專利名稱：?jiǎn)紊嘀囟縫cr的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容涉及在使用單一檢測(cè)標(biāo)記的單個(gè)反應(yīng)中測(cè)定與第二靶核酸序列相比的第一靶核酸序列的相對(duì)拷貝數(shù)和絕對(duì)拷貝數(shù)的方法以及可用于實(shí)施所述方法的試齊U盒。
背景技術(shù)：
實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的Ct值，即反應(yīng)孔的增強(qiáng)的熒光(與產(chǎn)物形成成比例)穿過(guò)設(shè)定閾值的部分循環(huán)數(shù)，所述設(shè)定閾值是基線熒光之上的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(Higuchi，R.，F(xiàn)ockler, C.，Dollinger, G. and Watson, R. (1993)Kinetic PCR analysis :real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology(N Y)，11，1026-1030)。Ct值對(duì)輸入靶DNA的量的對(duì)數(shù)作圖是線性的，使得可通過(guò)與在同一板上擴(kuò)增參照DNA樣本的系列稀釋物得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到未知物的相對(duì)定量。對(duì)于許多QPCR應(yīng)用，研究者希望將來(lái)自靶序列的信號(hào)⑴標(biāo)準(zhǔn)化為來(lái)自參照序列的信號(hào)(R)。早期研究用在嵌入任何雙鏈DNA中時(shí)會(huì)發(fā)熒光的染料例如溴化乙錠或 SYBR Green I測(cè)量不同(單重)反應(yīng)中的T和R，并且這種方法仍在使用。最近的研究已經(jīng)使用針對(duì)每種被定量的DNA序列的具有不同的激發(fā)/發(fā)射光譜的不同熒光染料，在多色多重 QPCR 中測(cè)量了同一個(gè)反應(yīng)容器中的 T 和 R(ffittwer, C. T.，Herrmann, Μ. G.，Gundry, C.N.禾口 Elenitoba-Johnson, K. S. (2001)Real-time multiplex PCR assays. Methods,25, 430-442)。通過(guò)多重QPCR測(cè)量T/R比值使必須進(jìn)行的不同PCR反應(yīng)的數(shù)量減少一半。而且，由于T和R信號(hào)兩者均是在每個(gè)反應(yīng)管中收集的，對(duì)重復(fù)反應(yīng)吸取的給定DNA樣本的量的變化不再會(huì)產(chǎn)生T/R比值的變化，而在單重QPCR中在不同反應(yīng)孔中測(cè)量T和R時(shí)會(huì)產(chǎn)生所述變化。多色多重QPCR的主要缺點(diǎn)在于熒光探針成本較高，以及配備來(lái)讀取兩種或更多種熒光顏色的專用QPCR機(jī)器成本高。在多重PCR的傳統(tǒng)方法中(不論該P(yáng)CR是否是定量的)，確定以下引物組和引物濃度有時(shí)也過(guò)度耗時(shí)，所述引物組和引物濃度會(huì)防止由一個(gè)引物對(duì)引起的高拷貝數(shù)模板的早期擴(kuò)增抑制由第二個(gè)引物對(duì)引起的不同的低拷貝數(shù)模板的晚期擴(kuò)增
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在使用單一檢測(cè)標(biāo)記的單個(gè)反應(yīng)中測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)靶核酸序列的拷貝數(shù)的方法。還公開(kāi)了測(cè)定端粒序列的拷貝數(shù)的方法。這些數(shù)據(jù)可用于將已測(cè)量的端粒長(zhǎng)度和對(duì)應(yīng)于在某個(gè)群體中觀察到的端粒長(zhǎng)度的死亡風(fēng)險(xiǎn)或疾病發(fā)生可能性相結(jié)合。本文公開(kāi)了通過(guò)使用單一檢測(cè)標(biāo)記的在單個(gè)反應(yīng)孔、均一體系中的單色多重定量 PCR(MMQPCR)測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法和組合物。所公開(kāi)的方法和組合物的其他優(yōu)點(diǎn)一部分將在下述的說(shuō)明書(shū)中闡明，并且一部分可從說(shuō)明書(shū)中得以理解，或者通過(guò)所公開(kāi)的方法和組合物的實(shí)施得以獲悉。所公開(kāi)的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)借助于在所附權(quán)利要求中特別指出的要素及組合可得以實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)理解的是，前述的概括描述和下述的詳細(xì)描述均僅是示例性和說(shuō)明性的，而不是對(duì)所主張的本發(fā)明的限制。


已納入并構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖，展示了所公開(kāi)方法和組合物的幾個(gè)實(shí)施方案，并且與說(shuō)明書(shū)一起用于解釋所公開(kāi)的方法和組合物的原理。圖1示出在循環(huán)1中telg引物與天然端粒序列雜交并且引發(fā)DNA合成。tele引物與天然端粒序列雜交，但由于其3’端錯(cuò)配，不能引發(fā)DNA合成。當(dāng)如所示和以未示出的構(gòu)型彼此雜交時(shí)，telg和tele有多個(gè)錯(cuò)配(包括在它們的3’端堿基處)，于是引物二聚體形成被抑制。telg和tele的3’端可以比對(duì)為完全互補(bǔ)的三個(gè)bp的重疊，但其穩(wěn)定性不足以有效形成引物二聚體。在循環(huán)2中，tele可沿著在循環(huán)1中合成的telg引物延伸產(chǎn)物雜交，但由于其他構(gòu)型會(huì)在tele的3’端堿基產(chǎn)生錯(cuò)配，因此僅當(dāng)以所示出的構(gòu)型雜交時(shí)， 才可以引發(fā)DNA合成。在所述telg延伸產(chǎn)物中，上橫線標(biāo)記telg引物自身的序列，斜體堿基標(biāo)記在PCR的循環(huán)1中新合成的序列。在引物5’端的大寫(xiě)的非模板化序列會(huì)阻止所述端粒PCR產(chǎn)物的3’端在所述端粒PCR產(chǎn)物的其他拷貝中間處引發(fā)DNA合成。圖2示出僅用端粒引物(圓形)，僅用白蛋白引物(“X”)，或同時(shí)用上述兩個(gè)引物組(三角形)對(duì)150ng人基因組DNA擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)之后的解鏈曲線(材料和方法部分給出的熱循環(huán)譜(thermal profile))。無(wú)模板對(duì)照的解鏈曲線用黑色表示，沒(méi)有符號(hào)。在最終880C孵育后，將反應(yīng)冷卻到72°C，從72°C至95°C以0. 5°C步進(jìn)采集信號(hào)，每步進(jìn)30秒停留時(shí)間。端粒和白蛋白擴(kuò)增子的解鏈溫度相差大約ire。圖3示出之前顯示具有長(zhǎng)端粒(圓形)、中等長(zhǎng)度端粒(“X”)或短端粒(三角形)的20ng三種參照人DNA樣本中的每一種的單色多重定量PCR (MMQPCR)。無(wú)模板對(duì)照擴(kuò)增曲線以黑方塊示出。上圖半對(duì)數(shù)圖；下圖線性圖。圖4示出用于測(cè)定相對(duì)T/S比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)三倍系列稀釋制備跨度為81倍范圍的五種濃度的標(biāo)準(zhǔn)人基因組DNA樣本(每孔150ng, 50ng, 16. 7ng，5. 55ng和1. 85ng)， 并且加至96孔PCR板中，一式兩份。從每個(gè)反應(yīng)孔中收集靶和參照熒光信號(hào)。圓形代表在 88°C采集的單拷貝基因白蛋白的數(shù)據(jù)；三角形代表在74°C采集的端粒重復(fù)序列的數(shù)據(jù)。在本研究的每個(gè)板中，使用相同的標(biāo)準(zhǔn)DNA來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)。圖5示出在來(lái)自95位個(gè)體的全血DNA樣本中，通過(guò)單色多重定量PCR用白蛋白作為單拷貝基因測(cè)定的相對(duì)τ/s比值與通過(guò)Southern印跡分析測(cè)定的平均末端限制性片段 (TRF)長(zhǎng)度之間的相關(guān)性。每個(gè)Τ/S比值均是三次測(cè)量的平均值；每個(gè)平均TRF長(zhǎng)度均是
6兩次測(cè)量的平均值。使用Microsoft Excel測(cè)定線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。圖6示出在MMQPCR測(cè)定的獨(dú)立運(yùn)行中相對(duì)T/S比值的重現(xiàn)性。在次日重新測(cè)定在圖4中所測(cè)定的相同95個(gè)DNA樣本，注意，具體MyiQ PCR儀和每個(gè)DNA樣本占有的反應(yīng)孔位置與前一天是不同的。使用Microsoft Excel測(cè)定線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。圖7示出用白蛋白作為單拷貝基因獲得的T/S比值與用β -珠蛋白作為單拷貝基因獲得的τ/s比值的之間的相關(guān)性。用β-珠蛋白引物代替白蛋白引物，在兩次不同運(yùn)行中，在相同的95個(gè)DNA樣本中測(cè)量相對(duì)T/S比值，一式三份。對(duì)于每個(gè)樣本，將用白蛋白作為單拷貝基因的兩次不同運(yùn)行的平均T/S(x軸)對(duì)用β球蛋白作為單拷貝基因的兩次運(yùn)行的平均T/S(y軸)作圖。使用Microsoft Excel測(cè)定線性回歸方程式和相關(guān)系數(shù)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括用于測(cè)定一種或多種靶核酸的拷貝數(shù)的方法和體系。通過(guò)參考下面對(duì)具體的實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明以及包括在其中的實(shí)施例，并參考附圖及其前面和下面的描述，可以更容易理解所公開(kāi)的方法和組合物。所公開(kāi)的組合物和方法可以用于靶核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)檢測(cè)是可以在擴(kuò)增反應(yīng)或操作過(guò)程中進(jìn)行或在之后立即進(jìn)行的檢測(cè)。通常，此類檢測(cè)可通過(guò)在擴(kuò)增期間的一個(gè)或多個(gè)離散時(shí)間點(diǎn)、在擴(kuò)增的全部過(guò)程中或擴(kuò)增的一個(gè)或多個(gè)部分期間連續(xù)地、或者結(jié)合離散時(shí)間點(diǎn)和連續(xù)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn)。通過(guò)利用體現(xiàn)或產(chǎn)生可被檢測(cè)到的可檢測(cè)信號(hào)而不干擾擴(kuò)增反應(yīng)或操作的標(biāo)記或基團(tuán)，可以有助于實(shí)時(shí)檢測(cè)。熒光標(biāo)記是可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)的標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例。獲得實(shí)時(shí)檢測(cè)的特別有用的方法是在擴(kuò)增操作中使用檢測(cè)標(biāo)記。 用適當(dāng)設(shè)計(jì)的檢測(cè)標(biāo)記，當(dāng)擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)可以產(chǎn)生包括熒光信號(hào)的檢測(cè)信號(hào)。在多數(shù)此類情況下，所述檢測(cè)信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的量和/或靶序列或靶分子的量成比例。本文公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法。靶核酸可以從樣本獲得或如本文他處所述人工合成。本文引用(無(wú)論前文或下文)的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物均由此通過(guò)引用方式全文并入本文，以便更充分地描述所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的本文描述和主張的發(fā)明之日前的現(xiàn)有技術(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于具體的合成方法，或具體重組生物技術(shù)方法(除非另有說(shuō)明外)，或具體的試劑(除非另有說(shuō)明外)，或具體的藥物載體，或具體的藥物制劑或治療方案，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。定義和術(shù)語(yǔ)本文使用的術(shù)語(yǔ)僅為描述具體實(shí)施方案的目的，而不意圖限定。當(dāng)在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，除非上下文中清楚地指明，否則單數(shù)形式 “a”、“an”和“該”可以包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，“a compound”的表述包括化合物的混合物，“a pharmaceutical carrier"的表述包括兩個(gè)或更多個(gè)此類載體的混合物等等。 除非上下文中清楚地指明，否則“a component"的表述可以包括單一或多個(gè)組分或組分的混合物。范圍在本文中可表示為從“大約” 一個(gè)具體值和/或至“大約”另一個(gè)具體值。本
文中使用的術(shù)語(yǔ)“大約”意思是近似地、在......左右、粗略地或大概。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“大約”結(jié)合
數(shù)值范圍使用時(shí)，其通過(guò)將邊界擴(kuò)大至所示數(shù)值之上和之下修飾該范圍。通常，本文中的術(shù)語(yǔ)“大約”用于修飾在所示值之上和之下偏差20%的數(shù)值。當(dāng)表示此類范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從所述一個(gè)具體值和/或至所述另一具體值。同樣地，當(dāng)通過(guò)使用先行詞“大約” 以近似值表示數(shù)值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，該具體值形成另一個(gè)實(shí)施方案。還應(yīng)當(dāng)理解，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在另一個(gè)端點(diǎn)有關(guān)時(shí)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)均是有意義的。本文中使用的單詞“或者/或”是指具體列表中的任何一個(gè)成員并且包括該列表的成員的任意組合。所謂“樣本”意指動(dòng)物、來(lái)自動(dòng)物的組織和器官、細(xì)胞(在受試者體內(nèi)、從受試者直接采集或者維持在培養(yǎng)物中或來(lái)自培養(yǎng)的細(xì)胞系的細(xì)胞)；細(xì)胞裂解物(或裂解物部分) 或細(xì)胞提取物；或包含一種或多種來(lái)自細(xì)胞或細(xì)胞材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液， 其如本文所述進(jìn)行測(cè)定。樣本也可以是任何含有細(xì)胞或細(xì)胞組分的體液或排泄物(例如， 但不限于，血液、尿液、糞便、唾液、淚液、膽汁)。 本文使用的詞組“核酸”是指天然或合成的寡核苷酸或多核苷酸，無(wú)論DNA、RNA或 DNA-RNA雜合體、單鏈或雙鏈、正義或反義，所述核酸能通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)與互補(bǔ)核酸雜交。本發(fā)明的核苷酸也可以包括核苷酸類似物(例如，BrdU)以及非磷酸二酯核苷間鍵(例如，肽核酸(PNA)或硫酯鍵(thiodiester linkage))。具體地，核酸可以包括但不限于 DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA 或其任意組合。所謂的“特異性結(jié)合”表示組合物識(shí)別其同族靶標(biāo)并與其發(fā)生物理相互作用。例如，引物可以特異性結(jié)合其靶核酸。例如，第一引物組的引物可以特異性結(jié)合第一靶核酸序列，不明顯識(shí)別其他靶標(biāo)或靶核酸序列并且不與它們發(fā)生相互作用。所謂的“探針”、“引物”或寡核苷酸表示能與含有互補(bǔ)序列的第二 DNA或RNA分子(“靶標(biāo)”)堿基配對(duì)的確定序列的單鏈DNA或RNA分子。產(chǎn)生的雜合體的穩(wěn)定性取決于發(fā)生的堿基配對(duì)的程度。堿基配對(duì)的程度受例如探針與靶分子之間的互補(bǔ)程度以及雜交條件的嚴(yán)格度的參數(shù)的影響。雜交嚴(yán)格度受到例如溫度、鹽濃度和有機(jī)分子如甲酰胺的濃度的參數(shù)的影響，并且其通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定。對(duì)靶核酸(例如，基因和 /或mRNA)特異的探針或引物與其會(huì)雜交的靶標(biāo)的區(qū)域具有至少80% -90%序列互補(bǔ)性、 至少91% -95%序列互補(bǔ)性、至少96% -99%序列互補(bǔ)性、或至少100%序列互補(bǔ)性?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可檢測(cè)地標(biāo)記(放射性或非放射性地)探針、引物和寡核苷酸。探針、引物和寡核苷酸用于涉及核酸雜交的方法，例如本文所述的單色多重定量 PCR(MMQPCR)以及核酸測(cè)序、反轉(zhuǎn)錄和/或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析、Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、 電泳遷移率測(cè)定(EMSA)。所謂的“引物組”用來(lái)表示至少兩個(gè)引物，其中每個(gè)引物都包含與同一靶序列的相對(duì)鏈互補(bǔ)的序列。在一個(gè)引物組中，兩個(gè)引物中的至少一個(gè)必須是“正向引物”，兩個(gè)引物中的至少一個(gè)必須是“反向引物”?！罢蛞铩笔桥c靶核酸的有義鏈互補(bǔ)的引物，其中“反向引物”是與靶核酸的有義鏈的互補(bǔ)鏈(也被稱為靶核酸的反義鏈)互補(bǔ)的引物。引物組可以是能在PCR反應(yīng)中使用的一對(duì)引物。所謂的“擴(kuò)增子”用來(lái)表示作為天然或人工擴(kuò)增事件的產(chǎn)物形成的DNA片段。例如，它們可以通過(guò)本文所述的方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)以及通過(guò)天然基因復(fù)制形成。
