qū)室外，植物還可在ER中貯藏外源蛋白質(zhì)。ER衍生的小泡-蛋白質(zhì)體對(duì)蛋白質(zhì)貯藏液泡圖1顯示導(dǎo)致蛋白質(zhì)在大豆種子的蛋白質(zhì)體或蛋白質(zhì)貯藏液泡中的定位的不 同亞細(xì)胞蛋白質(zhì)運(yùn)輸途徑的示意圖。在許多植物物種中，但非大豆中，ER衍生的PB允 許非糖基化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定積累，因?yàn)樗龅鞍踪|(zhì)不遵循從ER至高爾基體，然后至前液泡 (prevacuole)的典型內(nèi)膜途徑。相比之下，在WT大豆植物中，大多數(shù)種子蛋白在蛋白質(zhì)貯藏液泡(PSV)中積累。然 而，被靶向大豆種子的蛋白質(zhì)貯藏液泡(PSV)或前液泡(其然后靶向PSV)的蛋白質(zhì)很可能 被快速降解，因?yàn)橐号萃ǔ０S多裂解酶。相反地，如本文中關(guān)于轉(zhuǎn)基因大豆種子所公開的，使用C末端ER靶向序列(KDEL) 的蛋白質(zhì)的ER滯留時(shí)間誘導(dǎo)大量外源蛋白質(zhì)運(yùn)輸至從頭產(chǎn)生的PB。因此，可將蛋白質(zhì)扣 留在大豆種子的ER衍生的PB中。所獲得的蛋白質(zhì)體是保持通過種子成熟并且保留在干燥 成熟種子中的穩(wěn)定的細(xì)胞器群體。在本文中這一點(diǎn)可利用27kDa報(bào)告蛋白綠色熒光蛋白 (GFP-kdel)來證明，如實(shí)施例9中顯示的。在本發(fā)明的任選實(shí)施方案中，異源序列還包含誘導(dǎo)異源多肽在ER或ER衍生的小 泡的腔中積累的ER滯留序列。此類ER或ER衍生的小泡包括ER、PB、PSV、轉(zhuǎn)運(yùn)小泡等。此類小泡在結(jié)構(gòu)上可被鑒定為包含膜(例如脂雙層膜)、腔，其中靶蛋白是至少部分存在于腔 中的可溶性或不溶性成分。不期望受理論束縛，據(jù)信目的蛋白質(zhì)的ER或ER衍生的小泡定 位是在根據(jù)本發(fā)明的植物中產(chǎn)生的高水平的異源蛋白質(zhì)的部分原因。在一個(gè)實(shí)施方案中， 異源多肽在高爾基體或高爾基小泡中積累。ER信號(hào)序列在一些實(shí)施方案中，異源多核苷酸包含ER信號(hào)序列。ER信號(hào)序列是編碼允許蛋白 質(zhì)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的信號(hào)識(shí)別顆粒識(shí)別(從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位至ER腔內(nèi))的氨基酸序列的任 何多核苷酸序列。該序列通常存在于蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，可向天然不具有ER靶向序列的蛋白質(zhì)添加ER信號(hào)序列。然 而，異源蛋白質(zhì)可能已具有ER信號(hào)序列。需要時(shí)，該信號(hào)序列可用另一種ER信號(hào)序列例 如下面表1中所示的那些替代?？蛇x擇地，可使用蛋白質(zhì)的原始信號(hào)序列。還可使用完 全合成的信號(hào)序列。指導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)至植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列的實(shí)例包括來 自大麥凝集素(Dombrowski等人，1993，Plant Cell 5 :587-596)、大麥液泡巰基蛋白酶 (aleurain) (Holwerda 等)κ, 1992, Plant Cell 4 :307-318) >W sporamin(Matsuoka 等 K, 1991, Proc. Natl. Acad. SciUSA 88 :834-838) > patatin (Sonnewald 等 K, 1991, Plant J. 1 :95-106)、大豆?fàn)I養(yǎng) C藏蛋白(Mason 等人，1988，Plant Mol. Biol. 11 :845-856)和 β -果糖苷酶(Faye 等人· 1989，Plant Physiol. 89 :845-851)的序列。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定有用的ER信號(hào)序列，但其他實(shí)例示于表1 :表 權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，其包含a.一種或多種種子貯藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源種子貯藏蛋白相對(duì)于野生 型植物的所述貯藏蛋白減少至少50% ；和b.異源多核苷酸，其包含種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱讀框，所述開放閱讀框包含ER 信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)；其中所述開放閱讀框可操作地連接至所 述種子貯藏蛋白啟動(dòng)子；和其中所述轉(zhuǎn)基因植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述異源多核苷酸還包含5'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域和 /或3'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述ER滯留序列誘導(dǎo)異源蛋白質(zhì)在ER或ER衍生的 小泡的腔中積累。
4.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述雙子葉植物是豆科，和任選地豆目，和任選地大 豆屬(soya genus)的成員。
5.權(quán)利要求4的雙子葉植物，其中所述雙子葉植物是大豆屬(Glycinegenus)的成員。
6.權(quán)利要求5的雙子葉植物，其中所述雙子葉植物是大豆。
7.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述啟動(dòng)子源自Kimitz胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集 素、免疫顯性大豆變應(yīng)原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、種子成熟蛋白、大豆球蛋白 或伴大豆球蛋白。
8.權(quán)利要求2的雙子葉植物，其中所述翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域源自Kimitz胰蛋白酶抑制 劑、大豆凝集素、免疫顯性大豆變應(yīng)原PM或Gly mBd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、種子成熟蛋 白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。
9.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中缺乏的貯藏蛋白是Kimitz胰蛋白酶抑制劑、大豆凝 集素、免疫顯性大豆變應(yīng)原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖結(jié)合蛋白、種子成熟蛋白、大豆球蛋 白或伴大豆球蛋白中的一種或多種。
10.權(quán)利要求9的雙子葉植物，其中所述雙子葉植物種子具有種子內(nèi)源貯藏蛋白的多 于75%的缺乏。
