專利名稱：用于在平面基底上進(jìn)行細(xì)胞附著和培養(yǎng)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞在缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層的平面基底上生長、擴(kuò)增和分化的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)是生命與健康科學(xué)中許多方法之一。涉及貼壁依賴性細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)制成，其經(jīng)常需要額外的表面處理以使得細(xì)胞能貼附至容器表面。這樣的處理可包括在表面施加吸附層，例如， 通過吸附、接枝或等離子體聚合技術(shù)施加。作為另外一種選擇，表面處理可借助于容器表面自身的化學(xué)改性，其可通過(例如)大氣華、射頻真空等離子體、直流輝光放電和微波等離子體處理等實現(xiàn)。目前培養(yǎng)多能干細(xì)胞、尤其是胚胎干(EQ細(xì)胞的方法要求復(fù)雜的培養(yǎng)條件，例如，在具有飼養(yǎng)細(xì)胞層的固體基底表面上或在具有胞外基質(zhì)蛋白的吸附層的固體基底表面上培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。采用這些方法的培養(yǎng)體系通常使用飼養(yǎng)細(xì)胞或胞外基質(zhì)蛋白，這些飼養(yǎng)細(xì)胞或胞外基質(zhì)蛋白取自與培養(yǎng)中的干細(xì)胞的物種不同的物種(異種材料)?？蓪⑼ㄟ^暴露于飼養(yǎng)細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基(即經(jīng)未分化的ES細(xì)胞之外的細(xì)胞調(diào)理過的培養(yǎng)基)用于培養(yǎng)ES細(xì)胞，并且可在培養(yǎng)基中補(bǔ)充動物血清。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol. 18 :399-404,2000)和 Thompson 等人 (Science 282 :1145-1147,1998)公開了用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層來培養(yǎng)取自人胚泡的ES細(xì)胞系。又如，Xu等人(NatureBiotechnology 19 :971-974,2001)公開了使用MATRIGEL 和層粘連蛋白處理固體基底表面，然后在不發(fā)生分化的情況下對人ES細(xì)胞進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。又如，Vallier等人(J. Cell Sci. 118 =4495-4509,2005)公開了使用胎牛血清處理固體基底表面，然后在無分化的情況下對人ES細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。又如，W02005014799公開了一種用于哺乳動物細(xì)胞的維持、增殖和分化的調(diào)理過的培養(yǎng)基。W02005014799聲稱“通過鼠細(xì)胞、尤其是那些分化的和永生化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞 (稱為MMH(Met鼠肝細(xì)胞))的細(xì)胞分泌活性調(diào)理根據(jù)本發(fā)明制備的培養(yǎng)基”。又如，Wanatabe等人(Nature Biotechnol. 35 :681-686,2007)聲稱“ROCK 抑制劑使得分離的人胚胎干細(xì)胞能成活”，并且證實減少了解離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加了克隆效率 (從大約增加到大約27%)和基因轉(zhuǎn)移后的亞克隆的便捷性，該方法使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用膠原和MATRIGEL 作為胞外基質(zhì)蛋白，使用Y-27632或法舒地爾 (Fasudil)抑制R0CK。此外，用Y-27632處理過的解離的人ES細(xì)胞可避免在無血清懸浮培養(yǎng)中發(fā)生凋亡。
又如，Peerani等人(EMBO Journal 26 :4744_4755，2007)描述“人胚胎干細(xì)胞(hESC)培養(yǎng)物中的空間組織的復(fù)雜性產(chǎn)生影響hESC命運的異質(zhì)微環(huán)境(小生境 (niche))。本研究證實可通過改造hESC小生境特性來控制hESC的分化速率和分化軌跡。 小生境的大小和組成可調(diào)節(jié)分化誘導(dǎo)因子和抑制因子之間的平衡。從機(jī)制上來講，Smadl信號傳導(dǎo)的小生境大小依賴空間梯度是由于hESC和hESC來源的胚外內(nèi)胚層(ExE)之間的拮抗相互作用產(chǎn)生。這些相互作用由骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (BMP》的ExE定位分泌及其拮抗劑生長分化因子3 (GDF3)的hESC定位分泌介導(dǎo)。對用⑶F3、BMP2和Smadl的小干擾RNA (siRNA) 以及Mio相關(guān)激酶(ROCK)抑制劑處理過的hESC進(jìn)行微圖型化證明，對Smadl激活的獨立控制可挽救hESC的集落大小依賴性分化。我們的結(jié)果首次闡明了 Smadl在空間信息的空間整合和hESC自我更新和分化的小生境大小依賴性控制中的作用”。又如，Koyanagi,M 等人(J Neurosci Res. 200 年 2 月 1 日；86 (2) :270-80)聲稱 “Iih0-GTP酶涉及許多細(xì)胞類型(包括神經(jīng)元)的細(xì)胞凋亡，但是其作用機(jī)理未被充分理解。，，在此，我們研究了 Mio和ROCK在胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)元前體細(xì)胞移植期間發(fā)生的細(xì)胞凋亡中的作用。我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元前體細(xì)胞的離解可激活Mio并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用他0 抑制劑C3胞外酶和/或ROCK抑制劑Y-27632進(jìn)行處理可將解離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(失巢凋亡)降低20%-30%的量。細(xì)胞膜起泡(細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)標(biāo)志)；半胱天冬酶-3的裂解和細(xì)胞色素c從線粒體釋放也由于ROCK抑制而減少。這些結(jié)果表明神經(jīng)元前體細(xì)胞的離解可引起細(xì)胞死亡的內(nèi)源性通路，其至少部分地由Mio/ROCK通路介導(dǎo)。此外，在動物移植模型中，Mio和/或ROCK的抑制可減少移植細(xì)胞的急性細(xì)胞凋亡。移植后，腫瘤壞死因子α和神經(jīng)生長因子前體在移植物周圍高度表達(dá)。ROCK抑制也可減少由這些炎性細(xì)胞因子促進(jìn)的細(xì)胞凋亡。合在一起，這些結(jié)果表明Mio/ROCK信號傳導(dǎo)的抑制可改善細(xì)胞替代療法中移植細(xì)胞的存活。使用異種材料可能不適用于采用多能干細(xì)胞的某些應(yīng)用。可使用替代材料。例如， Mojkovic等人(Stem Cells 23 =895-902,2005)公開了使用人血清處理固體基底表面，然后在不發(fā)生分化的情況下對人ES細(xì)胞進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。一種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)采用補(bǔ)充有能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長因子的無血
清培養(yǎng)基。例如，Cheon等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ；2005 年 10
月19日)公開了一種無飼養(yǎng)細(xì)胞、無血清的培養(yǎng)體系，其中ES細(xì)胞維持于補(bǔ)充有能夠引發(fā) ES細(xì)胞自我更新的不同生長因子的未經(jīng)調(diào)理的血清置換培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開了用于在不含成纖維細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下使用補(bǔ)充有堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人ES細(xì)胞的方法。又如，US20050148070公開了在無血清、無成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)的已知成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人ES細(xì)胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清，并含有至少約lOOng/ml的能夠激活FGF信號傳導(dǎo)受體的FGF，其中所述生長因子由來自除了單獨的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之外的來源提供，所述培養(yǎng)基支持在無飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下干細(xì)胞以不分化的狀態(tài)增殖。