所謂的“特異性雜交”表示在高嚴(yán)格度條件下，探針、引物或寡核苷酸識(shí)別大體上互補(bǔ)的核酸(例如，靶核酸)并與其發(fā)生物理相互作用(即，堿基配對(duì))，并且與其他核酸基本上不發(fā)生堿基配對(duì)。所謂的“高嚴(yán)格度條件”表示可進(jìn)行與下述雜交相當(dāng)?shù)碾s交的條件使用至少40個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的DNA探針，在含有0. 5M NaHPO4, pH 7. 2,7% SDSUmM EDTA ^P 1 % BSA(Fraction V)的緩沖液中，于65°C的溫度下，或在含有48 %甲酰胺、4. 8X SSC、0. 2M Tris-Cl、pH7. 6,1 XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和0. 1% SDS的緩沖液中，于42°C的溫度下雜交。高嚴(yán)格度雜交例如PCR、Northern, Southern或原位雜交、DNA測(cè)序等的其他條件是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見(jiàn)例如，F(xiàn). Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York，NY，1998)。材料公開(kāi)的是可用于所公開(kāi)的方法和組合物的、可結(jié)合所公開(kāi)的方法和組合物而使用的、可用于制備所公開(kāi)的方法和組合物的或者是所公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)物的材料、組合物以及組分。本文公開(kāi)了這些材料和其它材料，并且應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)公開(kāi)這些材料的組合、 子集、相互作用、群組等時(shí)，盡管可能未明確公開(kāi)這些化合物的每個(gè)不同的單獨(dú)和共同的組合和排列的具體表述，但是每一個(gè)均在本文被明確涵蓋并描述。因此，如果公開(kāi)了一類分子 A、B和C以及一類分子D、E和F，并且公開(kāi)了組合分子A-D的實(shí)例，那么即使沒(méi)有單獨(dú)列舉每個(gè)組合分子，每個(gè)組合分子也單獨(dú)地和共同地被涵蓋。因此，在這個(gè)實(shí)例中，從A、B和C; 和D、E和F ；以及實(shí)例組合A-D的公開(kāi)中，組合A-E、A_F、B_D、B_E、B_F、C_D、C-E和C-F中的每一個(gè)均被具體涵蓋并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)為被公開(kāi)。同樣地，這些組合的任何子集或組合也被具體涵蓋并公開(kāi)。因此，例如，從A、B和C ；和D、E和F ；以及實(shí)例組合A-D的公開(kāi)中，A_E、B_F 和C-E的子群被明確涵蓋并且應(yīng)當(dāng)認(rèn)為被公開(kāi)。這個(gè)概念適用于本公開(kāi)內(nèi)容的所有方面， 包括但不限于制備和使用所公開(kāi)組合物的方法中的步驟。因此，如果有多個(gè)可以進(jìn)行的其他步驟，那么應(yīng)當(dāng)理解，這些其他步驟中的每一步均可用所公開(kāi)方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合進(jìn)行，并且每個(gè)此類組合被具體涵蓋且應(yīng)認(rèn)為被公開(kāi)。A.靶樣本靶樣本可以由任何具有或被懷疑具有靶分子的來(lái)源得到。靶樣本可包含例如靶分子(如核酸)。靶樣本可以是靶核酸的來(lái)源。靶樣本可以包括天然的靶核酸、化學(xué)合成的靶核酸或者兩者。靶樣本可以是，例如來(lái)自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞、組織或體液(例如血液、尿液、精液、淋巴液、腦脊髓液或羊水)或其他生物樣本(例如組織培養(yǎng)細(xì)胞、口腔拭物、漱口水、糞便、組織切片、穿刺活檢以及諸如骨或木乃伊化組織的考古樣本)的樣本。有用的靶樣本的類型包括血液樣本、尿液樣本、精液樣本、淋巴液樣本、腦脊髓液標(biāo)本、羊水樣本、活檢樣本、 針吸活檢樣本、癌樣本、腫瘤樣本、組織樣本、細(xì)胞樣本、細(xì)胞裂解物樣本、粗制細(xì)胞裂解物樣本、法醫(yī)樣本、考古學(xué)樣本、感染樣本、醫(yī)院內(nèi)感染樣本、生產(chǎn)樣本、藥物制劑樣本、生物分子生產(chǎn)樣本、蛋白制劑樣本、脂質(zhì)制劑樣本和/或碳水化合物制劑樣本。1.靶核酸核酸樣本可以由任何具有或被懷疑具有靶核酸的來(lái)源得到。核酸樣本是核酸分子和核酸序列(如靶核酸)的來(lái)源。核酸樣本可以包含RNA或DNA或者兩者。靶核酸也可以是cDNA。另外，mRNA可以被反轉(zhuǎn)錄以形成cDNA，然后該cDNA可以用作靶核酸用于本文中描述的方法中。“靶核酸”或“靶序列”意指在雙鏈或單鏈核酸上的核酸序列。所謂的“核酸” 或“寡核苷酸”或本文中的語(yǔ)法同等形式意指共價(jià)連接在一起的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明中的核酸通常包含磷酸二酯鍵，盡管在某些情況下包括可以具有替代骨架的核酸類似物，包括，例如，磷酰胺(Beaucage, S. L 等人，Tetrahedron 49 1925-63 (1993)，以及其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger, R. L 等人，J. Org. Chem. 35 :3800-03(1970) ；Sprinzl，M 等人，Eur. J. Biochem. 81 :579-89(1977) ；Letsinger, R. L 等人，Nucleic Acids Res. 14: 3487-99(1986) ；Sawai 等人，Chem. Lett. 805(1984) ；Letsinger, R. L 等人，J. Am. Chem. Soc. 110 :4470(1988)；以及 Pauwels 等人，Chemica Scripta 26 141-49 (1986))、硫代磷酸酯(Mag，M 等人，Nucleic Acids Res. 19 :1437-41 (1991)；和第 5644048 號(hào)美國(guó)專利)、二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am Chem. Soc. Ill :2321 (1989) )、0-甲基亞磷酰胺 (0-methylphophoroamidite)鍵(參見(jiàn) Eckstein, Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach, Oxford University Press，1991)，以及月太核酸骨架禾口鍵(Egholm， Μ.，Am. Chem. Soc. 114 :1895-97(1992) ；Meier 等人，Chem. Int. Ed. Engl. 31 :1008 (1992)； Egholm, Μ.，Nature 365 :566-68(1993) ；Carlsson, C 等人，Nature 380 :207 (1996)，所有以上文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入)。其他的核酸類似物包括具有以下骨架的那些核酸類似物帶正電(positive)骨架(Dempcy，R. 0 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 :6097-101 (1995))、 非離子骨架(第 5386023 ；5637684 ；5602240 ；5216141 和 4469863 號(hào)美國(guó)專利；Kiedrowshi φ A, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30 :423(1991) ；Letsinger, R. L.等)κ, J. Am. Chem. Soc. 110 :4470(1988) ；Letsinger, R. L 等人，Nucleoside&Nucleotide 13 :1597(1994)；第 2 禾口 3 章，ASC Symposium Series 580, " Carbohydrate Modifications in Antisense Research “,編者 Y. S. Sanghui 禾口 P. DanCook ；Mesmaeker 等人’ Bioorganic&Medicinal Chem. Lett. 4 :395(1994) Jeffs 等人，J. Biomolecular NMR 34 :17(1994))以及非核糖骨架(包括在第5235033和50；34506號(hào)美國(guó)專利以及ASC Symposium Series 580第6 禾口 7 章，編者 Y. S. Sanghui 禾口 P. Dan Cook "Carbohydrate Modifications in Antisense Research (反義核酸研究中碳水化合物的修飾)”中描述的那些)。包含一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中(參見(jiàn)Jenkins等人，Chem. Soc. Rev. 169-176(1995))；所有參考文獻(xiàn)以引用的方式明確地并入本文。試圖測(cè)定、鑒定、檢測(cè)的任何核酸序列或試圖確定其拷貝數(shù)的任何核酸序列均可以用作靶核酸序列。在本文描述的方法中，可以有多于一種靶核酸序列。如果存在兩種靶核酸序列，它們將被分別稱為第一和第二靶核酸序列。如果存在三種靶核酸序列，它們將被分別稱為第一、第二和第三靶核酸序列，由此類推。本發(fā)明方法中描述的靶核酸可以有相同、 相似或不同的拷貝數(shù)。例如，第一靶核酸是多拷貝數(shù)的核酸序列，而第二靶核酸是單拷貝基因。例如，第一靶核酸可以是端粒重復(fù)序列、mtDNA、rDNA或Alu重復(fù)DNA。例如，第一靶核酸可以是從高拷貝數(shù)mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，而第二靶核酸可以是從低拷貝數(shù)mRNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA。單拷貝基因是每個(gè)單倍體基因組有單個(gè)拷貝的基因。因此單拷貝基因在每一細(xì)胞中有兩個(gè)拷貝。單拷貝基因包括但不限于白蛋白基因或珠蛋白基因。端粒是在真核生物的線性染色體的末端發(fā)現(xiàn)的特化結(jié)構(gòu)。端粒通常由短的串聯(lián)重復(fù)序列組成，帶有對(duì)該生物體特有的端粒酶特異的重復(fù)序列單元。多種生物體的端粒重復(fù)序列是已知的。對(duì)于脊椎動(dòng)物、植物、某些類型的霉菌以及一些原生動(dòng)物而言，該序列是完全的重復(fù)序列。例如，人重復(fù)序列單元是(TTAGGG) η (SEQ ID NO :1)。在其他生物體中，所述重復(fù)序列是不規(guī)則的，例如釀酒酵母菌(Mcharomyces cerevisiae)的重復(fù)序列，其中該序列是可變的G1-3T/C1-3A。在一些真核生物體中，端粒不含短的串聯(lián)重復(fù)序列，但具有用作端粒的序列元件。例如，在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中，端粒是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子HeT-A和TART復(fù)合物，而在R比亞瘧蚊(Anopheles gambiae)中，端粒是一系列復(fù)雜串聯(lián)重復(fù)序列。對(duì)于本發(fā)明的目的，不同結(jié)構(gòu)的端粒被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除所述重復(fù)序列之外，一些端粒的3'端包含單鏈區(qū)，對(duì)于人類其定位于富含G的鏈。該單鏈由(TTAGGG)n(SEQ ID NO 1)重復(fù)序列組成，其中η通常為大約9_35，但η可以更多或或少。如上所述的3'單鏈區(qū)的長(zhǎng)度也可與死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。通常，DNA復(fù)制機(jī)制以5’至3'方向作用，并且通過(guò)使用在鏈合成后分解的短RNA 引物，后隨鏈的合成不連續(xù)地發(fā)生。由于對(duì)先前被RNA引物占有的區(qū)域的完整合成不能獲得線性DNA的3'端序列，因此線性染色體的3'端區(qū)不被復(fù)制。該“末端復(fù)制問(wèn)題”通過(guò)端粒酶-一種端粒特異性核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶——的作用得以解決。端粒酶具有用作延伸端粒的3'端的模板的不可或缺的RNA組分。通過(guò)端粒酶活性引起的反復(fù)延伸導(dǎo)致從端粒酶結(jié)合的RNA模板復(fù)制的端粒重復(fù)序列的產(chǎn)生。在由端粒酶引起的延伸后，由DNA聚合酶引起的后隨鏈合成完成雙鏈端粒結(jié)構(gòu)的形成。在正常的人體細(xì)胞中，端粒酶不表達(dá)或者低水平表達(dá)。因此，每次細(xì)胞分裂端粒縮短50-200bp，直到該細(xì)胞達(dá)到復(fù)制性衰老，在復(fù)制衰老時(shí)細(xì)胞失去增殖能力。細(xì)胞復(fù)制的有限能力通常被稱為Hayflick限制，并且可以為細(xì)胞提供一種對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行計(jì)數(shù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的計(jì)數(shù)機(jī)制，即有絲分裂鐘。相應(yīng)地，在缺乏端粒酶活性的細(xì)胞中端粒酶的活化， 例如通過(guò)由組成型逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子表達(dá)端粒酶或內(nèi)源性聚合酶的活化，使細(xì)胞可保持增殖能力并且導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖。有趣地，這些無(wú)限增殖化細(xì)胞具有短的穩(wěn)定的端粒，同時(shí)最短的端粒得以延長(zhǎng)。這個(gè)現(xiàn)象表明，端粒酶防止短端粒進(jìn)一步縮短并且延長(zhǎng)已經(jīng)降到某一臨界長(zhǎng)度下的端粒。因此，當(dāng)端粒在某個(gè)長(zhǎng)度時(shí)，端粒酶活性的存在似乎不是必要的，但是當(dāng)長(zhǎng)度降到臨界極限下時(shí)，端粒酶活性對(duì)維持端粒完整性變得至關(guān)重要。已經(jīng)很好地證實(shí)，端粒的長(zhǎng)度和完整性對(duì)染色體的正確分離以及細(xì)胞生長(zhǎng)是重要的。例如，多種類型的癌癥的發(fā)生與端粒保持的活化有關(guān)，而細(xì)胞衰老與端粒完整性的喪失有關(guān)。通過(guò)抑制端粒酶活性誘導(dǎo)的端粒的縮短可以導(dǎo)致增殖性衰老以及細(xì)胞凋亡(aiang， X等人，Genes Dev. 2388-99 (1999))。而且，小鼠中端粒酶RNA的基因敲除產(chǎn)生具有發(fā)育缺陷、老化相關(guān)的病理學(xué)以及增加的癌癥易感性的動(dòng)物(Rudolph，K.L.等人，Cell 96 701-12(1999) ；Herrera, E.等人，EMB0J. 18 J950-60 (1999))。相似地，在由編碼端粒酶 RNA 組分的基因的突變引起的先天性角化不良(DKC)的常染色體顯性紊亂中，患者表現(xiàn)出加速的端?？s短并且在16歲的中值年齡時(shí)死亡(最大大約50歲)，通常由于僅次于骨髓衰竭的嚴(yán)重感染。DKC患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)一步表明老化加速，包括過(guò)早白發(fā)和脫發(fā)；皮膚色素沉淀異常；傷口愈合差；嚴(yán)重感染的高風(fēng)險(xiǎn)；以及惡性腫瘤發(fā)生率增高、骨質(zhì)疏松和肺纖維化。 另外，在正常老年個(gè)體的血液DNA中測(cè)量的最短的平均端粒長(zhǎng)度與在DKC患者血液中測(cè)量