11.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其還包含5'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域和3'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu) 域，并且其中所述啟動(dòng)子以及所述3'和5'翻譯增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域源自相同的貯藏蛋白。
12.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述異源蛋白質(zhì)在雙子葉植物的種子中積累至大 于大約2%或大于大約4%或大于大約5%的種子總干重的水平。
13.權(quán)利要求1的雙子葉植物的種子。
14.獲自權(quán)利要求13的種子的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)，其中所述異源蛋白質(zhì)已被純化。
16.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中靶蛋白編碼序列編碼酶或其片段。
17.權(quán)利要求16的雙子葉植物，其中所述酶是纖維素分解酶。
18.權(quán)利要求17的雙子葉植物，其中所述纖維素分解酶源自真菌來源、細(xì)菌來源、動(dòng)物 來源或植物來源。
19.權(quán)利要求17的雙子葉植物，其中所述纖維素分解酶是β-葡糖苷酶、外切葡聚糖酶 1、外切葡聚糖酶II、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、半纖維素酶、木質(zhì)酶、木質(zhì)素過氧化物酶或錳過氧化物酶。
20.包含權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。
21.包含權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)的商業(yè)上有用的酶組合物。
22.權(quán)利要求1的雙子葉植物，其中所述一種或多種種子貯藏蛋白的缺乏由編碼種子 貯藏蛋白的核酸的RNAi、反義或有義片段的存在而引起。
23.一種轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，其包含a.一種或多種內(nèi)源植物貯藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏導(dǎo)致所述內(nèi)源植物貯藏蛋白相 對(duì)于野生型植物減少至少50% ；和b.異源多核苷酸，其包含可操作地連接至開放閱讀框的補(bǔ)償?shù)鞍椎幕蛘{(diào)控區(qū)，所述 開放閱讀框編碼包含ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)的序列；其中所述轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。
24.在使用前穩(wěn)定地貯存酶的方法，其通過將所述酶貯存在來自轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的 種子中，所述轉(zhuǎn)基因雙子葉植物包括a.一種或多種植物貯藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏導(dǎo)致內(nèi)源種子蛋白減少至少50% ；和b.異源多核苷酸，其包含種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱讀框，所述開放閱讀框包含編碼 ER信號(hào)序列、目的酶和ER滯留信號(hào)的核酸；其中所述開放閱讀框可操作地連接至種子貯藏 蛋白啟動(dòng)子；和其中所述轉(zhuǎn)基因植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生所述酶；和 將所述酶貯存在所述轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的種子中。
25.在雙子葉植物中產(chǎn)生增加量的異源蛋白質(zhì)的方法，其包括a.用多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多核苷酸包含種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱 讀框，所述開放閱讀框包含ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)；其中所述 開放閱讀框可操作地連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子；b.從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞獲得純合植物品系；c.將所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物品系種質(zhì)滲入至缺乏內(nèi)源種子貯藏蛋白的植物，其中所述缺 乏導(dǎo)致所述內(nèi)源種子貯藏蛋白相對(duì)于野生型植物的所述貯藏蛋白減少至少50% ；d.培養(yǎng)所述種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子；和e.從所述種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子獲得異源蛋白質(zhì)，其中所述種質(zhì)滲入的轉(zhuǎn)基因植物的種子能夠以大于5%的種子總干重的水平產(chǎn)生異源 蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述內(nèi)源種子貯藏蛋白的缺乏因編碼種子貯藏蛋白的核 酸的RNAi、反義或有義片段的存在而引起。
27.在雙子葉植物中產(chǎn)生增加量的異源蛋白質(zhì)的方法，其包括a.用多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多核苷酸包含種子貯藏蛋白啟動(dòng)子、開放閱 讀框，所述開放閱讀框包含ER信號(hào)序列、期望的蛋白質(zhì)編碼序列和ER滯留信號(hào)；其中所述 開放閱讀框可操作地連接至種子貯藏蛋白啟動(dòng)子；其中所述多核苷酸還包含能夠下調(diào)內(nèi)源 種子貯藏蛋白的RNAi序列；b.從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞獲得純合植物品系； C.培養(yǎng)所述純合植物品系的種子；和 d.從所述純合植物的種子獲得異源蛋白質(zhì)。
全文摘要
缺乏一種或多種植物種子貯藏蛋白的轉(zhuǎn)基因雙子葉植物，其還包含轉(zhuǎn)基因多核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含可操作地連接至貯藏蛋白啟動(dòng)子和ER信號(hào)序列的開放閱讀框。多核苷酸構(gòu)建體編碼可以以高水平在種子中積累的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。還提供了在植物種子中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102137932SQ200980133087
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月28日
發(fā)明者E·M·赫曼, M·A·施密特 申請(qǐng)人:(由農(nóng)業(yè)部部長(zhǎng)代表的)美利堅(jiān)合眾國(guó), 唐納德丹福斯種植科學(xué)中心