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又如，US20050233446公開了一種可用于培養(yǎng)干細(xì)胞的已知成分的培養(yǎng)基，所述干細(xì)胞包括未分化的靈長類原始干細(xì)胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與被培養(yǎng)的干細(xì)胞基本上等滲。 在給定培養(yǎng)物中，具體的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及各一定量的堿性FGF、胰島素和抗壞血酸，這些成分對于支持原始干細(xì)胞的基本上未分化的生長是必需的。又如，US6800480聲稱“在一個實施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)培養(yǎng)靈長類來源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內(nèi)毒素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基可有效支持靈長類來源的原始干細(xì)胞的生長。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基與可有效支持源于靈長類的原始干細(xì)胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細(xì)胞和衍生自飼養(yǎng)細(xì)胞的胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)相混合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。又如，US20050244962聲稱“在一個方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)靈長類胚胎干細(xì)胞的方法?？稍诨旧蠠o哺乳動物胎兒血清(優(yōu)選還基本上無任何動物血清)的培養(yǎng)物中且在存在成纖維細(xì)胞生長因子的情況下培養(yǎng)所述干細(xì)胞，該成纖維細(xì)胞生長因子由除了單獨的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層外的來源提供。在優(yōu)選的形式中，通過添加足量的成纖維細(xì)胞生長因子，使得之前為維持干細(xì)胞培養(yǎng)物所需的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層變?yōu)榉潜匦璧摹薄Ｓ秩?，W020050653M公開了一種基本上無飼養(yǎng)細(xì)胞和無血清的成分確定的等滲培養(yǎng)基，其包含a.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b. —定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；c. 一定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的胰島素；和d. —定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的抗壞血酸。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGFi3)蛋白家族的成員、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持所述細(xì)胞處于未分化狀態(tài)達(dá)足以實現(xiàn)所需結(jié)果的一段時間。多能干細(xì)胞為研究和藥物篩選提供潛在資源。目前，人ES細(xì)胞系的大規(guī)模培養(yǎng)是困難的，并且?guī)砹藝?yán)峻挑戰(zhàn)。針對這些挑戰(zhàn)的可能解決方案是以單細(xì)胞形式傳代和培養(yǎng)人ES細(xì)胞。單細(xì)胞更適合標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)，例如，計數(shù)、轉(zhuǎn)染等等。例如，Nicolas等人提供了一種用于從單細(xì)胞生產(chǎn)和擴(kuò)增人ES細(xì)胞系的方法， 所述單細(xì)胞已通過慢病毒載體進(jìn)行遺傳修飾，然后通過熒光激活細(xì)胞分選來分離Gtem Cells Dev. 16 :109-118,2007)。又如，美國專利申請US2005158852公開了一種“用于改善單個人胚胎干細(xì)胞的生長和存活的方法。該方法包括如下步驟獲得未分化的單hES細(xì)胞；將該未分化的單細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)混合；以及將該混合物接種至飼養(yǎng)細(xì)胞上，其中在生長環(huán)境中具有營養(yǎng)介質(zhì)?！庇秩?，Sidhu等人(Stem Cells Dev. 15 =61-69,2006)描述了對三種衍生自親本系 hES3的人ES細(xì)胞克隆hES 3. 1、3.2和3.3的首次報道，所述克隆是通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞制備物的分選而得到。然而，人ES細(xì)胞作為單細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)會導(dǎo)致遺傳異常和多潛能性喪失。培養(yǎng)條件對于多潛能性和遺傳穩(wěn)定性的保持是重要的。通常，通過人工或用酶學(xué)試劑(例如膠原酶、釋放酶(Iiberase)或分散酶(dispase))進(jìn)行人ES細(xì)胞系的傳代。例如，Draper等人指出了“在五種獨立的情形下，三種獨立的人胚胎干細(xì)胞系中涉及染色體17q的獲得的核型改變”的存在(Nature Biotechnol. 22 =53-54,2004)。
又如，Buzzard等人聲稱，“我們僅曾經(jīng)檢測到一個核型改變事件…考慮到我們的方法與大部分其他研究組所用的方法完全不同，所用的培養(yǎng)方法可能對我們的結(jié)果有一些影響。通常我們在7天后通過首先用破碎的移液管邊緣分離集落來對人ES細(xì)胞進(jìn)行傳代…在該方法中并未采用酶學(xué)細(xì)胞解離方法或化學(xué)細(xì)胞解離方法。我們推測這可解釋我們擁有的hES(人ES)細(xì)胞的相對細(xì)胞遺傳復(fù)原能力(cytogenetic resilience)/' (Nature Biotechnol. 22 :381-382,2004)。又如，Mitalipova等人聲稱“批量傳代方法…在長期傳代后能在培養(yǎng)物中保持非整倍性細(xì)胞群，但可用于較短的周期(最高至至少15次傳代)而無核型異?！锌赡茉陂L期人工增殖條件下，隨后在要求比人工傳代方法單獨能夠提供的數(shù)量更多的hES細(xì)胞的實驗中進(jìn)行有限的批量傳代后，保持hES細(xì)胞中的正常核型。” (Nature Biotechnol. 23 19-20,2005)。又如，Heng等人聲稱“結(jié)果證明第二個方案(伴隨輕輕抽吸進(jìn)行胰蛋白酶消化) 比第一個方案(伴隨刮擦進(jìn)行膠原酶處理)對細(xì)胞活力的危害更小。這繼而轉(zhuǎn)化為更高的凍融存活率，，。(Biotechnology and Applied Biochemistry 47 :33-37, 2007)。又如，Hasegawa等人聲稱“我們已建立了能耐受完全解離的hESC亞系。這些細(xì)胞顯示具有高的再次平板接種(relating)的效率和高克隆效率，并且它們保持分化成三個胚層的能力”。(Stem Cells 24 :2649-2660,2006) 又如，美國專利申請61/030，544提供了用于細(xì)胞附著至固體基底表面上、在其上培養(yǎng)細(xì)胞和從其上使細(xì)胞脫落的方法和組合物，所述基底表面含有至少約0. 9%的氮至約 11%的氮以及至少約12%的氧至至少約30%的氧并且不含吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施例中，用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理細(xì)胞。明顯需要用于在缺少飼養(yǎng)細(xì)胞和吸附層，同時保持細(xì)胞的多潛能性的情況下培養(yǎng)細(xì)胞(包括多能干細(xì)胞)的方法和組合物。本發(fā)明提供了用于在不缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層的平面基底上生長、擴(kuò)增和分化多能干細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞不需要用能夠抑制Mio 激酶活性的化合物處理以粘結(jié)至所述平面基底。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種使多能干細(xì)胞在平面基底上附著、培養(yǎng)和分化的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層。


