專利名稱：徹底降解面粉中谷蛋白的微生物方法
徹底降解面粉中谷蛋白的微生物方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及徹底降解面粉中谷蛋白(gluten谷蛋白)的微生物技木。具體地說(shuō)，本發(fā)明方法選用發(fā)酵類烘焙產(chǎn)品生產(chǎn)常用的乳酸菌和真菌蛋白酶在液體發(fā)酵條件下實(shí)現(xiàn)的谷蛋白的徹底降解(殘余谷蛋白濃度低于20ppm)。發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的谷物粉可作為原料用于生產(chǎn)無(wú)谷蛋白食物，供乳糜瀉患者食用。生產(chǎn)無(wú)谷蛋白食物的現(xiàn)有方法采用天然無(wú)谷蛋白或經(jīng)提取而無(wú)谷蛋白的原料，與之相比，本發(fā)明提出的生物技術(shù)方法具有諸多經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、營(yíng)養(yǎng)和感官上的優(yōu)點(diǎn)。流行病谷蛋白不耐或乳糜瀉越來(lái)越多發(fā)。最近一次在歐洲和美國(guó)人中進(jìn)行的普查報(bào)道的發(fā)病率是1/100受影響個(gè)體(Rewers，2005.乳糜瀉的流行病學(xué)；乳糜瀉的流行性、發(fā)病率和發(fā)展。胃腸病學(xué)(Gastroenterology)，128 :47-51)。據(jù)目前所知，專門針對(duì)這ー飲食不耐的有效療法是終身嚴(yán)格遵守完全無(wú)谷蛋白飲食(Hamer，2005.乳糜瀉背景及其生物化學(xué)內(nèi)容。生物技術(shù)發(fā)展(Biotechnol Advanc), 23 :401-408) 例如，已知可用乳酸菌由無(wú)谷蛋白面粉制作烘焙產(chǎn)品(More等,谷物化學(xué)(Cereal Chemistry),美國(guó)谷物化字家TソJ、會(huì)(American Association of Cereal Chemists)。Minneapolis, US, vol. 84,no. 4,1-1-2007, pp. 357-364 和 Moore 等，歐洲食物研究與技術(shù)(European Food Research和Technology)，vol. 226，6-6-2007，pp. 1309-1316)。然而，無(wú)谷蛋白飲食也有明顯的缺點(diǎn)。它很昂貴，與谷物產(chǎn)品相比，無(wú)谷蛋白產(chǎn)品的感官性品質(zhì)較差，且不易保存，這種飲食很難嚴(yán)格遵守，需要營(yíng)養(yǎng)師的長(zhǎng)期監(jiān)管，還包括因食物中徹底不含谷物造成的營(yíng)養(yǎng)失衡(例如纖維素、礦物質(zhì)和維生素)(Grehn等，2001.接受10年無(wú)谷蛋白飲食治療的瑞典成年乳糜灣患者的飲食習(xí)慣。Scand J Nutr 45 :178-182 ;Mariani等，1998.無(wú)谷蛋白飲食未成年乳糜灣患者的營(yíng)養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)，兒科胃腸道營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志(J Pediart Gastroenterol Nut) 27 519-523 Thompson等，2005.無(wú)谷蛋白飲食研究美國(guó)乳糜瀉患者是否攝入量推薦量的纖維素、鐵、鈣和谷類？人類營(yíng)養(yǎng)與飲食雜志(J. Human. Nutr. Diet.) 18 :163-169)。并且，某些病例(例如“頑固性乳糜瀉”)中，即使完全奉行無(wú)谷蛋白飲食也無(wú)法完全恢復(fù)腸道功能(Sollid和Khosla, 2004.乳糜灣的未來(lái)治療方法之選。胃腸道和肝臟科(Gastroenterol.Hepatol.) 2 140-147)。在無(wú)谷蛋白飲食的替代療法中，許多研究利用了目前關(guān)于毒性表位序列的已知信息，并且考慮到了采用微生物酶例如脯氨酰內(nèi)肽酶(PEPs)水解這些多肽。微生物酶已被提議作為飲食補(bǔ)充(Shan等，2004.三種細(xì)菌脯氨酰內(nèi)肽酶的比較生物化學(xué)分析乳糜瀉處方。生物化學(xué)雜志(Biochem. J.)383 :311-318)，和/或者用于谷蛋白的體外(in vitro)脫毒(Chen 等，2003.瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)PeP02 的鑒定與表征，ー種具有后脯氨酸特異性的內(nèi)肽酶。應(yīng)用環(huán)境學(xué)會(huì)微生物學(xué)(Appl. Environ.Microbiol.) 69 :1276-1282 ;St印niak等，2005。采用新脯氨酰內(nèi)肽酶的高效谷蛋白降解乳糜灣的處方。美國(guó)生理學(xué)胃腸道學(xué)和肝臟生理學(xué)雜志(Am. J. Physiol. Gastrointest.Liver Physiol. )291 :G621_G629)。專利申請(qǐng)W02008/010252 和 Cagno 等.(食物保護(hù)雜志(Journal of FoodProtection)，vol. 71，no. 7，2008，pp. 1491-1495)記載的方法用無(wú)谷蛋白面粉制作烘焙產(chǎn)