11的最長(zhǎng)的平均端粒長(zhǎng)度部分重疊。鑒于端粒在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞衰老中起的作用，期望得到基于端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)老化相關(guān)疾病的發(fā)生率和死亡風(fēng)險(xiǎn)方法。本文所述的方法(包括MMQPCR方法)將提供用于鑒定具有發(fā)生具體的老化相關(guān)疾病例如癌癥和高血壓的增長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的依據(jù)，以便可以對(duì)高危組的個(gè)體給予早期藥物干預(yù)。在本文所述的方法中，可以測(cè)定細(xì)胞中的單條染色體的端粒的拷貝數(shù)。一方面，測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的端粒的平均拷貝數(shù)或平均端粒拷貝數(shù)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，測(cè)量細(xì)胞群體的端粒的平均拷貝數(shù)或平均端?？截悢?shù)。端?？截悢?shù)的變化是端?？截悢?shù)的增加或減少，尤其是平均端?？截悢?shù)的增加或減少。該變化可以與具體的時(shí)間點(diǎn)相關(guān)，即將生物體在時(shí)間tl的端?？截悢?shù)與在稍晚的時(shí)間t2的端粒長(zhǎng)度比較。也可以將端?？截悢?shù)的變化或差異與具體細(xì)胞群體或生物群體的平均端?？截悢?shù)對(duì)照比較。在一些方面，也可以將端?？截悢?shù)的變化或差異與未患病的群體的平均端?？截悢?shù)對(duì)照比較。在某些實(shí)施方案中，對(duì)不同時(shí)期存在的群體來(lái)測(cè)量端粒拷貝數(shù)的變化。盡管，可以測(cè)定所有真核生物的端?？截悢?shù)，然而在一個(gè)方面，測(cè)定的是脊椎動(dòng)物的端粒拷貝數(shù)，所述脊椎動(dòng)物包括但不限于兩棲動(dòng)物，鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物、有蹄類動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物尤其是人類。也可以測(cè)定壽命具有理想特質(zhì)或壽命與疾病的易感性相關(guān)的生物體的端?？截悢?shù)。另一方面，為了評(píng)價(jià)與這些生物體中改變的端粒完整性相關(guān)的死亡風(fēng)險(xiǎn)或疾病的易感性，可以測(cè)定克隆生物體的端粒。端粒核酸序列(例如上述端粒核酸序列)可以用作靶序列。端粒核酸序列或任何其他靶核酸可以是任何長(zhǎng)度，應(yīng)理解越長(zhǎng)的序列特異性越高。在一些實(shí)施方案中，可能希望將樣本核酸分裂或裂解成100-10，000個(gè)堿基對(duì)的片段。在一個(gè)方面，可以使用大致上500 個(gè)堿基對(duì)的片段。可以用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行分裂或裂解，這些方法包括機(jī)械、化學(xué)和酶促方法。因此，可以用超聲、French壓力、剪切或用核酸酶(例如DNase、限制性內(nèi)切酶、RNase等)或化學(xué)裂解劑(例如，酸/哌啶、胼/哌啶、鐵-EDTA復(fù)合物、1，10-菲咯啉-銅復(fù)合物等)對(duì)核酸進(jìn)行處理。2.聚合酶在本文所述的方法中，需要擴(kuò)增酶。例如，在使引物與靶核酸接觸之后，可以用擴(kuò)增酶處理反應(yīng)。擴(kuò)增酶通常是聚合酶，例如DNA聚合酶。本領(lǐng)域中公知多種合適的聚合酶， 包括但不限于iTaq DNA聚合酶、KlenTaq, Tfl聚合酶、DynaZyme等。通常，所有聚合酶均適用于本發(fā)明。在一方面，由于使用具有強(qiáng)3'至5’核酸外切酶活性的聚合酶傾向于除去錯(cuò)配3'端核苷酸，但在一些應(yīng)用中需要所述錯(cuò)配3'端核苷酸阻止或延緩引物二聚體擴(kuò)增，在另一些應(yīng)用中需要所述錯(cuò)配3'端核苷酸進(jìn)行等位基因特異擴(kuò)增，因此聚合酶是缺少 3'至5’核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶或被改造為具有減弱或無(wú)功能性的3'至5’核酸外切酶活性的聚合酶(例如，Pfu (exo-), Vent (exo-), Pyra (exo-)等等)。可用來(lái)最佳地延伸雜交的引物的聚合酶混合物也可適用。在另一方面，對(duì)本發(fā)明有用的聚合酶被制成僅在適合擴(kuò)增的溫度下變得有活性。在擴(kuò)增溫度下失去活性的聚合酶抑制抗體的存在或?qū)⒕酆厦父綦x為使其不可用直到達(dá)到擴(kuò)增溫度時(shí)的形式都是合適的。這些聚合酶制劑使得可在單個(gè)反應(yīng)容器中混合所有組分而防止引發(fā)非靶核酸序列。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，多種試劑可以被添加到反應(yīng)中以增加聚合酶的持續(xù)合成能力，穩(wěn)定聚合酶從而避免失活，減少引物的非特異性雜交或增加復(fù)制效率。此類添加劑包括但不限于二甲基亞砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇或蛋白制劑例如大腸桿菌單鏈DNA結(jié)合蛋白、T4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明膠等。在另一個(gè)方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種核苷酸類似物進(jìn)行具體類型序列的擴(kuò)增，例如富含GC的序列或重復(fù)序列。這些類似物包括但不限于c7-dGTP、羥甲基-dUTP、dITP、7-Deaza-dGTP等。3.引物所謂的“引物”、“引物核酸”、“寡核苷酸引物”、“寡核苷酸探針”或本文使用的語(yǔ)法等同形式表示會(huì)與靶核酸的某一部分雜交的核酸。將本發(fā)明的引物或探針設(shè)計(jì)成基本上與靶序列互補(bǔ)以便發(fā)生所述靶序列和本發(fā)明引物的雜交。在一些方面，可以將引物設(shè)計(jì)成以除了一個(gè)構(gòu)型之外的所有構(gòu)型阻止引物引發(fā)靶核酸延伸。例如，可以將引物組中的引物之一設(shè)計(jì)成通過(guò)在引物的3'端制造錯(cuò)配堿基而阻止引物引發(fā)靶核酸延伸。通過(guò)設(shè)計(jì)和利用此類引物，所述引物仍然能與其互補(bǔ)序列雜交； 然而，其將僅以單一構(gòu)型引發(fā)DNA合成，因此，可預(yù)測(cè)擴(kuò)增子大小并且因此可預(yù)測(cè)擴(kuò)增子的 Tm。例如，本文公開(kāi)了這樣的引物和引物組，其中，第一引物組的一個(gè)引物包含至少一個(gè)與該引物的3'端相鄰的核苷酸，其中，所述核苷酸與靶核酸是錯(cuò)配的、不互補(bǔ)的，但與引物組中另一個(gè)引物的3'端的核苷酸互補(bǔ)。本文還公開(kāi)了這樣的引物和引物組，其中，第一引物組的一個(gè)引物包含至少一個(gè)與該引物的3'端相鄰的核苷酸，其中，所述核苷酸與靶核酸是錯(cuò)配的、不互補(bǔ)的，但與引物組中另一個(gè)引物的3'端的核苷酸互補(bǔ)，其中所述引物組的含有錯(cuò)配的引物的延伸產(chǎn)物可以與所述引物組中的另一個(gè)引物雜交，使得所述另一個(gè)引物可引發(fā)沿所述延伸產(chǎn)物的DNA 合成。為了確保被阻止引物將僅以單一、特異性構(gòu)型引發(fā)，可以對(duì)包括被阻止引物的引物組進(jìn)行設(shè)計(jì)以使所述引物組的引物在被阻止引物中存在的錯(cuò)配堿基的區(qū)域上以完全互補(bǔ)方式重疊?？梢赃M(jìn)行此類設(shè)計(jì)以便阻止引物二聚體形成并且使兩個(gè)引物彼此引發(fā)的能力最小化。當(dāng)靶核酸序列是包含多個(gè)重復(fù)序列的序列例如在端粒中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列(端粒序列)時(shí)，可以利用此類設(shè)計(jì)。本文他處描述了此類方法的實(shí)例，包括下文的實(shí)施例。如本文所述，用于直接擴(kuò)增端粒重復(fù)序列的引物可以包含與靶核酸的第一單鏈雜交的第一引物，以及與靶核酸的第二單鏈雜交的第二引物，其中第一鏈和第二鏈?zhǔn)谴篌w上互補(bǔ)的。當(dāng)引物與它們各自的鏈雜交時(shí)，引物能通過(guò)聚合酶進(jìn)行引物延伸。就是說(shuō)，與靶核酸雜交的引物具有與靶核酸上的核苷酸殘基互補(bǔ)的3'端核苷酸殘基，從而引物可通過(guò)聚合酶延伸。選擇的引物是與重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單元互補(bǔ)的。例如，可以改變至少一個(gè)所述引物的至少一個(gè)核苷酸殘基以與所述引物雜交的至少一個(gè)重復(fù)單元的核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配， 其中，當(dāng)引物彼此雜交時(shí)，所改變的核苷酸殘基還與其他引物的3'端核酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。 錯(cuò)配的包含會(huì)阻止或限制引物延伸以及引物-引物雜交。用于直接擴(kuò)增端粒重復(fù)序列的引物組可以包括這樣的引物組，其中改變第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基以在改變的殘基與所述引物雜交的第一鏈的至少一個(gè)重復(fù)單元的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝缓偷诙锉舜穗s交時(shí)，所改變的核苷酸殘基還與第二引物的3'端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。所改變的核苷酸殘基可以是3'端核苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基，以使得當(dāng)所改變的引物與靶核酸雜交時(shí)，聚合酶可進(jìn)行有效的延伸。例如，所改變的核苷酸殘基可以是3 ‘端核苷酸的至少1個(gè)核苷酸殘基，至少2個(gè)核苷酸殘基， 或至少3個(gè)核苷酸殘基，以使得當(dāng)所改變的引物與靶核酸雜交時(shí)，聚合酶可進(jìn)行有效的延伸。如在本文他處討論的，可以將引物組的引物設(shè)計(jì)成具有相似的Tm以限制不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生并使得可在單個(gè)反應(yīng)體積中擴(kuò)增和檢測(cè)數(shù)個(gè)靶核酸。另外，由于不同生物體的端粒具有不同的重復(fù)單元序列，因此擴(kuò)增具體生物體的端粒將采用對(duì)每個(gè)不同生物體的重復(fù)單元特異的引物。人端粒序列在本文用于舉例說(shuō)明本發(fā)明用于直接擴(kuò)增并定量串聯(lián)重復(fù)的核酸序列的實(shí)施，但本發(fā)明不限于所公開(kāi)的具體實(shí)施方案。還公開(kāi)了使所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的解鏈溫度(Tm)提高至本文所述的方法的其他擴(kuò)增子的解鏈溫度之上的引物。這些引物可以被稱作包含“GC-鉗”的引物?！癎C-鉗”通常是指在在引物3’端的最后5個(gè)堿基內(nèi)G或C堿基的存在，由于G和C堿基更強(qiáng)的結(jié)合，這幫助促進(jìn)在3'端的特異性結(jié)合。通常，在引物3'端的最后5個(gè)堿基應(yīng)當(dāng)避免多于3個(gè)G'或 C'。然而，在本文所述的方法中，包含“GC-鉗”的引物是包含5’標(biāo)簽序列(GC-鉗)的引物，該5’標(biāo)簽賦予所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)比在沒(méi)有GC-鉗的情況下的解鏈溫度更高的解鏈溫度。包含“GC-鉗”的引物的5’標(biāo)簽序列在引物序列的5’端上包含GC-鉗，所述 GC-鉗與靶核酸序列的任何部分都不互補(bǔ)?！癎C-鉗”是可連接到引物的5’端以提高擴(kuò)增子的解鏈溫度的一連串G和C核苷酸。GC鉗可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30 個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。GC 鉗也可以稱為富含GC的區(qū)域或富含GC的標(biāo)簽。在本文所述的方法中可以使用GC-鉗來(lái)提高一個(gè)擴(kuò)增子的Tm。通過(guò)提高所述擴(kuò)增子的Tm，可在高到足以使其他擴(kuò)增子徹底解鏈的溫度下采集熒光信號(hào)，因此使得可在兩個(gè)或多個(gè)不同的溫度下，采集兩個(gè)或多個(gè)不同擴(kuò)增子的熒光信號(hào)?？蓪?duì)GC-鉗引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以用于同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，以使不同引物上的GC-鉗彼此是不相同的，以便防止能導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)停止的發(fā)夾形成或引物二聚體。由于與靶核酸雜交的引物必須能夠進(jìn)行引物延伸，因此對(duì)第一引物和第二引物的改變必須是在重復(fù)單元的非互補(bǔ)核苷酸上。因此，在一方面，當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锒及淖兊臍埢鶗r(shí)，所述改變?cè)谂c重復(fù)單元相鄰的核苷酸位置處。另一方面，所述改變位于不與重復(fù)單元相鄰的核苷酸位置處。通常，在相鄰核苷酸位置處的錯(cuò)配提供所改變的核苷酸和 3'端核苷酸之間最大數(shù)量的配對(duì)堿基或互補(bǔ)殘基，這對(duì)有效地?cái)U(kuò)增短的重復(fù)序列(例如 3-6個(gè)堿基對(duì))是重要的。引物與靶核酸的互補(bǔ)性不需要是完全的。因此，所謂的“互補(bǔ)”或“大體上互補(bǔ)”在本文表示探針與靶核酸足夠互補(bǔ)以在正常反應(yīng)條件下雜交。只要與完全互補(bǔ)的差異不足以完全阻止雜交，那么這種差異就是可允許的。然而，如果改變或突變的數(shù)量足以使在最低嚴(yán)格度雜交條件(如下文所定義的)下都不發(fā)生雜交，那么該序列就與靶序列不互補(bǔ)。盡管引物通常是單鏈的，但是本文描述的核酸可以是單鏈或雙鏈(如所指明的)， 或包含雙鏈或單鏈序列的部分。核酸可以是DNA、RNA或雜合體，在所述雜合體中核酸包含脫氧核苷酸和核苷酸的任意組合以及堿基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷等)的任意組合。在此使用的術(shù)語(yǔ)“核苷” 包括核苷酸，以及核苷、核苷酸類似物和修飾的核苷酸例如氨基修飾的核苷酸。此外，“核苷”包括非天然的類似物結(jié)構(gòu)。因此，例如，各自包含堿基的肽核酸的各個(gè)單元在本文中稱作核苷酸。引物核酸的大小可以變化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的，長(zhǎng)度通常從5至500個(gè)核苷酸變化。例如，根據(jù)用途、所需的特異性以及擴(kuò)增技術(shù)，可以使用10至100個(gè)核苷酸的引物，12至75個(gè)核苷酸的引物，以及15至50個(gè)核苷酸的引物。對(duì)于任何引物對(duì)，引物彼此雜交的能力可以通過(guò)將第一引物的序列與第二引物的序列比對(duì)來(lái)進(jìn)行檢查。所述雜交體的穩(wěn)定性，尤其熱解鏈溫度(Tm)，可以通過(guò)下述方法以及本領(lǐng)域中公知的方法來(lái)測(cè)定。這些方法包括但不限于，最近鄰域熱力學(xué)計(jì)算(Breslauer， Τ.等)κ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :8893-97 (1986) ；Wetmur, J. G. ，Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26 :227-59(1991) ；Rychlik，W.等人，J. NIH Res. 6 :78 (1994))、華萊士規(guī)則判斷 (Suggs,S. V.等人，"Use of Synthetic oligodeoxribonucleotides for the isolation of specific cloned DNAsequences" , Developmental biology using purified genes, D. B. Brown 編輯，第 683-693 頁(yè)，Academic Press, New York (1981))，以及基于 Bolton 和 McCarthy 的 Tm 估算(參見(jiàn) Baldino, F. J.等人，Methods Enzymo 1. 168 :761-77(1989)； Sambrook, J.等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, % 10 章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. Q001))。所有參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用明確地并入本文。當(dāng)分析雜合體穩(wěn)定性時(shí)，要考慮到多個(gè)參數(shù)的影響，所述參數(shù)包括但不限于離子強(qiáng)度、探針長(zhǎng)度、G/C含量以及錯(cuò)配。這些因素的考慮對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的(參見(jiàn)例如，Sambrook，J.，同上)?？梢栽诒疚乃龅姆椒ㄖ惺褂玫囊锟梢杂糜跀U(kuò)增多種靶核酸。