圖1示出了 Iih0激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細(xì)胞系Hl附著至平面基底的影響。 分圖a)示出了混合纖維素酯膜(表1中的2號膜)上的細(xì)胞附著。分圖b)示出了尼龍膜(表1中的4號膜)上的細(xì)胞附著。分圖c)示出了乙酸纖維素膜(表1中的5號膜) 上的細(xì)胞附著。分圖d)示出了聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)上的細(xì)胞附著。分圖e): 示出了聚對苯二甲酸乙二醇酯膜(表1中的12號膜)上的細(xì)胞附著。圖2 示出了他0激酶抑制劑Y-26732對人胚胎干細(xì)胞系H9附著至混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細(xì)胞附著。分圖b)示出了用ΙΟμΜ的Y46732處理過的細(xì)胞的細(xì)胞附著。分圖c)示出了用20 μ M的Υ46732處理過的細(xì)胞的細(xì)胞附著。圖3 示出了在MATRIGEL 涂覆表面上的人胚胎干細(xì)胞系Hl的增殖曲線(實線) 和混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)上的人胚胎干細(xì)胞系Hl的增殖曲線(虛線)。圖4 示出了細(xì)胞系Hl的人胚胎干細(xì)胞中代表性細(xì)胞的G顯帶染色體。分圖a) 示出了在MATRIGEL 涂覆表面上培養(yǎng)10代的細(xì)胞的染色體。分圖b)示出了在混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)上培養(yǎng)10代的細(xì)胞的染色體。圖5 示出了他0激酶抑制劑Y26732對人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞附著于聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細(xì)胞附著。分圖b)示出了用10 μ M的Υ-26732處理之后的細(xì)胞附著。分圖c)示出了用20 μ M的Υ-26732處理之后的細(xì)胞附著。圖6 示出了他0激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞附著于聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細(xì)胞附著。分圖b)示出了當(dāng)將0.03μΜ的H-1152添加至培養(yǎng)基時的細(xì)胞附著。分圖c)示出了當(dāng)將0. 1 μ M的H-1152 添加至培養(yǎng)基時的細(xì)胞附著。分圖d)示出了當(dāng)將0.3μΜ的H-1152添加至培養(yǎng)基時的細(xì)胞附著。分圖e)示出了當(dāng)將IyM的H-1152添加至培養(yǎng)基中時的細(xì)胞附著。分圖f)示出了當(dāng)將3 μ M的Η-1152添加至培養(yǎng)基時的細(xì)胞附著。圖7示出了從細(xì)胞培養(yǎng)基除去Mio激酶抑制劑Η-1152之后人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞與聚碳酸酯膜(表1中的9號膜)的脫離。分圖a)示出了在培養(yǎng)基中保持3μ M的 Η-1152時細(xì)胞的附著。分圖b)示出了當(dāng)從培養(yǎng)基除去H-1152時細(xì)胞的脫離。圖8示出了膜孔徑和Iih0激酶抑制劑處理對人胚胎干細(xì)胞系Hl附著至平面基底的影響，所述平面基底包括如下在分圖a和c中為表1中的10號聚碳酸酯膜；在分圖b和 d中為表1中的11號聚碳酸酯膜。分圖a和b)示出了當(dāng)在培養(yǎng)基中保持3μΜ的H-1152 時細(xì)胞的附著。分圖c和d)示出了當(dāng)從培養(yǎng)基除去H-1152時細(xì)胞的脫離。圖9示出了聚碳酸酯膜(表1中的8號膜)上培養(yǎng)3代的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞中的多潛能性相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)的維持。附圖中指出的基因的表達(dá)是通過實時PCR來確定。實心條柱表示從未分化的人胚胎干細(xì)胞系Hl得到的數(shù)據(jù)。帶斜條紋的條柱表示從聚碳酸酯膜上培養(yǎng)的細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)。圖10示出了在聚碳酸酯膜(表1中的8號膜)上培養(yǎng)12代后人胚胎干細(xì)胞系Hl 的細(xì)胞形成胚狀體的能力。附圖示出來自單個實驗的代表性數(shù)據(jù)。圖11示出了本發(fā)明的平面基底的掃描電子顯微圖。圖12示出了 ULTRAWEB 平面基底的掃描電子顯微圖。圖13示出了成分確定的培養(yǎng)基mTESR 對人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞粘結(jié)至多種平面基底的影響。
具體實施例方式將本發(fā)明的具體實施方式
部分分成以下幾個分部分，來描述或說明本發(fā)明的某些特征、實施例或應(yīng)用，這是為了使公開內(nèi)容清楚起見，并非限制本發(fā)明。定義
本文所用的“吸附層”指固體基底表面上通過共價鍵(也稱為接枝)或非共價鍵 (也稱為吸附)將分子連接至表面上而形成的一層。用于制備吸附層的分子可以為(例如) 蛋白質(zhì)性分子，其可包括(例如)胞外基質(zhì)蛋白、氨基酸等，還可以為非生物分子，例如，聚乙烯亞胺?！?β -細(xì)胞譜系”指對于轉(zhuǎn)錄因子PDX-I和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種具有陽性基因表達(dá)的細(xì)胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. 1、NEUROD、ISLl、HNF_3 β、MAFA、PAX4 或 ΡΑ)(6。表達(dá) β 細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。本文所用的“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞S0X17、GATA4、HNF3 β、GSC、CERl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix 樣同源盒蛋白、 FGF4 CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、C)(CR4、C-Kit、CD99 或 0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。本文所用的“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、NKX6. 1或HB9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞、原腸管細(xì)胞和后前腸細(xì)胞。本文所用的“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)志物HNF3i3、GATA4、 S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。本文所用的“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”指能夠表達(dá)至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。本文所用的“胚外內(nèi)胚層”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞群S0X7、AFP或 SPARC。“胞外基質(zhì)蛋白”指通常在體內(nèi)或在胎盤內(nèi)的細(xì)胞間存在的蛋白質(zhì)性分子。胞外基質(zhì)蛋白可來自組織、體液(如血液)或通過非重組細(xì)胞或重組細(xì)胞或細(xì)菌調(diào)理過的培養(yǎng)基。本文所用的“標(biāo)志物”是在所關(guān)注的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。在該語境中，差異表達(dá)意指陽性標(biāo)志物的水平增加，而陰性標(biāo)志物的水平降低。與其他細(xì)胞相比， 所關(guān)注的細(xì)胞中標(biāo)志核酸或多肽的可檢測水平足夠高或足夠低，使得可使用多種本領(lǐng)域公知的方法中的任何一種鑒定所關(guān)注的細(xì)胞與將其與其他細(xì)胞區(qū)分開來。本文所用的“中內(nèi)胚層細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、S0X-17、DKK4、HNF3 β、GSC、FGF17 或 GATA6。本文所用的“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種以下激素的細(xì)胞胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。本文所用的“前原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)志物的細(xì)胞=Nodal或FGF8。本文所用的“原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)志物的細(xì)胞BraChyury、MiX-like 同源盒蛋白或FGF4。干細(xì)胞是由它們在單細(xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞以及移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話)