品并試圖改善無(wú)谷蛋白原料制得產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)、感官和保存性品質(zhì)。
在近幾十年中，發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的生物技術(shù)也發(fā)生了相當(dāng)?shù)母淖儯瑢?duì)整個(gè)原谷蛋白類飲食群體的營(yíng)養(yǎng)習(xí)慣產(chǎn)生了影響?，F(xiàn)在，發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)技術(shù)極其迅速(例如，采用化學(xué)發(fā)酵劑或采用烘焙酵母(baker' s yeast))，完全取代了采用野生乳酸菌和天然材料來(lái)源并用作酵頭(“sourdough”)的酵母進(jìn)行的緩慢發(fā)酵過(guò)程。采用目前的方法，谷物組分(例如蛋白質(zhì))在食物加工過(guò)程中不受任何水解作用，保留了天然原料的特征(Gobbetti,1998.酸酵頭中的微生物群乳酸菌與酵母之間的相互作用。食品科學(xué)與技術(shù)趨勢(shì)(TrendsFood Sci. Technol. )9 :267-274)。基于這些考慮并利用了選定乳酸菌的混合物所具有的酶性潛能，許多研究(Di Cagno等，2002.利用酸酵頭乳酸菌的蛋白水解對(duì)人谷物不耐相關(guān)麥粉蛋白和麥醇溶蛋白肽的作用。應(yīng)用環(huán)境與微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.)68 :623-633 ；Di Cagno等，2004。乳糜瀉患者能夠耐受用無(wú)毒麥粉并用選定乳桿菌起酵制作的老酵面包。應(yīng)用環(huán)境與微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.) 70 :1088-1096 ;DiCagno 等，2005。用硬粒小麥面及精制麥麩制作的意大利面是可用于降低谷蛋白不耐的手段之一。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志(J. Agr. Food Chem.) 53 :4393-4402 ;De Angelis 等，2005. VSL#3 益生菌制劑能夠水解造成乳糜瀉的麥醇溶蛋白多肽。生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim. Biophys. Acta. ) 1762 :80_93)顯示采用傳統(tǒng)生物技術(shù)，基于選定乳酸菌和長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，可以將初始谷蛋白濃度顯著降低。已為WHO(世界衛(wèi)生組織)和FAO(食品與農(nóng)業(yè)組織)采納的國(guó)際食品標(biāo)準(zhǔn)(CodexAlimentarius)對(duì)“無(wú)谷蛋白產(chǎn)品”和“無(wú)谷蛋白制造的產(chǎn)品”進(jìn)行了區(qū)分，前者為所含成分的谷蛋白濃度低于20ppm，后者為殘余谷蛋白濃度低于200ppm。然而，多項(xiàng)研究(這些研究導(dǎo)致了“醇溶谷蛋白工作組(Prolamins Working Group) ”相關(guān)指導(dǎo)意見(jiàn)的頒布)提出任何情況下都需要維持谷蛋白的閾值低于20ppm(Stern等，2001.乳糜瀉中谷蛋白的臨床影ロ向的研究。歐洲胃腸道肝臟科雜志(Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.) 13 :741-747)。最近的ー項(xiàng)研究(Rizzello等，2007.在食物加工過(guò)程中用乳桿菌和真菌蛋白酶高效降解谷蛋白乳糜灣的新希望。應(yīng)用環(huán)境與微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.) 73 :4499-4507)考慮在半液體揉合條件下采用由10種選定乳酸菌構(gòu)成的復(fù)雜混合物、真菌蛋白酶和長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵(48小吋，37°C)。據(jù)電泳、色譜和免疫學(xué)分析，麥粉中的谷蛋白被降解到了低于20ppm閾值的濃度。此外，專利申請(qǐng)W02006/097415記載了一種降解谷蛋白的方法，與上述研究相似，該方法采用由至少6種乳酸菌和/或雙歧桿菌構(gòu)成的復(fù)雜混合物和長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵(24-31小吋)。然而，該方法不適用于將谷蛋白徹底降解，因此不能用于乳糜瀉患者。事實(shí)上，W02006/097415的圖IB顯示微生物水解后，仍有未降解麥醇溶蛋白斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，表2也證實(shí)了這一點(diǎn)，由此可見(jiàn)，雖然部分麥醇溶蛋白被部分水解，另ー些則對(duì)水解不敏感。