單一引物組，例如一個(gè)引物對(duì)，可以用于擴(kuò)增單一靶核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)引物組可以用于擴(kuò)增多個(gè)靶核酸。擴(kuò)增可以對(duì)每個(gè)獨(dú)特引物組分別進(jìn)行或使用引物組的組合在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行(在本領(lǐng)域中通常稱為多重化)。當(dāng)在單一反應(yīng)容器中使用多個(gè)引物組時(shí)，對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以限制不需要的產(chǎn)物形成以及限制每個(gè)引物組的引物之間的干擾。一般的PCR擴(kuò)增反應(yīng)可以根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行，如上所述(參見(jiàn)，例如第 4683195和4683202號(hào)美國(guó)專利)。引物延伸步驟的時(shí)間和溫度將取決于聚合酶、被擴(kuò)增的靶核酸的長(zhǎng)度以及用于擴(kuò)增的引物序列。充分?jǐn)U增靶核酸所需的反復(fù)步驟的數(shù)量將取決于每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效率和靶核酸的起始拷貝數(shù)。如本領(lǐng)域公知的，這些參數(shù)可由技術(shù)人員進(jìn)行調(diào)整以實(shí)現(xiàn)需要的擴(kuò)增水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不受在擴(kuò)增過(guò)程中應(yīng)用的時(shí)間、溫度、緩沖條件以及擴(kuò)增循環(huán)的變化的限制。在使引物與靶核酸雜交中以及在所公開(kāi)的擴(kuò)增反應(yīng)中，測(cè)定通常在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，該嚴(yán)格條件允許在靶核酸存在的情況下形成雜合體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變溫度、鹽濃度、PH、有機(jī)溶劑、離液劑或其他變量的參數(shù)，以控制雜交嚴(yán)格度并且使引物與非特異性靶標(biāo)的雜交最小化(即，通過(guò)使用“熱啟動(dòng)”P(pán)CR或“降落”P(pán)⑶。4.檢測(cè)標(biāo)記為使用所公開(kāi)的組合物和方法幫助測(cè)定靶核酸拷貝數(shù)，檢測(cè)標(biāo)記可以直接并入到擴(kuò)增的核酸中或可以與檢測(cè)分子偶聯(lián)。如本文使用的，檢測(cè)標(biāo)記是可以與擴(kuò)增的核酸直接或間接連接并且直接或間接引起可測(cè)量、可檢測(cè)的信號(hào)的任何分子。在本文所述的方法中， 可以使用單一檢測(cè)標(biāo)記。所謂的“單一檢測(cè)標(biāo)記”用來(lái)表示單一類型的檢測(cè)標(biāo)記。例如， 單一檢測(cè)標(biāo)記可以是本文所述的任何檢測(cè)標(biāo)記，然而在每個(gè)均一體系中僅可使用一種檢測(cè)標(biāo)記。例如，單一檢測(cè)標(biāo)記可以是STOR Green I Qnvitrogen)、異硫氰基熒光素(FITC)、 5，6-羧甲基熒光素或德克薩斯紅(Texas red)，但不是所有這些的組合。因此，SYBRGreen I (Invitrogen)、異硫氰基熒光素(FITC)、5，6-羧甲基熒光素或德克薩斯紅各自為單一檢測(cè)標(biāo)記，例如STOR Green I (Invitrogen)是單一檢測(cè)標(biāo)記，異硫氰基熒光素(FITC)是單一檢測(cè)標(biāo)記，5，6-羧甲基熒光素是單一檢測(cè)標(biāo)記，以及德克薩斯紅是單一檢測(cè)標(biāo)記。下面的實(shí)施例中提供另一個(gè)實(shí)例，其中STOR Green是用于測(cè)定兩種不同靶標(biāo)的拷貝數(shù)的“單一檢測(cè)標(biāo)記”。另外，單一檢測(cè)標(biāo)記也可以被稱作單一、單色的檢測(cè)標(biāo)記?！皢我弧?單色的檢測(cè)標(biāo)記”是僅具有一種顏色的單一檢測(cè)標(biāo)記。例如，單一、單色的檢測(cè)標(biāo)記可以是發(fā)射可以被檢測(cè)的單一顏色的檢測(cè)標(biāo)記。許多用于并入到核酸中或與核酸探針偶聯(lián)的此類標(biāo)記對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。適用于所公開(kāi)的方法中的檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)例是放射性同位素、磷光分子、酶、抗體和配體以及包括熒光染料和熒光標(biāo)記的熒光分子。熒光標(biāo)記可用于擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)。例如，本文所述的方法可以使用在PCR反應(yīng)中優(yōu)先結(jié)合雙鏈核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光染料，由此提供對(duì)產(chǎn)物合成的連續(xù)監(jiān)測(cè)(參見(jiàn)Higuchi，R.等人，Biotechnology 11 1026-1030(1993) ；Morrison, Τ. B.等人，Biotechniques 24:954-962(1998))。合適的熒光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于，SYBR Green I (Invitrogen公司)、 異硫氰酸熒光素爾11^)、5，6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅、肌0(硝基苯-2-氧雜-1， 3-二唑-4-基)、香豆素、丹磺酰氯、若丹明、氨基-甲基香豆素(AMCA)、曙紅、赤蘚紅 (Erythrosin)、BODIP Y 、Cascade Blue 、Oregon Green 、芘、麗絲胺(Iissamine)、 氧雜蒽(xanthene)、吖啶、噁嗪、藻紅蛋白、鑭系元素離子大環(huán)螯合物如quantum dye 、 熒光能量轉(zhuǎn)移染料例如噻唑橙-乙錠異二聚體，以及花菁染料Cy3、Cy3. 5、Cy5, Cy5. 5 和Cy7。其他具體熒光標(biāo)記的實(shí)例包括3-羥基芘5，8，10-三磺酸、5-羥色胺(5-HT)、酸性品紅(Acid Fuchsin)、茜素絡(luò)合酮(Alizarin Complexon)、茜素紅(Alizarin Red), 別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin)、氨基香豆素、蒽基硬脂酸酯(Anthroyl Stearate)、 Astrazon Brilliant Red 4G、 P日 1 〒 R(Astrgizon Orange R) > J^ tl 6B (Astrazon Red 6B)、Astrazon Yellow 7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Auramine)、Aurophosphine、 Aurophosphine G、BA09 (雙氨基苯基噁二唑)、BCECF,硫酸黃連素、雙苯甲酰胺、 BlancophorFFG 溶液、Blancophor SV、BODIPY FU Brilliant Sulphoflavin FF、Calcien Blue、Calcium Green、Calcofluor RW 溶液、Calcofluor White、Calcophor White ABT 溶液、Calcophor White 標(biāo)準(zhǔn)溶液、Carbostyryl> Cascade Yellow、兒茶酷胺、查納克林 (Chinacrine)、柯里膦 O(Coriphosphine 0)、香豆素-鬼筆環(huán)肽、CY3. 18、CY5. 18、CY7、 Dansd- 二(1-Dimethyl Amino Naphaline 5Sulphonic Acid)、 Dansa ( 二氨基萘磺酸)(Diamino Naphtyl Sulphonic Acid)、丹磺酰 NH-CH3 (Dansyl NH-CH3)、二氨基苯基氧基二唑(DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川類化合物(Dipyrrometheneboron Difluoride) > Diphenyl Brilliant Flavine 7GFF、多巴胺、 赤蘚紅 ITC、Euchrysin, FIF(甲醛誘導(dǎo)的熒光)、Flazo Orange、Fluo 3、熒光胺、Fura-2、Genacryl Brilliant Red B、Genacryl Brilliant Yellow 10GF、Genacryl Pink 3G、 Genacryl Yellow 5GF、Gloxalic AcicUGranular Blue、血口卜啉(Haematoporphyrin)、 Indo-U Intrawhite Cf 液體、Leucophor PAF> Leucophor SF、Leucophor WS、麗絲胺羅丹明 B200(RD200)、Lucifer Yellow CH、Lucifer Yellow VS、Magdala Red, Marina Blue、 Maxilon Brilliant Flavin 10GFF,MaxiIon Brilliant Flavin8GFF、MPS(甲基綠焦寧均二苯乙烯)、光神霉素、NBD Amine、Nitrobenzoxadidole、去甲腎上腺素、Nuclear Fast Red、 Nuclear Yellow、Nylosan Brilliant Flavin E8G、噁二唑、太平洋藍(lán)(Pacific Blue)、 苜1J 品紅(Pararosaniline) (Feulgen)、Phorwite AR 溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、 PhorwiteR> Polyazaindacene Pontochrome Blue Black、
卟啉、櫻草靈(Primuline)、Procion Yellow、焦寧(Pyronine)、焦寧 B (Pyronine B)、 Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、Quinacrine Mustard、羅丹明 123、羅丹明 5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B 200、Rhodamine B Extra、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明WT、血清素、Sevron Brilliant Red 2B、Sevron Brilliant Red 4G、Sevron Brilliant Red B、 Sevron Orange、Sevron YellowL、SITS (櫻草靈)、SITS (均二苯乙烯異硫代磺酸)、均二苯乙烯、Snarfl、磺基羅丹明 B Can C,Sulpho Rhodamine G Extra、四環(huán)素、Thiazine Red R、 Thioflavin S>Thioflavin TCN>Thioflavin 5>ThioIyte>Thiozol Orange、Tinopol CBS> True Blue、Ultralite、Uranine B、Uvitex SFC、Xylene Orange 禾口 XRITC。焚光標(biāo)記可得自各種商業(yè)來(lái)源，包括hvitrogen公司，加利福尼亞卡爾斯巴德；Amersham Pharmacia 生物技術(shù)公司，新澤西州皮斯卡塔韋；Molecular Probes，俄勒岡大學(xué)；以及Research Organics，美國(guó)俄亥俄州克里夫蘭市。5.儀器適用于所公開(kāi)的方法和組合物的儀器包括但不限于，ABI Prism7700, Applied Biosystems Division, Perkin Elmer, Fosters City, Calif. , USA ；LightCycler , Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind., USA。多種算法可以用于計(jì)算本文所述的樣本中的靶核酸拷貝數(shù)(參見(jiàn)ABI Prism 7700軟件Version 1. 7 ;Lightcycler 軟件Version 3;通過(guò)引用并入)。測(cè)定拷貝數(shù)可以包括使用具有已知靶核酸拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣本以及由所述標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)數(shù)和閾值循環(huán)(Ct)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常，Ct是PCR循環(huán)或部分PCR循環(huán)，其中由擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光是基線熒光之上的幾個(gè)偏差(Higuchi，R.等人，同上)。MMQPCR提供大約7至8個(gè)數(shù)量級(jí)的線性，這使得可在寬動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)測(cè)量靶核酸的拷貝數(shù)。靶核酸的絕對(duì)拷貝數(shù)可以通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值和樣本的Ct值得到。也可以通過(guò)比較性MMQPCR來(lái)測(cè)定靶核酸拷貝數(shù)。使用已知拷貝數(shù)或恒定拷貝數(shù)的核酸使得可定量樣本中的靶核酸的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物可以是單拷貝基因、已知拷貝數(shù)的核酸，或者當(dāng)定量DNA拷貝數(shù)時(shí)，可以是組成型表達(dá)的管家基因(參見(jiàn)Johnson，Μ. R. Anal. Biochem. 278 :175-184(2000) ；Boulay, J. -L.等人，Biotechniques 27 :228-232 (1999)) 方法本文公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，以及通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm比所述第一 Tm高；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm ;e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增靶核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝(也就是增加靶核酸序列的拷貝數(shù))的技術(shù)。擴(kuò)增可以跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)，產(chǎn)生數(shù)千到數(shù)十億具體DNA序列的拷貝。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)依靠熱循環(huán)，由反復(fù)加熱和冷卻反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)DNA解鏈和核酸的酶復(fù)制的循環(huán)組成。隨著PCR的進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA本身用作擴(kuò)增模板，啟動(dòng)該DNA模板得以指數(shù)擴(kuò)增的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR通常由一系列稱為循環(huán)的重復(fù)溫度變化組成；每個(gè)循環(huán)通常由2-3個(gè)離散的溫度步驟組成。PCR可以以具有3或4個(gè)步驟(每個(gè)步驟處在不同溫度下)的循環(huán)進(jìn)行。 循環(huán)通常始于稱為保溫(hold)的單個(gè)高溫(>90°C)步驟，應(yīng)用該步驟是為了使雙鏈靶核酸序列完全解鏈(即產(chǎn)生單鏈)，接著重復(fù)一組溫度變化(其間發(fā)生靶核酸的擴(kuò)增)，然后進(jìn)行最后的終保溫以進(jìn)行最終產(chǎn)物延伸或短暫保存。使用的溫度和所用溫度在每個(gè)循環(huán)的應(yīng)用的時(shí)長(zhǎng)取決于多個(gè)參數(shù)。這些參數(shù)包括用于DNA合成的酶(如DNA聚合酶)、反應(yīng)中二價(jià)離子和dNTP的濃度、引物的解鏈溫度和擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度。PCR至少包括變性步驟、退火步驟和延長(zhǎng)步驟。延長(zhǎng)步驟也可以稱為延伸步驟。在 PCR中，變性、退火、延伸步驟按順序發(fā)生至少一次(又名單個(gè)“循環(huán)”)，但通常重復(fù)最多達(dá) 40個(gè)循環(huán)。當(dāng)使用的DNA聚合酶需要熱活化時(shí)，在PCR的循環(huán)階段之前先進(jìn)行額外的步驟， 稱為啟動(dòng)(initialization)步驟。每一步都有與其相關(guān)的各自溫度。與每個(gè)步驟相關(guān)的溫度分別被稱為啟動(dòng)溫度、變性溫度、退火溫度、延伸或延長(zhǎng)溫度。啟動(dòng)步驟可以包括將反應(yīng)加熱到90、91、92、93、94、95、96、97或98°C的啟動(dòng)溫度， 所述溫度可以保持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘。只有當(dāng)用于PCR的