8組織形成的能力。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類型；( 多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類型；C3)多能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生所有的細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生的后代細(xì)胞包括HSC(自我更新)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì)胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更具限制性的細(xì)胞譜系亞群；以及( 單能，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過程。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語“定向的”當(dāng)應(yīng)用到分化的過程時，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞在正常環(huán)境下，它會繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類型或回復(fù)到分化程度較低的細(xì)胞類型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)程度較低的地位的過程。本文所用的“細(xì)胞的譜系”限定了細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物是指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞表型特異性相關(guān)并能夠用于評價非定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化的特征。本文所用的“表面”指旨在用于細(xì)胞培養(yǎng)或分析的固體基底容器或基質(zhì)的最外面的分子層?？煞謩e用X射線光電子能譜(XPQ、原子力顯微鏡(AFM)和接觸角測量法來分析表面的元素組成、粗糙度和潤濕性。有多個術(shù)語用來描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！熬S持”通常指將細(xì)胞在有利于細(xì)胞生長和/ 或分裂的條件下置于培養(yǎng)基中，這有可能或可能不導(dǎo)致產(chǎn)生更大的細(xì)胞群體。“傳代”指將細(xì)胞從一個培養(yǎng)容器移出并將它們在有利于細(xì)胞生長和/或分裂的條件下置于第二培養(yǎng)容器中的過程。細(xì)胞的特定群體或細(xì)胞系，有時由它已被傳代的次數(shù)來指稱或表征。例如，已被傳代十次的培養(yǎng)細(xì)胞群體可稱為Pio培養(yǎng)物。首次培養(yǎng)物(S卩，在將細(xì)胞從組織分離后的第一次培養(yǎng)物)被指定為Po。在第一次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為次代培養(yǎng)物(Pl或第1代)。 在第二次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三代培養(yǎng)物(P2或第2代)，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在傳代期間可能有多次群體倍增；因此培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)目大于傳代數(shù)目。細(xì)胞在各次傳代之間的期間中的擴(kuò)增(即群體倍增數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基底、培養(yǎng)基、生長條件和各次傳代之間的時間。本發(fā)明的平面基底適用于本發(fā)明的平面基底可由能夠提供多能細(xì)胞可附著其上的支撐物的任何材料構(gòu)成。例如，平面基底可由聚碳酸酯構(gòu)成?；蛘?，平面基底可由聚對苯二甲酸乙二醇酯 (PETE)構(gòu)成?；蛘?，平面基底可由尼龍構(gòu)成?；蛘?，平面基底可由乙酸纖維素構(gòu)成?；蛘撸?平面基底可由混合纖維素酯構(gòu)成。適用于本發(fā)明的平面基底的例子可見于表1。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種使多能干細(xì)胞在平面基底上附著、培養(yǎng)和分化的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層。含有至少約8%的N至至少約12% 的N和至少約12%的0至至少約55%的氧的平面基底可以是粗糙的纖維表面，或者可以是平滑的表面。在一個實施例中，本發(fā)明提供了使多能干細(xì)胞附著于平面基底的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32 度，并且缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層，所述方法包括如下步驟a.獲得多能干細(xì)胞的懸浮液；以及b.將該細(xì)胞懸浮液添加至所述平面基底并允許細(xì)胞附著。在一個實施例中，將多能干細(xì)胞在附著于表面后進(jìn)行培養(yǎng)。在一個實施例中，使多能干細(xì)胞在附著于表面后在平面基底上分化。在一個實施例中，通過用能夠抑制Iih0激酶活性的物質(zhì)處理多能干細(xì)胞來增強(qiáng)多能干細(xì)胞與平面基底的附著，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層。在細(xì)胞附著后， 可將能抑制Mio激酶活性的化合物從細(xì)胞除去。能抑制Iih0激酶活性的化合物選自Y-27632、法舒地爾、Η-1152和羥基法舒地爾 (Hydroxyfasudil)。在一個實施例中，能抑制他0激酶活性的化合物可在約0. 1 μ M至約100 μ M的濃度下使用。在一個實施例中，能夠抑制Mio激酶活性的至少一種化合物在約10 μ M的濃度下使用。本發(fā)明的平面基底的表征在一個實施例中，本發(fā)明的平面基底表面的元素組成可以由X射線光電子能譜 (XPS)來分析。將XPS(也稱為化學(xué)分析電子能譜(ESCA))用作測定什么元素或原子存在于固體基底表面(可檢測濃度大于0. 1原子百分?jǐn)?shù)的除氫和氦以外的所有元素)和測定這些元素或原子的鍵合環(huán)境的方法。在一個實施例中，本發(fā)明的平面基底表面的粗糙度可通過原子力顯微鏡法(AFM) 來分析?？捎肁FM以低至1人的水平分辨率和低至0.1人的垂直分辨率為表面原子或分子成像。在一個實施例中，可通過測量接觸角來分析本發(fā)明的平面基底表面的潤濕性。例如，使用靜滴法進(jìn)行的接觸角測量可提供固體基底表面和液體表面之間相互作用的信息。 接觸角描述停留在固體基底表面上的液滴的形狀，其為固體基底表面上的液體接觸角，并在液、固和氣三相交界的接觸線處的液體內(nèi)測得。具有大于90°的水接觸角的表面稱為疏水的，具有小于90°的水接觸角的表面稱為親水的。在極其親水的表面，也就是說，對水具有高親和力的表面，小水滴將完全鋪展(有效接觸角為0° )。在一個實施例中，通過測量表面與結(jié)晶紫的反應(yīng)性來分析本發(fā)明的平面基底表面的負(fù)電荷密度。結(jié)晶紫帶有正電荷，使得其能夠結(jié)合到帶負(fù)電的分子和分子部分上，例如， 聚合物表面上的帶負(fù)電的官能團(tuán)。如果表面具有相同的粗糙度和面積，則具有高結(jié)晶紫反應(yīng)性的表面比具有低結(jié)晶紫反應(yīng)性的表面具有更高密度的負(fù)電荷。多能干細(xì)胞多能干細(xì)胞的表征多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特征性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用稱為Tra-1_60和 Tra-1-81的抗體檢測的標(biāo)志物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282 =1145,1998) 多能干細(xì)胞體外分化會導(dǎo)致喪失SSEA-4、Tra-1-60和 ει-1-81的表達(dá)并增加SSEA-I的表達(dá)。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產(chǎn)商所描述的(Vector Laboratories, Burlingame Calif)。未分化的多能干細(xì)胞還通常表達(dá)0CT-4和TERT，這可通過RT-PCR檢測。增殖的多能干細(xì)胞的另一理想表型是分化成所有三個胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的細(xì)胞的潛能?？梢酝ㄟ^如下方式來確定干細(xì)胞的多潛能性例如，將細(xì)胞注射入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4%的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后對其進(jìn)行組織學(xué)檢測，找出來自三個胚層的細(xì)胞類型的證據(jù)。作為另一種選擇，多潛能性可通過這樣來確定產(chǎn)生胚狀體并評價該胚狀體是否存在與三個胚層相關(guān)的標(biāo)志物。增殖的多能干細(xì)胞系可用標(biāo)準(zhǔn)G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析并與公開的相應(yīng)靈長類物種的核型相比較。理想的是獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，“正常核型”的細(xì)胞意指該細(xì)胞是整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有顯著改變。多能干細(xì)胞的來源可使用的多能干細(xì)胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來的確立多能細(xì)胞系，包括在妊娠期間任何時間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常是但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性的例子是已確立的人胚胎干細(xì)胞系或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還可設(shè)想的是，在此類細(xì)胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細(xì)胞將是直接取自源組織的原代多潛能細(xì)胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群體的細(xì)胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens，GA)。 