根據(jù)文獻(xiàn)和現(xiàn)有數(shù)據(jù)，有些問(wèn)題對(duì)于由脫毒谷物粉制作無(wú)谷蛋白食品而言似乎尤其需要重視(i)簡(jiǎn)化用于降解過(guò)程的選定乳酸菌的組成；(ii)極大縮短發(fā)酵時(shí)間以適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用所需；(iii)驗(yàn)證乳酸菌和真菌酶有效作用于不同種類硬粒小麥(durumwheat)粉和面包小麥粉以及大麥粉、黑麥粉和燕麥粉的能力；(iv)提供水解谷蛋白的生物技術(shù)方法，從而使得脫毒谷物粉能夠用于生產(chǎn)可用的無(wú)谷蛋白產(chǎn)品；和(V)通過(guò)體內(nèi)(invivo)和長(zhǎng)期醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證乳糜瀉患者在長(zhǎng)期食用由脫毒小麥粉制成的無(wú)谷蛋白產(chǎn)品后的絕對(duì)耐受性。
鑒于以上所述，顯然需要合適的原料和方法用于由脫毒谷物粉制作無(wú)谷蛋白烘焙產(chǎn)品，一方面消除現(xiàn)有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)中經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、營(yíng)養(yǎng)和感官評(píng)價(jià)等方面的缺點(diǎn)，另ー方面消除現(xiàn)有無(wú)谷蛋白商品的缺點(diǎn)。本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)只用兩種乳酸菌，與真菌蛋白酶組合，降解谷蛋白所需的發(fā)酵時(shí)間顯著縮短。并且，本發(fā)明證明了乳酸菌和真菌蛋白酶徹底降解不同種類硬粒小麥和面包小麥、大麥、黒麥和燕麥面粉來(lái)源谷蛋白的能力；提供了ー種用脫毒小麥粉制作各種發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的生物技術(shù)方法；并且驗(yàn)證了乳糜瀉患者對(duì)產(chǎn)品的絕對(duì)耐受性，由此以ー種全新的方式使得小麥粉能夠用作制作無(wú)谷蛋白發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的原料。本發(fā)明的乳酸菌屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),分離自制作南意大利面包所用的“酵頭”。舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis) DPPMA12 (保藏號(hào)DSMZN. DSM22063,保藏日2008 年 11 月 28 日)和胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DPPMA125(保藏號(hào)DSMZ N. DSM22064，保藏日:2008 年 11 月 28 日)。 本發(fā)明對(duì)ー種生產(chǎn)無(wú)谷蛋白發(fā)酵烘焙產(chǎn)品(殘余谷蛋白含量低于20ppm)的生物 技術(shù)方法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化，該方案涉及用選定的乳酸菌和真菌蛋白酶對(duì)20-50% (重量)的谷物粉水懸浮液進(jìn)行極快速的發(fā)酵(12-20小吋，30-37°C)，然后，按照根據(jù)所需特性確定的百分比，將它們作為用烘焙酵母進(jìn)行的短期(約1-3小時(shí))發(fā)酵的成分之一。以下概述的是ー種由脫毒無(wú)谷蛋白小麥粉生產(chǎn)發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的生物技術(shù)方法。
權(quán)利要求
1.包含舊金山乳桿菌(Lactobacillussanfranciscensis)DSM22063和胚芽乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum) DSM 22064 或由它們構(gòu)成的混合物。
2.如權(quán)利要求I所述的混合物，還含有真菌蛋白酶。
3.如權(quán)利要求2所述的混合物,所述真菌蛋白酶選自米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶和黑曲霉(Aspergillus niger)蛋白酶或它們的混合物。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的混合物在徹底降解面粉中的谷蛋白和/或所述面粉的發(fā)酵中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng),所述面粉選自軟小麥粉或硬小麥粉、大麥粉、黑麥粉或燕麥粉。
6.制作液體面團(tuán)的方法，其中，谷蛋白被徹底降解，所述面團(tuán)適用于生產(chǎn)無(wú)谷蛋白發(fā)酵 產(chǎn)品，所述方法包括或由以下步驟構(gòu)成 a)培養(yǎng)擴(kuò)增舊金山乳桿菌DSM22063和胚芽乳桿菌DSM22064 ； b)將濃度為20-50%、以30%為佳的面粉與50-80%、以70%為佳的水混合，水中含有步驟a)中兩種菌株的混合物,細(xì)胞密度約108cfu/g; c)加入ー種或多種濃度各為200-500ppm、以400ppm為佳的真菌蛋白酶； d)30-37°C發(fā)酵8-20小時(shí)，以12小時(shí)為佳。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，還包括步驟e):對(duì)步驟d)所得的液體面團(tuán)進(jìn)行干燥。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，所述面粉選自面包小麥粉、硬粒小麥粉、大麥粉、黒麥粉、燕麥粉，或它們的混合物，優(yōu)選軟小麥粉和硬粒小麥粉。