DNA聚合酶需要熱活化時(shí)，通常才需要啟動(dòng)步驟。例如，如果正在使用耐高溫的聚合酶，可以使用初始溫度為98°C的啟動(dòng)步驟。變性步驟通常是在PCR重復(fù)循環(huán)中的第一個(gè)步驟，并且包括將反應(yīng)加熱至90、91、 92、93、94、95、96、97 或 98 °C 的變性溫度，保持 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、四、30、31、32、33、34或35秒。變性步驟通過(guò)破壞互補(bǔ)堿基之間的氫鍵使DNA模板解鏈，產(chǎn)生單鏈DNA。退火步驟通常是PCR重復(fù)循環(huán)中的第二步，并且包括將溫度降低至45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 °C 的退火溫度，保持 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 秒以使引物組的引物退火，從而與靶核酸雜交。退火溫度可以比所使用的引物的Tm低約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10°C。當(dāng)引物序列與模板序列極大程度地匹配時(shí)，會(huì)形成穩(wěn)定的DNA-DNA氫鍵。聚合酶結(jié)合引物-模板雜合體，并且開(kāi)始DNA合成。延長(zhǎng)/延伸步驟是核酸聚合酶通過(guò)以5’到3'方向加入與靶核酸互補(bǔ)的dNTP并
18且使dNTP的5’-磷酸基團(tuán)與新生(延伸的)靶核酸鏈的末端3'-羥基縮合，從而合成與靶核酸鏈互補(bǔ)的新核酸鏈的步驟。延伸時(shí)間既取決于所使用的核酸聚合酶，而且取決于要擴(kuò)增的靶核酸的長(zhǎng)度。作為經(jīng)驗(yàn)法則，在最佳溫度下，核酸聚合酶每分鐘聚合一千個(gè)堿基。 在最佳條件下，即如果在每個(gè)延伸步驟中均沒(méi)有限制(由于有限的底物或試劑)，那么靶核酸量會(huì)增加一倍，從而導(dǎo)致特定靶核酸的指數(shù)(幾何)擴(kuò)增。在這個(gè)步驟的延伸溫度取決于所使用的核酸聚合酶。例如，Taq聚合酶具有在75_80°C的最佳活性溫度，并且對(duì)于此酶， 通常使用72 °C的溫度。PCR還可以包括最終延伸步驟。在最后一次PCR循環(huán)之后，最終延伸可以在68、 69、70、71、72、73、74 或 75°C 的最終延伸溫度進(jìn)行 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15分鐘，以確保任何剩余的單鏈DNA均被完全復(fù)制以產(chǎn)生雙鏈DNA產(chǎn)物。PCR還可以包含信號(hào)采集步驟，其中可以測(cè)定檢測(cè)標(biāo)記的量。信號(hào)采集步驟可以在擴(kuò)增靶序列期間進(jìn)行。在某些方面，信號(hào)采集步驟在變性步驟、退火步驟和延伸步驟之后。 信號(hào)采集步驟可以在信號(hào)采集溫度下進(jìn)行。信號(hào)采集溫度可以為任意溫度，并且信號(hào)采集可以在PCR中進(jìn)行一次或多次。當(dāng)如本文所述測(cè)定兩個(gè)或多個(gè)靶核酸的拷貝數(shù)時(shí)，信號(hào)采集溫度對(duì)每個(gè)擴(kuò)增子的檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)應(yīng)是不同的。例如，應(yīng)當(dāng)選擇兩個(gè)或多個(gè)用于信號(hào)采集的溫度，以致第一信號(hào)采集溫度低于第一擴(kuò)增子的Tm，并且第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于第二擴(kuò)增子的Tm。兩個(gè)或多個(gè)信號(hào)采集溫度之間的差可以是3、4、5、6、7、 8、9或IO0C0信號(hào)采集步驟可以在采集溫度下進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或15秒。PCR還可包括最終保溫步驟。最終保溫步驟可以在4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或15°C的最終保溫溫度保持無(wú)限期的時(shí)間。最終保溫步驟可以用于反應(yīng)物的短期保存。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還可包括連續(xù)階段的循環(huán)。每個(gè)連續(xù)階段的循環(huán)可以包括一個(gè)或多個(gè)上述的PCR步驟。每個(gè)連續(xù)階段的循環(huán)也可以稱為PCR “循環(huán)”。對(duì)于每個(gè)PCR循環(huán)， 每個(gè)連續(xù)階段的循環(huán)可以在相同或不同的溫度下進(jìn)行。對(duì)于一個(gè)或多個(gè)PCR循環(huán)，可以運(yùn)行退火溫度改變的PCR。例如，PCR可運(yùn)行共40個(gè)循環(huán)，其中第一階段的循環(huán)的退火溫度相同，然后第二階段的循環(huán)的退火溫度升高，并且第三階段的循環(huán)的退火溫度降低?！熬惑w系”是靶核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)在同一反應(yīng)中發(fā)生的體系。均一體系是在擴(kuò)增靶序列期間中產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的體系。所謂的“擴(kuò)增期間”表示在一個(gè)PCR循環(huán)之后但在后續(xù)的PCR循環(huán)之前。所謂的“擴(kuò)增期間”還指在PCR期間，但在最終保溫步驟之前。相對(duì)拷貝數(shù)可以通過(guò)本文他處所述的方法來(lái)進(jìn)行。例如，本文所述的方法可用于在一組反應(yīng)孔中測(cè)量實(shí)驗(yàn)DNA樣本中的端粒(T)重復(fù)序列的量和在不同孔中測(cè)量單拷貝基因⑶的量(相比于參考DNA)，產(chǎn)生與平均端粒長(zhǎng)度成比例的相對(duì)T/S比值。在一個(gè)方面， 可在S信號(hào)上升到高于基線之前，在早期的循環(huán)中收集T信號(hào)，并且可在使端粒產(chǎn)物完全解鏈、使其信號(hào)處于基線的溫度下收集S信號(hào)。也可將T/S比值的相關(guān)性與通過(guò)Southern雜交測(cè)量的末端限制性片段(TRF)的長(zhǎng)度相關(guān)，以確定拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，其中第一靶核酸序列的拷貝數(shù)比第二靶核酸序列的拷貝數(shù)多，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，以及通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm比所述第一 Tm高；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f) 測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，以及通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm比所述第一 Tm高；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟 (b)至(d)，直到在所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)出所述檢測(cè)標(biāo)記；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm比所述第一 Tm高；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm，其中在每個(gè)所述擴(kuò)增步驟期間，在所述第一信號(hào)采集溫度和所述第二信號(hào)采集溫度下檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記的量；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm，其中第一 Tm和第二 Tm之間的差為至少4攝氏度；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，其中第二引物組中的至少一個(gè)引物在該引物的5’端包含GC-鉗；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸從而形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸從而形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間， 在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ； d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，其中所述第一引物組中的至少一個(gè)引物包含包括A和 T核苷酸的5’序列；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第
一Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ;e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，其中第一引物組的引物的3’端是彼此互補(bǔ)的，并且其中第一引物組的一個(gè)引物是包含至少一個(gè)與該引物的3’端相鄰的錯(cuò)配核苷酸的錯(cuò)配引物， 其中所述核苷酸與靶核酸是不互補(bǔ)的，但是與第一引物組中的另一個(gè)引物的3’端核苷酸是互補(bǔ)的；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度 (Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第
二Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f) 測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，其中第一引物組的一個(gè)引物被阻止引發(fā)第一靶核酸； b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。本文還公開(kāi)了用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，其中該檢測(cè)標(biāo)記是嵌入染料；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二Tm高于所述第一Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。在本文所述的方法的某些方面，第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)度量第一核酸相比于第二核酸的相對(duì)量。在某些方面，可以使用STOR Green I作為唯一熒光染料并使用僅裝備用于單色檢測(cè)的QPCR儀，通過(guò)阻止早期擴(kuò)增模板的擴(kuò)增干擾后期擴(kuò)增模板的擴(kuò)增的策略，以多重QPCR 準(zhǔn)確定量靶序列和參照序列。在某些方面，為通過(guò)MMQPCR定量一組DNA樣本中的兩個(gè)模板， 兩個(gè)條件必須得到滿足。首先，必須找到這樣的PCR條件，從而，對(duì)于所述組中的每個(gè)DNA 樣本，當(dāng)達(dá)到早期擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)閾值時(shí)，后期擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增信號(hào)仍處于基線。第二，后期擴(kuò)增產(chǎn)物必須具有比早期擴(kuò)增產(chǎn)物更高的解鏈溫度，以便可以在低至足以保持后期擴(kuò)增產(chǎn)物為雙鏈、但高至足以使早期擴(kuò)增產(chǎn)物完全解鏈、使其熒光信號(hào)處于基線的溫度下監(jiān)測(cè)后期擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光。通過(guò)設(shè)計(jì)引物以使兩種PCR產(chǎn)物均較小，以及向后期擴(kuò)增產(chǎn)物的引物加入富含GC的5’標(biāo)簽(如GC-鉗)，可以確保后期擴(kuò)增產(chǎn)物具有更高的解鏈溫度。本文所述的方法可用于定量生物樣本中兩種不同模板的水平，其中每種模板在拷貝數(shù)上有差異，但第一種模板和第二種模板的拷貝數(shù)的范圍沒(méi)有重疊。例如，細(xì)胞具有遠(yuǎn)多于單拷貝核基因的拷貝的端粒重復(fù)序列拷貝；同樣的情況適用于mtDNA拷貝與單拷貝基因、rDNA拷貝與單拷貝基因、Alu DNA拷貝與單拷貝基因等。同樣地，在對(duì)mRNA水平的多重逆轉(zhuǎn)錄QPCR(RT-QPCR)的研究中，其目的往往是定量?jī)煞N不同的mRNA種類的水平，每種在拷貝數(shù)上不同，但具有不重疊的拷貝數(shù)范圍。對(duì)于這些其中的每一個(gè)模板對(duì)，當(dāng)較低豐度模板的擴(kuò)增信號(hào)處于基線時(shí)，可以收集較高豐度模板的Ct值；并且較低豐度模板的Ct值可以在使其富含GC的產(chǎn)物處于雙鏈而使高豐度模板的產(chǎn)物完全解鏈且其信號(hào)被消除的高溫下收集。通過(guò)在整個(gè)PCR循環(huán)中收集在兩個(gè)不同溫度下的熒光信號(hào)并單獨(dú)分析這些信號(hào)，可用單一，單色檢測(cè)標(biāo)記獨(dú)立地定量所述兩個(gè)模板中的每一個(gè)模板。迄今為止，由于累積的熒光信號(hào)來(lái)自全部?jī)蓚€(gè)擴(kuò)增子，因此人們認(rèn)為無(wú)法用單一重DNA嵌入染料在多重定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中測(cè)定兩種不同DNA序列的相對(duì)拷貝數(shù)。本文所述的方法提出這樣的策略，即使得兩個(gè)擴(kuò)增子的信號(hào)可被單獨(dú)地收集。當(dāng)?shù)诙U(kuò)增子的信號(hào)仍在基線處時(shí)，在早期循環(huán)中收集第一擴(kuò)增子的循環(huán)閾值(Ct)。在遠(yuǎn)高于第一擴(kuò)增子的解鏈溫度(Tm)、使第一擴(kuò)增子成為單鏈并使其信號(hào)處于基線的溫度下收集第二擴(kuò)增子的循環(huán)閾值(Ct)。對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以使兩個(gè)擴(kuò)增子均較小，并且第二擴(kuò)增子富含GC，從而提高其Tm。作為拷貝數(shù)范圍沒(méi)有重疊的高和低豐度的種類在生物樣本中存在的模板對(duì)是用于此方法的天然靶標(biāo)。即使具有相似拷貝數(shù)的兩個(gè)模板也可以通過(guò)應(yīng)用延遲一個(gè)擴(kuò)增子的擴(kuò)增的引物和熱循環(huán)設(shè)計(jì)加以區(qū)分。本文所述的方法可以用來(lái)測(cè)定人DNA樣本中的相對(duì)端粒長(zhǎng)度。相似拷貝數(shù)方法本文還公開(kāi)了測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，其中第一靶核酸序列的拷貝數(shù)與第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似，所述方法包括a)將第一靶核酸與第一引物組并將第二靶核酸與第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物，b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm) 的第一擴(kuò)增子，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm 的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度下測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并且測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm并且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。當(dāng)?shù)谝话泻怂嵝蛄械目截悢?shù)與第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似時(shí)，PCR的循環(huán)數(shù)或 PCR的各個(gè)步驟可以改變或變化。例如，當(dāng)?shù)谝话泻怂嵝蛄械目截悢?shù)與第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似時(shí)，該方法的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以進(jìn)一步包括至少三個(gè)連續(xù)的階段，其中第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度高于第二階段的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)，其中第二階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度低于第一階段的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)，其中第三階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度低于第一階段的退火溫度且高于第二階段的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在某些方面，當(dāng)應(yīng)用連續(xù)階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，在第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間僅形成第二擴(kuò)增子。