另外合適的是衍生自非多能細(xì)胞例如成人體細(xì)胞的多能干細(xì)胞。在一個實施例中，人胚胎干細(xì)胞是如Thomson等人所述制備(美國專利 No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個實施例中，在按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)之前，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在以多種方式支持多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層或胞外基質(zhì)蛋白上。例如，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在支持多能干細(xì)胞增殖而不進(jìn)行大量分化的飼養(yǎng)細(xì)胞層上。多能干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞層上生長而不分化是利用如下來支持的(i)獲得含有飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)容器；以及(ii)通過先前用另一細(xì)胞類型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基或者(例如)不含血清甚至沒有化學(xué)成分確定的未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基。又如，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞、但支持多能干細(xì)胞增殖而不進(jìn)行大量分化的培養(yǎng)體系中。多能干細(xì)胞在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長而不進(jìn)行分化是利用以下條件來支持的(i)固體基底表面上具有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的吸附層；和 (ii)通過先前用另一細(xì)胞類型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基或者未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基(例如不含血清的培養(yǎng)基或甚至是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)。在一個替代實施例中，將多能干細(xì)胞在通過先前用另一細(xì)胞類型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基或者未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基(例如不含血清的培養(yǎng)基或甚至是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)中，在包括混合纖維素酯的平面表面上培養(yǎng)。培養(yǎng)基適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的例子可見于US20020072117。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于US6642048。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于W02005014799。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于Xu等人(Stem Cells 22:972-980,2004)。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于US20070010011。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于Cheon等人(BioR印rod DOI 10. 1095/ biolr印rod. 105. 046870 ；2005年10月19日)。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個例子可見于Levenstein等人(Stem Cells M :568_574，2006)。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于US20050148070。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于 US20050233446。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于US6800480。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于US20050244962。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于W020050653M。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見于W02005086845。合適的培養(yǎng)基也可以由下列組分制成，例如，Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基 (DMEM) ,Gibco # 11965_092、Knockout Dulbecco 改進(jìn)的 Eagle 培養(yǎng)基(K0 DMEM)、Gibco # 10829-018、Ham' s F12/50% DMEM 基本培養(yǎng)基、200mM L-谷氨酰胺、Gibco # 15039-027、 非必需氨基酸溶液、Gibco 11140-050、β-巰基乙醇、Sigma # M7522、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、Gibco # 13256-029o多能干細(xì)胞的分化在本發(fā)明的一個實施例中，將多能干細(xì)胞在培養(yǎng)中進(jìn)行擴(kuò)增，同時保持它們的多能性?？赏ㄟ^檢測與多能性相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化，來確定細(xì)胞的多能性隨時間的變化?；蛘?，可通過檢測與分化相關(guān)的標(biāo)志物或者與別的細(xì)胞類型相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化來監(jiān)測多能性的變化。在一個替代實施例中，使多能干細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖，然后以可促進(jìn)其分化為另一細(xì)胞類型的方式處理多能干細(xì)胞。別的細(xì)胞類型可以是表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞類型可以是表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞類型可以是表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘撸?xì)胞類型可以是表達(dá)細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域任何合適的方法，使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成多種別的細(xì)胞類型。例如，可使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肝細(xì)胞寸。例如，根據(jù)W02007030870中公開的方法，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。在另一個實例中，可按照美國專利6，458，589中公開的方法，使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541,2005 中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)Shinozaki 等人，Development 131 1651-1662，2004 中公開的方法， 使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