9.如權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的方法,所述真菌蛋白酶選自米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)蛋白酶或它們的混合物。
10.液體面團(tuán)或干面團(tuán)，其中，谷蛋白被權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的方法徹底降解。
11.ー種混合物，包含或由以下成分構(gòu)成權(quán)利要求10所述的面團(tuán)和ー種或多種天然無(wú)谷蛋白面粉。
12.如權(quán)利要求11所述的混合物，所述天然無(wú)谷蛋白面粉選自天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔麩粉或籽粒莧粉和喬麥粉，或它們的組合物。
13.如權(quán)利要求11或12所述的混合物，含有以下百分比的所述面粉天然玉米粉5-15%、以10%為佳，白玉米粉5-15%、以10%為佳，稻米粉、藜谷粉、苔麩粉或籽粒莧粉10-30%、以20%為佳，和喬麥粉1_10%、以5%為佳，所述百分比為重量百分比，以面粉組合物的總重為基準(zhǔn)。
14.ー種采用權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述方法，利用谷蛋白脫毒面粉制作發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的方法，包括或由以下步驟構(gòu)成 a)在采用權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述方法制得的谷蛋白脫毒液體面團(tuán)中加入天然無(wú)谷蛋白面粉10-40%、以30%為佳，烘焙酵母1-2%，鹽0. 1-1.0%和造型劑0. 5-1 %，然后揉合； b)任其30°C發(fā)酵約1-3小吋，以I.5為佳； c)220°C烘烤50分鐘。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，當(dāng)谷蛋白脫毒面團(tuán)被干燥后，所述成分與水的百分比之比約為I. 2 : 0. 8。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，所述天然無(wú)谷蛋白面粉選自天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔鉄粉、桿粒覓粉、喬麥粉，或它彳13的混合物。
17.如權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的方法，所述谷蛋白脫毒面粉選自面包小麥粉和硬粒小麥粉、大麥粉、黑麥粉、燕麥粉、或它們的混合物，優(yōu)選軟小麥粉和硬粒小麥粉。
18.用權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述方法制得的烘焙產(chǎn)品。
19.ー種制作發(fā)酵烘焙產(chǎn)品的方法，包括或由以下步驟構(gòu)成 a)直接向權(quán)利要求6-9中任ー項(xiàng)限定的谷蛋白脫毒面團(tuán)中加入天然玉米粉、稻米粉、雞蛋、糖、黃油和烘焙酵母，并揉合； b)任其30°C發(fā)酵I.5小時(shí)； c)將發(fā)酵面團(tuán)于250°C烘烤50分鐘。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，步驟a)中，成分的百分比如下天然玉米10%，稻米粉10%，雞蛋5%，糖3%，黃油I %和烘焙酵母I. 5%。
21.用權(quán)利要求19或20所述方法制得的發(fā)酵烘焙產(chǎn)品。
22.權(quán)利要求10所述面團(tuán)，權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述混合物，權(quán)利要求18所述的烘焙發(fā)酵產(chǎn)品，權(quán)利要求21所述的烘焙發(fā)酵甜品產(chǎn)品在制作適用于彌補(bǔ)無(wú)谷蛋白飲食造成的營(yíng)養(yǎng)失衡的食品中的應(yīng)用。
23.ー種乳酸菌，它是舊金山乳桿菌DSM22063。
24.—種乳酸菌，它是胚芽乳桿菌DSM 22064。
全文摘要
本發(fā)明涉及用選定乳酸菌和真菌酶徹底降解面包小麥粉和硬粒小麥粉、大麥粉、黑麥粉和燕麥粉中的谷蛋白。尤其是，本發(fā)明涉及用選定乳酸菌和真菌酶徹底降解谷物粉中的谷蛋白(殘余谷蛋白濃度低于20ppm)，脫毒后的谷物粉可用于按照標(biāo)準(zhǔn)生物方法生產(chǎn)各種無(wú)谷蛋白食品。
文檔編號(hào)C12R1/225GK102655756SQ200980152930
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者A·卡森, A·本納杜斯, C·G·瑞澤羅, G·吉利亞尼, 安格利斯 M·德, M·戈貝蒂, 家格諾 R·迪 申請(qǐng)人:吉利亞尼股份公司