在某些方面，當(dāng)應(yīng)用連續(xù)階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，在第二階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間僅形成第一擴(kuò)增子。在某些方面，當(dāng)應(yīng)用連續(xù)階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，在第三階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間形成第一和第二擴(kuò)增子。在某些方面，當(dāng)應(yīng)用連續(xù)階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，在第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間僅形成第二擴(kuò)增子，并且在第二階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間僅形成第一擴(kuò)增子，并且在第三階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間形成第一和第二擴(kuò)增子。PCR的引物組成和各個(gè)溫度也可以根據(jù)靶標(biāo)、引物的Tm以及所使用或產(chǎn)生的擴(kuò)增子和聚合酶而進(jìn)行改變。在某些方面，為了通過(guò)MMQPCR定量?jī)蓚€(gè)相似豐度的模板，將模板之一的擴(kuò)增延遲幾個(gè)循環(huán)。例如，可將一個(gè)引物對(duì)設(shè)計(jì)成在68°C退火，而另一引物對(duì)在50°C退火。在初始 15分鐘的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的活化以及基因組DNA樣本的變性之后，在94°C和68°C之間循環(huán)至少四個(gè)循環(huán)將在第一模板的擴(kuò)增中提供4個(gè)(或更多個(gè))循環(huán)的熱啟動(dòng)，而第二模板不被引發(fā)。接著，在94°C和50°C之間循環(huán)兩個(gè)循環(huán)將繼續(xù)擴(kuò)增第一模板，并且啟動(dòng)第二模板的擴(kuò)增。注意，第二模板的引物可以具有富含GC的5’標(biāo)簽(如GC-鉗)，以賦予它們的PCR產(chǎn)物高解鏈溫度。由于在94°C和50°C之間循環(huán)兩個(gè)循環(huán)足夠合成與這些引物的全長(zhǎng)互補(bǔ)的序列，從而得出，一旦這兩個(gè)循環(huán)完成，則退火溫度可再次提高，并且程序中剩余的循環(huán)可以有與下面方案中的第三階段(參見(jiàn)材料和方法部分)相似的熱循環(huán)譜，在此期間，在每個(gè)循環(huán)中在兩個(gè)不同溫度下收集熒光信號(hào)。在另一個(gè)方面，提供了將一個(gè)模板的擴(kuò)增延遲幾個(gè)循環(huán)的第二種方法，以使兩個(gè)引物對(duì)均可啟動(dòng)產(chǎn)物形成；然后以高至足以使低熔點(diǎn)擴(kuò)增子解鏈但不足以使高熔點(diǎn)擴(kuò)增子解鏈的變性溫度進(jìn)行四個(gè)或更多個(gè)循環(huán)；最后轉(zhuǎn)變?yōu)榕c剩余循環(huán)的第三階段(參見(jiàn)材料和方法部分)相似的熱循環(huán)譜。以降低的變性溫度進(jìn)行循環(huán)的階段使得仍可對(duì)原始模板進(jìn)行線性擴(kuò)增，所述擴(kuò)增原本是要延遲的。此問(wèn)題的解決方案是使用這樣的兩個(gè)引物對(duì)，即具有較低的初始退火溫度(例如50°C)的，但5’標(biāo)簽(如GC-鉗)賦予PCR擴(kuò)增子較高的后續(xù)退火溫度。通過(guò)在94°C至50°C之間循環(huán)兩個(gè)循環(huán)，足以產(chǎn)生初始PCR產(chǎn)物，之后將退火溫度升高到足以防止對(duì)原始DNA模板的任何進(jìn)一步引發(fā)。在一個(gè)方面，所述第一靶核酸在第一核酸中并且所述第二靶核酸在第二核酸中。 在這方面，第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)量度所述第一核酸相比于所述第二核酸的相對(duì)量。在另一方面，第一靶核酸在第一核酸中并且第二靶核酸在第二核酸中。第一靶核酸的拷貝數(shù)量度在第一核酸中的第一靶核酸的非串聯(lián)重復(fù)序列，其中所述非串聯(lián)重復(fù)序列是通過(guò)所述第一弓I物對(duì)獨(dú)立擴(kuò)增的。還公開(kāi)了用于通過(guò)多重定量PCR測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法。第一靶核酸包含串聯(lián)重復(fù)序列并且所述第一靶核酸序列的拷貝數(shù)比所述第二靶核酸序列的拷貝數(shù)多。該方法包括(1)將包含第一靶核酸和第二靶核酸的樣本與第一引物組、第二引物組和嵌入染料接觸，其中第一引物組能PCR擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，其中第一引物對(duì)的第一引物在非3’端處包含錯(cuò)配核苷酸，當(dāng)所述第一引物與所述第一靶核酸的第一鏈雜交時(shí)，所述錯(cuò)配核苷酸與所述第一鏈中的核苷酸不進(jìn)行堿基配對(duì)，并且其中所述第一引物對(duì)的第二引物具有3’核苷酸，當(dāng)所述第二引物與所述第一鏈的PCR轉(zhuǎn)錄物雜交時(shí)，所述3’核苷酸與所述第一核酸的第二鏈的核苷酸不進(jìn)行堿基配對(duì)，但是與所述PCR轉(zhuǎn)錄物中的所述錯(cuò)配核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)，由此通過(guò)重復(fù)的PCR循環(huán)產(chǎn)生的第一擴(kuò)增子具有確定的大小以及所述第一 Tm，并且其中所述第二引物組能擴(kuò)增所述第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm ； (2)通過(guò)包括用于測(cè)量第一和第二擴(kuò)增子中的染料嵌入的第一和第二信號(hào)采集溫度的溫度譜對(duì)樣本進(jìn)行PCR循環(huán)，其中第一信號(hào)采集溫度低于第一 Tm并且所述第二信號(hào)采集溫度高于第一 Tm且低于第二 Tm ； (3)重復(fù)PCR循環(huán)步驟；以及(4)在至少兩個(gè)不同的PCR 循環(huán)中在第一和所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)量染料嵌入所致的嵌入信號(hào)，從而確定第一靶核酸和第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。還公開(kāi)了用于通過(guò)多重定量PCR測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法，其中第一靶核酸序列的拷貝數(shù)與第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似。該方法包括 (1)將包含第一靶核酸和第二靶核酸的樣本與第一引物組、第二引物組和嵌入染料接觸，其中第一引物組能擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且其中第一引物對(duì)和第一靶核酸之間的雜交復(fù)合體具有第一引物Tm，并且其中第二引物組能擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，并且其中所述第二引物對(duì)和所述第二靶核酸的雜交復(fù)合體具有第二引物Tm，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm并且其中所述第一引物Tm高于所述第二引物Tm ； (2)使所述樣本經(jīng)過(guò)預(yù)定數(shù)目的PCR循環(huán)，其中在所述預(yù)定的
24PCR循環(huán)中引物退火溫度高于所述第二引物Tm以阻止所述第二靶核酸的擴(kuò)增；C3)通過(guò)其中引物退火溫度等于或低于所述第二引物Tm的溫度譜對(duì)所述樣本進(jìn)行PCR循環(huán)，借此PCR 擴(kuò)增所述第一靶核酸和所述第二靶核酸，并且其中所述溫度譜包括用于測(cè)量所述第一和第二擴(kuò)增子中所述染料的嵌入的第一和第二信號(hào)采集溫度，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm，并且所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm ； (4)重復(fù)所述PCR循環(huán)步驟；以及( 在至少兩個(gè)不同的PCR循環(huán)中在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)量由所述染料的嵌入產(chǎn)生的嵌入信號(hào)，其中從所述嵌入信號(hào)和所述預(yù)定的PCR循環(huán)數(shù)確定所述第一和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。還公開(kāi)了用于通過(guò)多重定量PCR測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法，其中第一靶核酸序列的拷貝數(shù)與第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似。該方法包括 (1)將包含第一靶核酸和第二靶核酸的樣本與第一引物組、第二引物組和嵌入染料接觸，其中所述第一引物組能擴(kuò)增所述第一靶核酸序列以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且其中所述第一引物對(duì)與所述第一靶核酸之間的雜交復(fù)合體具有第一引物Tm，并且所述第二引物組能擴(kuò)增所述第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，并且其中所述第二引物對(duì)與所述第二靶核酸之間的雜交復(fù)合體具有第二引物Tm，其中所述第二 Tm高于所述第一 Tm且其中所述第一引物Tm高于所述第二引物Tm ；⑵使所述樣本經(jīng)過(guò)第一預(yù)定數(shù)目的PCR循環(huán)，其中在所述預(yù)定的PCR循環(huán)中引物的退火溫度等于或低于所述第一引物 Tm,從而擴(kuò)增所述第一靶核酸和所述第二靶核酸；(3)使所述樣本經(jīng)過(guò)第二預(yù)定數(shù)目的PCR 循環(huán)，其中變性溫度低于所述第二 Tm，從而阻止所述第二靶核酸的進(jìn)一步擴(kuò)增；(4)通過(guò)其中引物退火溫度等于或低于所述第二引物Tm的溫度譜對(duì)所述樣本進(jìn)行PCR循環(huán)，借此PCR 擴(kuò)增所述第一靶核酸和所述第二靶核酸，并且其中所述溫度譜包括用于測(cè)量所述第一和第二擴(kuò)增子中所述染料的嵌入的第一和第二信號(hào)采集溫度，其中所述第一信號(hào)采集溫度低于所述第一 Tm并且所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm ； (5)重復(fù)所述PCR循環(huán)步驟；以及(6)在至少兩個(gè)不同的PCR循環(huán)中在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)量由所述染料的嵌入產(chǎn)生的嵌入信號(hào)，其中從所述嵌入信號(hào)和所述第二預(yù)定數(shù)目的PCR循環(huán)確定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。在本文所述的方法的某些方面中，第二樣本可以用作測(cè)定拷貝數(shù)的參照。該方法還包括至少一個(gè)參照樣本、所述第一引物對(duì)和所述第二引物對(duì)以及所述嵌入染料，所述參照樣本包含含有已知拷貝數(shù)的所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的參照核酸；其中所述第二樣本經(jīng)過(guò)與所述第一樣本相同的PCR條件并且其中將所述第二樣本在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度下的嵌入信號(hào)與在所述第一樣本中在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度下的嵌入信號(hào)相比，從而提供所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的絕對(duì)拷貝數(shù)的指示。在某些方面，該方法包括(1)在存在嵌入雙鏈DNA中后會(huì)發(fā)熒光的任何單一檢測(cè)標(biāo)記的情況下，使包含所述第一靶核酸的樣本與第一引物組并將所述第二靶核酸與第二引物組接觸，其中所述第一引物組能擴(kuò)增所述第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm)的第一擴(kuò)增子，并且所述第二引物組能擴(kuò)增所述第二靶核酸以形成具有第二 Tm的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm充分高于所述第一 Tm，從而確保在所述第二擴(kuò)增子還沒(méi)有開(kāi)始解鏈的溫度下使所述第一擴(kuò)增子完全解鏈；( 通過(guò)包括用于測(cè)量所述第一和第二擴(kuò)增子的所述染料嵌入的第一和第二信號(hào)采集溫度的溫度譜對(duì)所述樣本進(jìn)行重復(fù)PCR循環(huán)，其中所述第一信號(hào)采集溫度充分低于所述第一擴(kuò)增子還沒(méi)有開(kāi)始解鏈的所述第一 Tm，并且所述第二信號(hào)采集溫度充分高于所述第一擴(kuò)增子完全解鏈的所述第一 Tm并且充分低于所述第二擴(kuò)增子還沒(méi)有開(kāi)始解鏈的第二 Tm;以及C3)在使所述第一信號(hào)可穿過(guò)所述第二信號(hào)仍在基線處的循環(huán)數(shù)的檢測(cè)閾值的一組條件下，在至少兩個(gè)不同的PCR循環(huán)中在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)量所述染料的嵌入信號(hào)，從而確定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。試劑盒上文所述的材料以及其他材料都可以以任何適當(dāng)組合的形式包裝在一起作為用于實(shí)施或幫助實(shí)施所公開(kāi)的方法的試劑盒。對(duì)在給定的試劑盒中的試劑盒組分進(jìn)行設(shè)計(jì)并使其適于一起用于所公開(kāi)的方法是有用的。例如，公開(kāi)了用于測(cè)定一個(gè)或多個(gè)靶核酸的拷貝數(shù)的試劑盒，該試劑盒包括一種或多種試劑組合物以及一種或多種組分或試劑以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)靶核酸的拷貝數(shù)。例如，所述試劑盒可以包括一種或多種試劑組合物以及一個(gè)或多個(gè)引物組、檢測(cè)標(biāo)記、核酸聚合酶或組合。另一種形式的試劑盒可以包含多種試劑組合物。所述試劑盒也可以包含例如，核苷酸、緩沖液、連接酶、開(kāi)環(huán)探針、缺口寡核苷酸(gap oligonucleotide)或組合。公開(kāi)了可以用于此類方法的試劑盒。所述試劑盒可以至少包括用于擴(kuò)增第一靶核酸和第二靶核酸的第一和第二 PCR引物對(duì)。此類組分可以在適合用于PCR擴(kuò)增儀的第一容器中。在一些方面，將測(cè)試樣本加入到該容器中，并且根據(jù)所公開(kāi)的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述試劑盒還可以包括用于進(jìn)行PCR的一種或多種或所有組分，包括三磷酸脫氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphate)，熱穩(wěn)定DNA聚合酶和檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)方面，所述試劑盒可以包含同樣適用于PCR儀的第二容器，所述第二容器包含第二樣本(包含含有已知拷貝數(shù)的第一靶核酸和所述第二靶核酸的參照核酸)并任選地包含進(jìn)行PCR所需的其他組分(包括第一和第二引物對(duì)和嵌入染料)。所述第二容器經(jīng)受與第一容器樣本同樣的PCR條件。第二容器提供已知拷貝數(shù)的第一靶核酸和第二靶核酸的參照嵌入信號(hào)，從而有助于確定測(cè)試樣本中第一靶核酸和所述第二靶核酸的絕對(duì)拷貝數(shù)。包含具有不同拷貝數(shù)的第一和第二靶核酸的參照核酸的其他容器也可以包括在試劑盒中。此類容器提供其他的嵌入信號(hào)，所述信號(hào)提供在絕對(duì)拷貝數(shù)比值的范圍內(nèi)不同的參照點(diǎn)。當(dāng)一個(gè)檢測(cè)樣本中的第一和第二靶核酸的拷貝數(shù)可以在一個(gè)寬范圍內(nèi)變化時(shí)，此類其他容器是特別有用的。還公開(kāi)了包括適合用于PCR儀的第一容器的試劑盒，其中所述第一容器包含含有已知拷貝數(shù)的第一靶核酸和第二靶核酸的參照核酸。所述試劑盒還可以包含至少一個(gè)其他容器，所述其他容器包含相比于所述第一容器的參照核酸具有不同拷貝數(shù)的第一和第二靶核酸的第二參照核酸。所述容器任選地含有嵌入染料以及PCR需要的其他組分。此類試劑盒可用于標(biāo)準(zhǔn)化一種或多種不同參照核酸的由PCR儀產(chǎn)生的的嵌入信號(hào)。系統(tǒng)公開(kāi)了可用于實(shí)施或幫助實(shí)施所公開(kāi)的方法的系統(tǒng)。還公開(kāi)了用于生產(chǎn)試劑組合物的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包含制造品例如結(jié)構(gòu)、機(jī)器、設(shè)備等以及組合物、化合物、材料等等的組合。被公開(kāi)的或從公開(kāi)的內(nèi)容明顯可知的此類組合被涵蓋。例如，被公開(kāi)并且被涵蓋的是包含固體支持物和試劑組合物的系統(tǒng)。