例如，可根據(jù)McLean等人，Stem Cells, 25 =29-38,2007中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541,2005 中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自SOX17、GATA4、HNF3 0、GSC、CERl、Nodal、FGF8、 Brachyury、Mix樣同源盒蛋白、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、 C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為原條前體細(xì)胞。在一個替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。例如，根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401,2006)中公開的方法，多能干細(xì)胞可分化為表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、HB9和PR0X1。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域的任何方法使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 1392-1401，2006 中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 1392-1401，2006 中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自NGN3、NEUR0D、ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4、NGN3 和PTF-I α。在一個實施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰內(nèi)分泌細(xì)胞可為表達(dá)胰激素的細(xì)胞。作為另外一種選擇，胰內(nèi)分泌細(xì)胞可為分泌胰激素的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞可表達(dá)PDXl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子NGN3、 ΝΚΧ2. 2、NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3 β、MAFA、PAX4 禾口 PAX6。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá) β 細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是β細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步通過如下實例舉例說明，但不受限于如下實例。鍾1 人K胎干細(xì)朐,附著于本發(fā)日月的平面基底。他0激酶抑制劑Υ26732已顯示出能增強(qiáng)人胚胎干細(xì)胞在表面改性板上的附著(參見美國專利申請No. 61/030, 544)。本發(fā)明的研究目的在于確定人胚胎干細(xì)胞附著于其它平面表面的能力。表1中示出了本發(fā)明中所測試的平面表面。在測試之前，將人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞中的細(xì)胞在涂覆有低生長因子MATRIGEL 的1 30稀釋液的組織培養(yǎng)板上擴(kuò)增。將細(xì)胞接種至處于補(bǔ)充有20ng/ml bFGF(MEF_CM/bFGF)的IOml MEF調(diào)理培養(yǎng)基中的IOOmm培養(yǎng)皿上。將細(xì)胞在具有5% CO2的濕潤氣氛中于37°C下培養(yǎng)。每天用新鮮的MEF-CM/bFGF更新培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞達(dá)到大約80%的匯合度，通過在37°C下用lmg/ml釋放酶處理5分鐘來將細(xì)胞傳代。通過從培養(yǎng)皿中除去酶并用 MEF-CM/bFGF沖洗細(xì)胞來停止消化。通過在IOml的MEF-CM/bFGF中人工刮下細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至50ml錐形管來收集細(xì)胞。在臺式離心機(jī)上以200Xg(1000rpm)將細(xì)胞離心而形成沉淀。在移除上清液后，將細(xì)胞再次懸浮于40ml的MEF-CM/bFGF中，并且平均分配在4個涂覆有低生長因子MATRIGEL 的1 30稀釋液的IOOmm培養(yǎng)皿中。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞以100，000個細(xì)胞/cm2的密度接種至表1所示的各種平面基底上。這些平面基底缺少吸附層和成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層。如上所述，將細(xì)胞在 MEF-CM/bFGF中培養(yǎng)。測定Iiho激酶抑制劑H-1152對細(xì)胞附著于平面基底的影響。將3 μ M 的Η-1152添加至用于接種細(xì)胞的培養(yǎng)基中。讓細(xì)胞附著M小時。此后，在室溫下用4%的多聚甲醛將細(xì)胞固定5分鐘。然后，用的蘇木精對細(xì)胞進(jìn)行染色，并借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞以不依賴于Mio激酶抑制劑的方式附著于如下膜混合纖維素酯膜O號膜，圖1的分圖a)；尼龍膜G號膜，圖1的分圖b)和乙酸纖維素膜(5 號膜，圖1的分圖c)。添加3μΜ的H-1152增強(qiáng)了細(xì)胞與這些膜的附著(參見圖1的分圖 a~c) ο人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞需要存在3 μ M的H-1152來附著于如下平面基底聚碳酸酯膜(7號膜，圖1的分圖d)和聚對苯二甲酸乙二醇酯膜(12號膜，圖1的分圖e)。從培養(yǎng)基中除去H-1152導(dǎo)致Hl細(xì)胞與這兩種膜都脫離。在不存在H-1152的情況下，沒有發(fā)現(xiàn)與這些膜形成了附著。實例2 =Rho激酶處理對人胚胎干細(xì)胞附著于包含混合纖維素酯的平面基底(1號膜)的影響。在進(jìn)行實驗操作之前，將人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞在MATRIGEL 涂覆的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。將細(xì)胞在MEF調(diào)理培養(yǎng)基中以150，000個細(xì)胞/cm2的密度接種于混合纖維素酯膜 (1號膜)上。所述平面基底缺少吸附層和成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層。檢驗Mio激酶抑制劑處理對附著于平面基底的影響。用0、10或20μΜ的Y26732處理細(xì)胞。在M小時后，將細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風(fēng)干并用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色。借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。觀察到在不存在Υ26732的情況下細(xì)胞附著于平面基底(圖2的分圖a)。添加10 和20 μ M的Υ26732增強(qiáng)了細(xì)胞與平面基底的附著(圖2的分圖b和c)。從培養(yǎng)基除去 Y26732后M小時并沒有導(dǎo)致細(xì)胞與平面基底脫離。割列3 在1號平面某底臘卜.培養(yǎng)對人臺干細(xì)胞,的 曾葙諫率的影口向。將在MATRIGEL 涂覆培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞和在1號膜上培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖速率進(jìn)行比較。將細(xì)胞以相等密度接種在這兩個基底上。通過TrypLE處理使細(xì)胞從基底脫離而形成單細(xì)胞懸浮液以確定細(xì)胞數(shù)目。按圖3中所標(biāo)明的時刻對細(xì)胞進(jìn)行取樣。觀察到細(xì)胞以相當(dāng)?shù)乃俾试鲋?。MATRIGEL 上和1號膜上的倍增時間分別為約1. 151 天和1. 138天。實例4:人胚胎干細(xì)胞在包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上保持其多潛能
14件3代。在含有20ng/ml bFGF的MEF-CM中，將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞以75，000個細(xì)胞/cm2的密度接種于包括混合纖維素酯膜(1號膜)的平面基底上。根據(jù)上述方法，在將細(xì)胞傳代至達(dá)到大約75%至90%匯合度之前將其培養(yǎng)5或6天。每天更新培養(yǎng)基。在培養(yǎng) 3代后，收集細(xì)胞并且通過流式細(xì)胞術(shù)確定多潛能性相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)。如表2中所示， 超過95%的細(xì)胞保持了多潛能性相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物(包括Tral-60、Tral_81、SSEA-3 和SSEA-4)的表達(dá)，從而表明細(xì)胞仍為多潛能性的。實例5:人胚胎干細(xì)胞在包括混合纖維素酯(1號膜)的平面基底上保持穩(wěn)定的核型10代。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞在MATRIGEL 徐覆的培養(yǎng)板上或者在混合纖維素酯膜上培養(yǎng)10代。根據(jù)上述方法培養(yǎng)細(xì)胞。通過分析20個G顯帶中期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析來確定核型。如圖4中所示，MATRIGEL 涂覆培養(yǎng)板上培養(yǎng)的代表性細(xì)胞的G-顯帶染色體(圖4的分圖a)和混合纖維素酯膜上培養(yǎng)的其它細(xì)胞的G-顯帶染色體(圖4的分圖 b)證實了正常的男性染色體核型。還使用采用染色體12p探針和17p探針的熒光原位雜交法(FISH)檢驗200個分裂間期的核來確定核型，以鑒別不能用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測的染色體12和17拷貝數(shù)有改變的非常小的細(xì)胞群體。在MATRIGEL 上和混合纖維素酯膜上培養(yǎng)的細(xì)胞中，未檢測到具有三體型12號染色體和/或17號染色體的異常細(xì)胞。實例6 人胚胎干細(xì)胞能夠在包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上分化成胰島素牛成細(xì)胞。在含有20ng/ml bFGF的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中，將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞以 150，000個細(xì)胞/cm2的密度接種至包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上。通過根據(jù)表 3中列出的分化方案處理細(xì)胞，使細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞分化。將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF 的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至4天，以達(dá)到大約75 %至90 %的匯合度。將細(xì)胞在含有2 %的無脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA)、100ng/Im的激活素A和20ng/ml的Wnt3A的DMEM-F12 培養(yǎng)基中處理2天，然后用DMEM-F12培養(yǎng)基、2%的無脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA)和 100ng/ml的激活素A將細(xì)胞再處理2天。接著，將細(xì)胞在含有2%的BSA、20ng/ml的FGF7和 250nM的環(huán)巴胺-KAAD的DMEF-F12培養(yǎng)基中處理3天，然后在含有1 %的B27補(bǔ)充劑、20ng/ ml的FGF7、250nM的環(huán)巴胺_KAAD、2 μ M的視黃酸(RA)和100ng/ml的成頭蛋白(Noggin) 的DMEM-F12培養(yǎng)基中處理4天。將細(xì)胞在含有1 %的B27補(bǔ)充劑、1 μ M的ALK5抑制劑 2(Axxora產(chǎn)品目錄號ALX-270-445_M001)、100ng/ml的成頭蛋白、100ng/ml的軸突導(dǎo)向因子-4(Netrin-4)、50ng/ml 的 Exendin-4 禾口 1 μ M 的 DAPT 的 DMEM-F12 培養(yǎng)基中處理 3 天。 將細(xì)胞在DMEM-F12培養(yǎng)基、1 %的Β27補(bǔ)充劑和1 μ M的ALK5抑制劑2中培養(yǎng)7天并在含有的Β27補(bǔ)充劑的DMEM-F12培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7天。在分化方案的最后，收集RNA樣本來確定胰內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。觀察到胰島素的CT數(shù)約為17。GAPDH相應(yīng)的CT值約為19 ；這些數(shù)據(jù)表明在處理后細(xì)胞表達(dá)高水平的胰島素。實例7 人胚胎干細(xì)胞以I^h0激酶抑制劑依賴件方式附著于包括聚碳酸酯膜的平
面基底。
在MEF調(diào)理培養(yǎng)基中，將人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞以150，000個細(xì)胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯的平面基底(7號膜)。檢驗Iih0激酶抑制劑處理對附著的影響將 Rho激酶抑制劑Y26732以0、10或20 μ M的濃度添加至培養(yǎng)基。在M小時后，將膜上的細(xì)胞在室溫下用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風(fēng)干、用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色。借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。細(xì)胞沒有附著于對照皿中的膜上(圖5的分圖a)。添加Y26732導(dǎo)致細(xì)胞附著于膜上(圖5的分圖b和c)。在單獨的實驗中，確定了 Iiho激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞附著于 號膜的影響。在含有20ng/ml bFGF的MEF-CM中，將細(xì)胞以150，000個細(xì)胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯膜(7號膜)的平面基底上。將Mio激酶抑制劑H-1152以0、0. 03、 0. 1、0. 3、1和3μ M的濃度添加至培養(yǎng)基。在M小時后，將膜上的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風(fēng)干、用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色。借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。細(xì)胞沒有附著至對照皿中的膜(圖6的分圖a)和具有0. 03或0. 1 μ M的Η-1152 的培養(yǎng)皿中的膜(圖6的分圖b和C)。然而，在用0.3、1和3μΜ的H-1152處理過的培養(yǎng)物中觀察到附著(圖6的分圖d-f)。實例8 從培養(yǎng)基除去I^h0激酶抑制劑導(dǎo)致人胚胎干細(xì)胞從包括聚碳酸酯膜的平面基底脫離。在含有20ng/ml bFGF和3 μ M的I ho激酶抑制劑H-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中，將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞以100，000個細(xì)胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯的平面基底 (9號膜)上。將細(xì)胞培養(yǎng)M小時。此后，用含有20ng/ml bFGF而缺少H-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。在M小時后，將膜上的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風(fēng)干、用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色。借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了含有H-1152的孔作為對照。從培養(yǎng)基中除去H-1152導(dǎo)致細(xì)胞與平面基底脫離(圖7)。勒列9將第42代的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至如下平面基底10號膜(孔徑為 0.4μπι) ;11號膜(孔徑為3μπι)。在含有20ng/ml bFGF的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中，將細(xì)胞以 100, 000個細(xì)胞/cm2的密度接種。還檢驗了 Iih0激酶抑制對細(xì)胞附著于平面基底的影響。 將該細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充3μΜ的H-1152。在對小時后，用含有20ng/ml bFGF且缺少H-1152 的MEF調(diào)理培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基。再培養(yǎng)M小時后，將膜上的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定、 用PBS沖洗、風(fēng)干、用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色。包括了含有IyM的H-1152的孔作為對照。借助光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞的數(shù)目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。附著于10號膜(圖8的分圖a)的細(xì)胞數(shù)量比附著于11號膜(圖8的分圖b)的細(xì)胞數(shù)量多。要求培養(yǎng)基中存在1 μ M的Η-1152以保持Hl細(xì)胞附著于膜(圖8的分圖a 和b)上。從培養(yǎng)基除去H-1152導(dǎo)致細(xì)胞從10號膜和11號膜(圖8的分圖c和d)脫離。 [on ]能件。 將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜)的平面基底上。將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF且補(bǔ)充有3 μ M的H-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。通過從培養(yǎng)基中去除H-1152來對細(xì)胞進(jìn)行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)3代并將其收集以用于流式細(xì)胞術(shù)和定量RT-PCR分析。