數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和電腦控制公開(kāi)了用于所公開(kāi)的方法或由所公開(kāi)的方法產(chǎn)生或從所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通常是在組合物或媒介中收集、組織、存儲(chǔ)和/或具體表現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以電子形?例如在RAM中或在磁盤(pán)儲(chǔ)存器上)存儲(chǔ)的目標(biāo)指紋是一種類型的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。所公開(kāi)的方法或其任何部分或其制劑因此可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制來(lái)控制、管理或輔助。此類計(jì)算機(jī)控制可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的過(guò)程或方法來(lái)完成，可使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并且可以使用計(jì)算機(jī)程序。此類計(jì)算機(jī)控制、計(jì)算機(jī)控制的過(guò)程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)以及計(jì)算機(jī)程序被涵蓋，并且應(yīng)當(dāng)理解為在本文中被公開(kāi)。實(shí)施例實(shí)施例1研究對(duì)象通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟直接從血液樣本中提取基因組DNA，并且在4°C以大約lOOng/yL 的濃度長(zhǎng)期貯存于TE-4 (IOmM Tris-HCl, 0. ImMEDTA, pH值7. 5)中。在臨開(kāi)始QPCR運(yùn)行之前，將DNA儲(chǔ)液稀釋到純水中。來(lái)自95個(gè)猶他州個(gè)體(47名女性和48名男性，年齡范圍為 5-94歲)的樣本是在我們先前的描述通過(guò)單重定量PCR測(cè)量端粒長(zhǎng)度的文章中分析的樣本 (Cawthon,R. M. (2002)Telomere measurement by singleplex quantitative PCR. Nucleic Acids Res, 30, e47)。單色多重定量PCR (MMQPCR)通過(guò)將15 μ L主混合物(master mix)的小份加入到與Bio-fcid公司MyiQ單色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)兼容的96孔板的每個(gè)反應(yīng)孔中建立PCR反應(yīng)，然后加入10 μ L的各個(gè)實(shí)驗(yàn) DNA樣本(含有約20ng稀釋于純水中的DNA)，使得每個(gè)反應(yīng)終體積為25微升。通過(guò)系列稀釋制備了跨度為81倍DNA濃度范圍的五種濃度的參照DNA樣本(“標(biāo)準(zhǔn)DNA”)，并將其在這項(xiàng)研究中在每個(gè)96孔板中進(jìn)行一式兩份的分析；這些反應(yīng)提供了用于生成用于相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)DNA樣本均進(jìn)行一式三份的測(cè)定。PCR 中試劑的最終濃度分別 0. 75 X SYBR SYBR Green I (Invitrogen), IOmM Tris-HCl pH 8. 3,50mM KCl, 3mM MgCl2，0. 2mM 各 dNTP，ImM DTT 禾口 IM 甜菜堿 (U. S. Biochemicals)。每個(gè) 25 μ L 反應(yīng)加入 0. 625U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(Applied Biosystems Jnc.)。對(duì)于多重QPCR，在主要混合物中，端粒引物對(duì)telg和tele (各自最終濃度為900nM)與白蛋白引物對(duì)albu和albd(各自最終濃度為900nM)或與β-珠蛋白引物對(duì)tibgu和tibgd(各自最終濃度為500ηΜ)結(jié)合。所有引物序列和其設(shè)計(jì)依據(jù)在結(jié)果部分
全A屮
口 QQ ο熱循環(huán)譜是第1階段95°C 15分鐘；第2階段94°C 15秒、49°C 15秒，2個(gè)循環(huán)； 以及第3階段94°C 15秒、62°C 10秒、74°C 15秒(信號(hào)采集)、84°C 10秒、88°C 15秒(信號(hào)采集)，32個(gè)循環(huán)。在74°C的讀數(shù)提供擴(kuò)增端粒模板的Ct值；在88°C的讀數(shù)提供擴(kuò)增單拷貝基因模板的Ct值。熱循環(huán)和原始數(shù)據(jù)收集完成之后，MyiQ軟件(Bio-Rad iQ52. 0標(biāo)準(zhǔn)版光學(xué)系統(tǒng)軟件)用于產(chǎn)生每個(gè)板的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，一條是端粒信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一條是scg信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)DNA樣本的T/S比值為T(mén)除以S，T為與實(shí)驗(yàn)樣本的端粒模板的拷貝數(shù)匹配的標(biāo)準(zhǔn)DNA以ng計(jì)的量，S為與實(shí)驗(yàn)樣本的scg拷貝數(shù)匹配的標(biāo)準(zhǔn)DNA以ng計(jì)的量。由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本均進(jìn)行一式三份的測(cè)定，因此每個(gè)樣本獲得三個(gè)T/S結(jié)果；在給定運(yùn)行中樣品的最終報(bào)告結(jié)果為所述三個(gè)T/S值的平均值。平均T/S被預(yù)期與每個(gè)細(xì)胞的平均端粒長(zhǎng)度成正比。T/S > 1. 0的樣本的平均端粒長(zhǎng)度比標(biāo)準(zhǔn)DNA的平均端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)；T/S < 1. 0的樣本的平均端粒長(zhǎng)度比標(biāo)準(zhǔn)DNA的平均端粒長(zhǎng)度短。測(cè)定平均末端限制性片段(TRF)長(zhǎng)度如前人所述測(cè)定平均TRF長(zhǎng)度，一式兩份(Cawthon, R. M. (2002) Nucleic Acids Res, 30, e47)。簡(jiǎn)言之，用HaeIII限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA，并且將所消化的樣本與DNA 大小標(biāo)準(zhǔn)物混合，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行印跡到尼龍膜上的Southern印跡。在將印跡與放射性端粒寡核苷酸探針(TTAGGG)7(SEQ ID NO 1)雜交并且獲取端粒拖影圖像后， 剝離印跡，并且將印跡與對(duì)DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物特異的放射性探針雜交。然后將大小標(biāo)準(zhǔn)物圖像和端粒拖尾圖像疊加以定位端粒拖尾內(nèi)大小間隔的位置。然后以Σ (ODi)/Σ (ODiZli)計(jì)算平均TRF長(zhǎng)度。其中ODi是間隔i的背景之上的總放射性，Li是以堿基對(duì)計(jì)的i的平均長(zhǎng)度。結(jié)果從端粒串聯(lián)六聚體重復(fù)序列擴(kuò)增固定長(zhǎng)度的產(chǎn)物的引物因?yàn)橐锏慕Y(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目隨著平均端粒長(zhǎng)度的增加而增加，因此可以通過(guò)使用與端粒六聚體重復(fù)序列雜交的引物進(jìn)行定量PCR來(lái)測(cè)量相對(duì)平均端粒長(zhǎng)度。我們的用于通過(guò)singleplex QPCR(I)測(cè)量端粒長(zhǎng)度的原始tell和tel2引物都能在沿著端粒DNA的串聯(lián)重復(fù)序列的多個(gè)位點(diǎn)處引發(fā)。因此，它們產(chǎn)生一系列大小不同的產(chǎn)物，它們中的一些在高到足以與scg擴(kuò)增子的解鏈曲線有重疊的溫度解鏈。因此，當(dāng)tell和tel2是端粒引物時(shí)， 在沒(méi)有任何來(lái)自雙鏈端粒PCR產(chǎn)物的干擾信號(hào)(如成功的MMQPCR需要的)的情況下，在高溫下不可能獲得來(lái)自scg雙鏈擴(kuò)增子的STOR Green I熒光信號(hào)的“干凈(clean)”讀數(shù)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一對(duì)端粒引物，telg,ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGT TTGGGTTAGTGTSEQ ID NO : 知telc，TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA SEQ ID NO :3)，其產(chǎn)生短的、固定長(zhǎng)度的產(chǎn)物(圖1)。只有telg能夠沿天然端粒DNA序列引發(fā)DNA的合成。tele引物在其3'端的錯(cuò)配堿基阻止tele引物引發(fā)天然端粒DNA。然而， tele能沿telg引物延伸產(chǎn)物的各種片段雜交，并且正是這些雜交中的一個(gè)構(gòu)型可引發(fā)DNA 合成，由此實(shí)現(xiàn)單一、固定長(zhǎng)度的產(chǎn)物的產(chǎn)生。這是通過(guò)在telg的從3'端的第三個(gè)堿基處引入核苷酸變化來(lái)實(shí)現(xiàn)，以致telg和tele引物的最后三個(gè)堿基完全互補(bǔ)地重疊。這種重疊不足以使天然telg和tele引物有效地彼此引發(fā)，因此在進(jìn)行端粒長(zhǎng)度定量的循環(huán)的范圍內(nèi)，引物二聚體的形成是不可檢測(cè)的。然而，當(dāng)telg延伸產(chǎn)物與tele雜交時(shí)，這三個(gè)堿基的重疊是tele 3，端可以有效引發(fā)DNA合成的唯一位點(diǎn)。參見(jiàn)例如第2003/0162266 號(hào)美國(guó)專利公開(kāi)。因此，所得的PCR產(chǎn)物是固定長(zhǎng)度的，并且比用于產(chǎn)生該產(chǎn)物的兩個(gè)引物的總長(zhǎng)度短三個(gè)堿基。這種產(chǎn)物的銳解鏈曲線(圖2的綠色曲線)與特定的、固定長(zhǎng)度的產(chǎn)物形成一致，并且6%凝膠中的瓊脂糖凝膠電泳僅顯示預(yù)期的79bp產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未示出)。 圖2也證明端粒PCR產(chǎn)物的解鏈曲線與白蛋白PCR產(chǎn)物的解鏈曲線(圖2的藍(lán)色曲線)很好地分離，使得可在使端粒PCR產(chǎn)物完全解鏈的溫度下讀取來(lái)自白蛋白的STOR Green I信號(hào)。對(duì)單拷貝基因(白蛋白和β-珠蛋白)的引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)引物以便scg擴(kuò)增子與端粒擴(kuò)增子相比在高得多的溫度下解鏈。然后可在這樣的溫度下采集來(lái)自SCg擴(kuò)增子的熒光信號(hào)，即所述溫度高至足以使端粒擴(kuò)增子完全解鏈，從而消除其對(duì)信號(hào)的貢獻(xiàn)，但低到足以保持SCg擴(kuò)增子為雙鏈并且因此能結(jié)合STOR Green I。用于擴(kuò)增scg 白蛋白的引物是 albu :CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGaaatgctgcac agaatccttg SEQ ID NO :4) ；^P albd GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaaaagcatggtcgcctg tt SEQ ID NO :5)。預(yù)期的產(chǎn)物大小是98bp。用于擴(kuò)增scg β -珠蛋白的引物是tibgu :CGG CGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGcttcatccacgttcaccttg SEQ ID NO 6)；以及 hbgd :GCCCGGCCC GCCGCGCCCGTCCCGCCGgaggagaagtctgccgttSEQ ID NO :7)。預(yù)期的產(chǎn)物大小是 106bp。大寫(xiě)堿基是賦予所生成的PCR產(chǎn)物非常高的解鏈溫度的非模板化5’標(biāo)簽序列。請(qǐng)注意，白蛋白引物的5’標(biāo)簽序列與β-珠蛋白引物的5’標(biāo)簽序列相同。還要注意，在每個(gè)引物組中的兩個(gè)富含GC的5’標(biāo)簽序列彼此差異很大；如果它們是相同的，那么可能在PCR過(guò)程中出現(xiàn)停止擴(kuò)增的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。當(dāng)通過(guò)變性梯度 疑膠電泳法(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (2) 篩選基因的點(diǎn)突變時(shí)，為提高PCR產(chǎn)物的一端的解鏈溫度而在PCR引物的5’端添加GC-鉗的是慣用做法。通過(guò)將5’ GC鉗附接至用于擴(kuò)增scg的兩種引物并且保持靶向的基因組序列較短，會(huì)產(chǎn)生具有非常高的解鏈溫度的PCR產(chǎn)物。圖2表明雙GC鉗的白蛋白PCR產(chǎn)物的 Tm高于91°C。6%凝膠腫的瓊脂糖凝膠電泳僅顯示預(yù)期大小的產(chǎn)物。對(duì)于雙GC鉗的β-珠蛋白PCR產(chǎn)物，也獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。5’ GC-鉗也保證用于擴(kuò)增scg的兩個(gè)引物對(duì)其擴(kuò)增子的Tm均比端粒PCR產(chǎn)物的Tm 高。這種設(shè)計(jì)的好處在下面討論(參見(jiàn)溫度變化譜和循環(huán)設(shè)計(jì)部分)。使用OligoAnalyzer 程序(www, idtdna. com)的分析表明，所有四個(gè)scg引物(albu、albd、hbgu和hbgd)在本研究使用的緩沖液組合物中的Tm均大于84°C。熱循環(huán)譜和循環(huán)設(shè)計(jì)在熱循環(huán)方案的第一階段，AmpliTaq Gold DNA聚合酶被熱激活，并且基因組DNA 樣本被變性。在第二階段，由于在那些引物中存在有意引入的防止引物二聚體PCR產(chǎn)物(1) 的形成和擴(kuò)增的突變，因此需要較低溫度的兩個(gè)循環(huán)以有效退火并且延伸端粒引物。在第三階段，重復(fù)循環(huán)始于變性、退火和伴有在傳統(tǒng)QPCR中常見(jiàn)的信號(hào)采集的延伸步驟。之后進(jìn)行兩個(gè)非常規(guī)的步驟在84°C孵育10秒和在88°C孵育15秒(伴有第二次信號(hào)采集)。由于scg引物的高退火溫度(高于84°C)和Taq DNA聚合酶在84°C仍保持強(qiáng)活性的能力G)，加熱至84°C使早期擴(kuò)增端粒產(chǎn)物解鏈，釋放出DNA聚合酶(其結(jié)合雙鏈， 但不結(jié)合單鏈DNA ；參考文獻(xiàn)3)來(lái)針對(duì)scg PCR產(chǎn)物，其中進(jìn)行DNA合成。在傳統(tǒng)的多重PCR中，由于早期產(chǎn)物與DNA聚合酶的上述結(jié)合，高濃度的早期擴(kuò)增產(chǎn)物往往抑制較低豐度模板的后續(xù)擴(kuò)增。通常建議的解決方案是限制較高豐度的靶序列的引物濃度，以便形成更少的產(chǎn)物，使得足夠的DNA聚合酶未被結(jié)合，自由地繼續(xù)復(fù)制較低豐度的模板。但降低引物濃度通常導(dǎo)致降低的PCR效率，甚至完全不擴(kuò)增靶序列。降低的效率也造成重復(fù)之間Ct值的更大變化。MMQPCR中在84°C的孵育步驟消除了限制用于更高豐度模板的引物濃度的需要，從即使是高濃度的相應(yīng)PCR產(chǎn)物中釋放聚合酶，以便可以有效率地合成第二產(chǎn)物。
29