如表4 中所示，通過流式細(xì)胞術(shù)測定，超過95%的細(xì)胞表達(dá)與多潛能性相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，包括1Tra 1-60、1Tral-8l、SSEA-3和SSEA-4。圖9示出定量RT-PCR的結(jié)果，表明在聚碳酸酯膜上培養(yǎng)3代的Hl中表達(dá)的多個基因與未分化的Hl細(xì)胞中的處于相當(dāng)水平。在單獨的研究中，將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜) 的平面基底上。將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF且補(bǔ)充有1 μ M的H-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。通過從培養(yǎng)基中去除Η-1152來對細(xì)胞進(jìn)行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)9代并將其收集以用于流式細(xì)胞術(shù)。如表5 中所示，超過95%的細(xì)胞表達(dá)與多潛能性相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，包括Tral-60、Tral-SU SSEA-3 和 SSEA-4。一種用于評估多潛能性的備選方法是借助細(xì)胞形成胚狀體的能力。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜)的平面基底上。將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF且補(bǔ)充有3 μ M的Η-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。通過從培養(yǎng)基中去除Η-1152來對細(xì)胞進(jìn)行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)12代。通過如下方案來實現(xiàn)胚狀體的形成。收集Hl細(xì)胞并將其在超低簇平板(Ultra Low Cluster Plate) (Corning產(chǎn)品目錄號3471)中在補(bǔ)充有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過更新培養(yǎng)基的50%來隔天給細(xì)胞供料。在14天后形成胚狀體(圖10)。實例11 :人胚胎干細(xì)胞在包括聚碳酸酯膜的平面基底上培養(yǎng)后能夠形成定形內(nèi)腿。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至包括聚碳酸酯(8號膜)的平面基底上。最開始，將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF且補(bǔ)充有3 μ M的Η-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后， 在進(jìn)行實驗操作之前，將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF且補(bǔ)充有1 μ M的H-1152的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)10代。然后，將細(xì)胞接種至涂覆有MATRIGEL 的1 30稀釋液的IOOmm組織培養(yǎng)板上。 將細(xì)胞在含有20ng/ml bFGF的MEF調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。接著，將細(xì)胞在補(bǔ)充有2%的無脂肪酸牛血清白蛋白、lOOng/lm的激活素A和20ng/ml的Wnt3a的DMEM-F12中處理2 天，然后用補(bǔ)充有2%的無脂肪酸牛血清白蛋白和lOOng/ml的激活素A的DMEM-F12再處理 2天。此后，通過TRYPLE處理使細(xì)胞脫離以形成單細(xì)胞懸浮液并通過流式細(xì)胞術(shù)確定定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。超過90%的細(xì)胞是⑶99和CXCR4(⑶184)雙陽性的并且12%的細(xì)胞是⑶9陽性和C)(CR4陰性的，如表6中所示。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞保持了分化成定形內(nèi)胚層的能力。實例12 本發(fā)明的平面基底的物理特件。測定了本發(fā)明的平面基底上的表面化學(xué)。表7-10示出了 X射線光電子能譜(XPS) 分析和接觸角。對于XPS，采用了對大約50-100人的分析深度。通常，95%的信號源自該深度內(nèi)。膜1-3含有類似濃度的氧、碳(主要為C-O和C_(C，H)，有可能是0-C-0)以及氮 (為N03、NO2,有可能是C-N和R4-N+)。膜3還含有痕量濃度的Na+和SOx以及較高濃度的
17C-(CjH)0膜4含有C-(C，H)、C-(0，N)和(0，N)-C = 0以及可能有痕量的鈉。膜5主要含有C-O并且還含有C-(C，H)以及O-C-O和/或O-C = 0。還檢測到痕量濃度的Na+和S0X。 膜 6-11 含有 C-(C，H)、C-0、O-C = 0、C-N、C03、p-p* 和痕量濃度的 &-N+、SOx 以及 Na+ 或 Cr3+。膜6的表面還可能含有痕量濃度的氯。僅在膜10和11上檢測到痕量濃度的氯，而在膜6-9上檢測到Na+。膜12的表面含有C-(C，H)、C_0、O-C = 0和符合PET的pi-pi*。還檢測到痕量濃度的氮和鈉。圖11示出本發(fā)明的平面基底的掃描電子顯微圖。觀察到兩種類型的形態(tài)。一種類型的特征在于纖維的開放網(wǎng)絡(luò)。第二種類型的特征在于在整個表面上分散了圓形孔的平滑片層。表10示出本發(fā)明的表面的接觸角測量結(jié)果。表面1至5具有約18°至約32°的接觸角測量值。多能干細(xì)胞不需要存在Mio激酶活性抑制劑來附著于表面1-5。表面6至12具有大于32°的接觸角測量值。多能干細(xì)胞需要存在Mio激酶活性抑制劑來附著于這些表面。輔丨丨13 斜imffl胞編〒■_成解商底,。根據(jù)US6743273 以及 Schindler M 等人，Biomaterials 26(28) :5624-5631 ； 2005的方法來制備由聚胺組成的平面基底。該平面基底可以商標(biāo)ULTRAWEB 商購獲得。ULTRAWEB 合成表面由隨機(jī)取向的靜電紡紗聚酰胺納米纖維構(gòu)成，其平均纖維直徑為觀0歷。纖維尺寸分布在200nm和400nm之間。所測試的第一 ULTRAWEB 表面具有稍微親水性的表面(產(chǎn)品目錄號為3870XX1)，而第二表面，即表面(產(chǎn)品目錄號為3871XX1)為稍微親水性的并且覆蓋有聚胺材料，所述聚胺材料為納米纖維提供了用于凈正電荷的游離氨基。這兩個表面均通過疏水相互作用高效吸收蛋白質(zhì)。圖12中示出了 5微米分辨率和 10，000倍放大率的掃描電子顯微圖。然而，人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞不能附著于所測試的任一個UTRAWEB 表面。實例14 成分確定的培養(yǎng)基對多能干細(xì)胞附著于本發(fā)明的平面基底的影響。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞接種至如下平面基底上膜1 (混合纖維素酯)、膜 4(尼龍)、膜5(乙酸纖維素)和硝化纖維。將細(xì)胞以1 3稀釋度接種至成分確定的培養(yǎng)基mTESR 中并且培養(yǎng)M小時。包括了 MEF調(diào)理培養(yǎng)基中的平行培養(yǎng)物作為對照。mTESR 中的細(xì)胞培養(yǎng)沒有影響細(xì)胞附著于平面表面的能力。細(xì)胞能夠附著于膜1、4和5以及硝化纖維。使用mTESR 表現(xiàn)出細(xì)胞的最強(qiáng)粘結(jié)的膜是膜4，之后是膜5 (等于硝化纖維)，接著是膜1。
權(quán)利要求
1.一種使多能干細(xì)胞附著于平面基底的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層，所述方法包括如下步驟a.獲得多能干細(xì)胞的懸浮液；以及b.將所述細(xì)胞懸浮液添加至所述平面基底并允許所述細(xì)胞附著。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述細(xì)胞已附著于所述基底后將所述細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述細(xì)胞已附著于所述基底后使所述細(xì)胞分化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理所述細(xì)胞懸浮液來增強(qiáng)所述多能干細(xì)胞與所述基底的附著。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在所述多能干細(xì)胞附著于所述基底后除去所述能夠抑制Mio激酶活性的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述能夠抑制Mio激酶活性的化合物選自 Y-27632、法舒地爾、H-1152和羥基法舒地爾。
全文摘要
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞在缺少吸附層和飼養(yǎng)細(xì)胞層的平面基底上生長、擴(kuò)增和分化的方法。
文檔編號C12N5/0735GK102257132SQ200980147112
公開日2011年11月23日 申請日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者B·弗賴爾, Y·X·陳 申請人:森托科爾奧索生物科技公司