第二信號(hào)采集步驟的進(jìn)一步加熱到88°C確保端粒PCR產(chǎn)物完全解鏈，并且不能干擾從積累的scg擴(kuò)增子中采集上升的STOR Green I信號(hào)。MMQPCR方法在端粒長(zhǎng)度的自然范圍內(nèi)的有效性圖3顯示在兩個(gè)不同溫度(74°C和88°C )收集的之前顯示具有高、中或低平均端粒長(zhǎng)度(大約三倍范圍的端粒長(zhǎng)度)的三個(gè)參照人基因組DNA樣本的擴(kuò)增曲線?；趫D2 中所示的解鏈曲線，在74°C的讀數(shù)應(yīng)當(dāng)同時(shí)檢測(cè)端粒和白蛋白PCR產(chǎn)物，并且在88°C的讀數(shù)應(yīng)當(dāng)僅檢測(cè)白蛋白PCR產(chǎn)物。然而，由于在每個(gè)DNA樣本中，白蛋白模板的拷貝數(shù)遠(yuǎn)低于端粒模板的拷貝數(shù)，因此全部在相應(yīng)的白蛋白信號(hào)仍在基線處時(shí)收集的74°C的Ct值僅是端粒擴(kuò)增的度量(已經(jīng)證實(shí)，在沒(méi)有端粒引物的反應(yīng)中，無(wú)論在74°C還是在88°C收集的單拷貝基因信號(hào)均在基本上相同的循環(huán)數(shù)上升到基線之上)。即使具有最短的端粒(大約 l，670bp)的樣本，并因此最右移的擴(kuò)增曲線(藍(lán)色曲線)，也在白蛋白基因的擴(kuò)增信號(hào)仍在基線處時(shí)的循環(huán)數(shù)處穿過(guò)閾值。在來(lái)自5-94歲受試者的95個(gè)全血DNA模板的本研究中， 當(dāng)收集對(duì)應(yīng)的端粒信號(hào)的Ct時(shí)，每個(gè)樣本的scg擴(kuò)增信號(hào)處于基線。端粒和單拷貝基因的獨(dú)立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4顯示對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DNA確定的兩條獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(一條是端粒重復(fù)序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一條是scg白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，所述曲線通過(guò)在循環(huán)方案的第3階段的每個(gè)循環(huán)中在兩個(gè)不同溫度(對(duì)于端粒信號(hào)為74°C，對(duì)于白蛋白信號(hào)為88°C)下采集的STOR Green I 熒光信號(hào)而確定。在本研究中，對(duì)于每個(gè)不同的PCR反應(yīng)板，均使用相同的DNA樣本生成兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。在DNA濃度對(duì)循環(huán)閾值的半對(duì)數(shù)圖中，兩個(gè)曲線在81倍DNA濃度范圍內(nèi)均是線性的。端粒和白蛋白擴(kuò)增的PCR效率均大于90%，并且近似相等。對(duì)于每個(gè)DNA濃度的這一具體的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本，在循環(huán)中白蛋白的Ct均比端粒重復(fù)序列的Ct出現(xiàn)晚大約6個(gè)循環(huán)。在圖3中，將基本相等量的DNA加入反應(yīng)中(基于ODaitlUV分光光度計(jì)讀數(shù))，以致在74°C觀察到的Ct值的差異僅反應(yīng)端粒長(zhǎng)度的差異(沒(méi)有來(lái)自輸入DNA的量的變化的影響)。(在一般實(shí)施中，沒(méi)有必要精確地匹配實(shí)驗(yàn)樣本的輸入DNA，因?yàn)閷信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化至S 信號(hào)的程序解決了這個(gè)問(wèn)題。寬范圍的輸入DNA量是可接受的，只要T和S信號(hào)兩個(gè)都在 T和S標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)；參見(jiàn)圖4)。由于在88°C下僅收集到單拷貝基因(白蛋白基因) 信號(hào)，因此預(yù)期在88°C采集的三個(gè)擴(kuò)增曲線幾乎完全重疊。下圖顯示，當(dāng)白蛋白信號(hào)仍在基線處時(shí)，可以在74°C收集端粒信號(hào)的循環(huán)閾值。(已經(jīng)確認(rèn)，在沒(méi)有端粒引物的反應(yīng)中，無(wú)論在74°C還是在88°C，單拷貝基因信號(hào)均在基本相同的循環(huán)數(shù)時(shí)升高至基線之上。還已經(jīng)確認(rèn)，在沒(méi)有單拷貝基因基因的反應(yīng)中，在88°C讀數(shù)時(shí)，端粒擴(kuò)增信號(hào)在整個(gè)PCR運(yùn)行中是完全平坦的并且為零，如基于圖2所示的解鏈曲線圖形會(huì)預(yù)見(jiàn)的)。由于Bio-Rad MyiQ軟件可以一次僅顯示一個(gè)溫度的擴(kuò)增曲線，因此74°C和88°C讀數(shù)的顯示已經(jīng)被疊加。平均TRF長(zhǎng)度和相對(duì)T/S比值之間的相關(guān)性為了檢驗(yàn)MMQPCR方法對(duì)端粒長(zhǎng)度測(cè)量的有效性，將通過(guò)MMQPCR —式三份地測(cè)量的來(lái)自95個(gè)5-94歲個(gè)體的全血DNA樣本中的相對(duì)端粒長(zhǎng)度(平均T/S比值)與通過(guò)常規(guī)Southern雜交的方法(1)測(cè)量的這些相同DNA樣本的平均末端限制性片段(TRF)長(zhǎng)度進(jìn)行了比較。圖5顯示了通過(guò)這些非常不同的技術(shù)測(cè)量的相對(duì)端粒長(zhǎng)度的強(qiáng)相關(guān)性(R2 = 0.844)。這種相關(guān)性高于以前所報(bào)告(1)的通過(guò)單重QPCR在這些相同樣本中測(cè)量的T/S比值與它們的平均TRF長(zhǎng)度的相關(guān)性(R2 = 0. 677)。T/S比值測(cè)量的重現(xiàn)性為了研究通過(guò)MMQPCR的T/S測(cè)量的測(cè)定內(nèi)重現(xiàn)性，對(duì)在MMQPCR測(cè)定的單次運(yùn)行中一式三份地測(cè)定的95個(gè)DNA樣本中的每個(gè)樣本，使用白蛋白作為scg測(cè)定T/S變異系數(shù) (標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值)。變異系數(shù)的測(cè)定內(nèi)幾何平均數(shù)為5. 22%。為了檢驗(yàn)測(cè)定內(nèi)重現(xiàn)性，在另一天在相同95個(gè)DNA樣本中重復(fù)T/S測(cè)量(還是一式三份)，注意，具體MyiQ PCR 儀和每個(gè)DNA樣本占有的反應(yīng)孔位置在所述兩次獨(dú)立運(yùn)行的測(cè)試中是不同的。圖6顯示通過(guò)第一次運(yùn)行和第二次運(yùn)行確定的平均T/S比值之間的強(qiáng)相關(guān)性(R2 = 0. 91)。如所預(yù)期的，通過(guò)這些數(shù)據(jù)的線性回歸線的斜率接近一致，并且y軸截距接近0。確定了兩次獨(dú)立運(yùn)行的95對(duì)平均T/S值各自的變異系數(shù)。所述變異系數(shù)的測(cè)定內(nèi)幾何平均數(shù)為3. 13%。T/S比值與所使用的單拷貝基因無(wú)關(guān)為了測(cè)試使用β-珠蛋白代替白蛋白作為scg是否可能改變表觀相對(duì)端粒長(zhǎng)度， 在用珠蛋白引物替換白蛋白引物的兩次獨(dú)立運(yùn)行中，重復(fù)測(cè)量95個(gè)DNA樣本的T/S值 (一式三份)。圖7將以白蛋白作為scg的兩次運(yùn)行的平均T/S值(χ軸)對(duì)以珠蛋白作為scg的兩次運(yùn)行的平均T/S值(y軸)作圖。用白蛋白獲得的T/S值與用β-珠蛋白獲得的T/S值高度相關(guān)(R2 = 0. 934)。通過(guò)描述的單色多重定量PCR方法在95個(gè)DNA樣本中測(cè)得的相對(duì)端粒長(zhǎng)度(T/S 比值)與通過(guò)Southern印跡測(cè)得的相對(duì)末端限制性片段長(zhǎng)度具有非常高的相關(guān)性。通過(guò)原始單重QPCR測(cè)定在這些相同的樣本中測(cè)量的T/S比值與TRF長(zhǎng)度不高度相關(guān)。這些結(jié)果表明，通過(guò)MMQPCR測(cè)量的端粒長(zhǎng)度比通過(guò)單重QPCR測(cè)量的端粒長(zhǎng)度更準(zhǔn)確。此外，通過(guò) MMQPCR獲得的T/S結(jié)果在獨(dú)立運(yùn)行的測(cè)定中具有高度重現(xiàn)性。端粒QPCR測(cè)定的多重化使得可增加通量并降低端粒長(zhǎng)度的流行病學(xué)研究的成本。此外，轉(zhuǎn)換為多重測(cè)定帶來(lái)的必須合成或購(gòu)買昂貴的定制多色熒光探針的通常的額外費(fèi)用通過(guò)采用這種方法也得以避免。可以容易地調(diào)整MMQPCR用于以非常不同的拷貝數(shù)天然存在的多對(duì)DNA模板的研究，例如mtDNA拷貝對(duì)單拷貝基因，rDNA拷貝對(duì)單拷貝基因以及Alu DNA拷貝對(duì)單拷貝基因。類似地，具有非常不同的拷貝數(shù)的RNA種類對(duì)在反轉(zhuǎn)錄成cDNA后也可以通過(guò)這種方法定量。對(duì)于大多數(shù)靶標(biāo)對(duì)，可以遵循引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)原則，唯一額外的指導(dǎo)原則是更高豐度的模板的引物可以產(chǎn)生較短的產(chǎn)物GO-SObp)以使其Tm適當(dāng)?shù)氐?< 83°C )，以及更低豐度的模板的引物可以包含這里所示的5’ GC-鉗(或類似物)并且產(chǎn)生短的產(chǎn)物以使其Tm 足夠地高(>90°C)。此外，在MMQPCR中，消除了常規(guī)多重QPCR中不得不限制用于擴(kuò)增更高豐度模板的引物的濃度的麻煩和伴隨的困難。在此，telg和tele端粒引物的設(shè)計(jì)特點(diǎn)用于使用與那些重復(fù)序列雜交的引物擴(kuò)增短的串聯(lián)重復(fù)序列。除了用MMQPCR測(cè)量端粒長(zhǎng)度之外，還用該方法測(cè)量mtDNA與nDNA的比值，并運(yùn)作良好。通過(guò)應(yīng)用延遲一個(gè)擴(kuò)增子的擴(kuò)增的引物和熱循環(huán)譜設(shè)計(jì)，甚至可以用該方法研究具有相似拷貝數(shù)的模板對(duì)。實(shí)施例2相似豐度的兩個(gè)靶標(biāo)的MMQPCR如果兩個(gè)靶核酸具有相似的豐度，則可以采用MMQPCR。為了這樣做，可以人為地延遲一個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增，同時(shí)允許另一個(gè)靶繼續(xù)擴(kuò)增。例如，當(dāng)?shù)谝话泻怂岷偷诙€(gè)靶核酸在豐度方面相似時(shí)，使用實(shí)施例1中描述的組合物和方法來(lái)測(cè)定第一靶核酸的拷貝數(shù)和第二個(gè)核酸的拷貝數(shù)。要做到這點(diǎn)，可使用上述的相同的組合物和方法，但提供的PCR循環(huán)參數(shù)不同。熱循環(huán)譜可以是第一階段95°C 15分鐘；第2階段94°C 15秒、49°C 15秒，2個(gè)循環(huán)； 第三階段88°C 15秒、62°C 10秒、74°C 15秒，2至6個(gè)循環(huán)；第四階段94°C 15秒、62°C 10 秒、74°C 15秒(伴有信號(hào)采集)、84°C 10秒、88°C 15秒(伴有信號(hào)采集)，32個(gè)循環(huán)。上述第三階段會(huì)使得端粒產(chǎn)物可指數(shù)擴(kuò)增，因?yàn)槠湓?8°C完全解鏈。然而，單拷貝基因產(chǎn)物在88°C是完全雙鏈化的，所以單拷貝基因引物在此第3階段循環(huán)期間不能結(jié)合并擴(kuò)增單拷貝基因產(chǎn)物。除非另有規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與所公開(kāi)的發(fā)明和組合物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常的理解具有相同的涵義。盡管類似或等同于本文所述的任何方法和材料都可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的方法和組合物，但是特別有用的方法、設(shè)備和材料如所述。 本文引用的出版物和所引用的材料通過(guò)引用方式明確地并入。本文任何內(nèi)容都不視為承認(rèn)本發(fā)明由于先前發(fā)明而不享有此公開(kāi)內(nèi)容。本領(lǐng)域技術(shù)人員只是使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，會(huì)認(rèn)識(shí)到或能確定本文所述的方法和組合物的具體實(shí)施方案的許多等同形式。此類等同形式意圖被下述權(quán)利要求所涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定第一靶核酸和第二靶核酸的拷貝數(shù)的方法，包括a)將第一靶核酸和第一引物組并將第二靶核酸和第二引物組接觸，并且加入單一檢測(cè)標(biāo)記以形成均一體系的反應(yīng)混合物；b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成具有第一解鏈溫度(Tm) 的第一擴(kuò)增子，以及通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成具有第二 Tm 的第二擴(kuò)增子，其中所述第二 Tm比所述第一 Tm高；c)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，在第一采集溫度測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第一信號(hào)采集溫度是低于所述第一 Tm ；d)升高反應(yīng)混合物的溫度至第二信號(hào)采集溫度并測(cè)定所述檢測(cè)標(biāo)記的量，其中所述第二信號(hào)采集溫度高于所述第一 Tm且低于所述第二 Tm ；e)重復(fù)步驟(b)至(d)至少一次；以及f)測(cè)定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸序列的拷貝數(shù)比所述第二靶核酸序列的拷貝數(shù)多。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在每個(gè)所述擴(kuò)增步驟中均在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記的量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一Tm與所述第二 Tm之間的差為至少4攝氏度ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二引物組的至少一個(gè)引物在所述引物的5’ 端包含GC-鉗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一引物組的至少一個(gè)引物包含包括A和T 核苷酸的5’序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一引物組的引物的3’端是彼此互補(bǔ)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一引物組的一個(gè)引物是包含至少一個(gè)與該引物的3’端相鄰的錯(cuò)配核苷酸的錯(cuò)配引物，其中所述核苷酸與靶核酸是不互補(bǔ)的，但是與所述第一引物組的另一個(gè)引物的3’端核苷酸是互補(bǔ)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一引物組的錯(cuò)配引物的延伸產(chǎn)物能與所述第一引物組的另一個(gè)引物雜交。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一引物組的引物之一被阻止引發(fā)所述第一靶核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中被阻止引發(fā)所述第一靶核酸的引物在其3’端包含錯(cuò)配堿基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)標(biāo)記是嵌入染料。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第一和第二靶核酸的拷貝數(shù)度量所述第一靶核酸相比于所述第二靶核酸的相對(duì)量。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸包含串聯(lián)重復(fù)序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸獲自樣本。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一靶核酸的拷貝數(shù)確定存在于樣本中的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸序列的拷貝數(shù)與所述第二靶核酸序列的拷貝數(shù)相似。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括至少三個(gè)連續(xù)階段的循環(huán)，其中第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度高于第二階段的循環(huán)的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中第二階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度低于第一階段的循環(huán)的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并且其中第三階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度低于第一階段的循環(huán)的退火溫度但高于第二階段的循環(huán)的退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)期間僅形成第一擴(kuò)增子。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在第二階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)期間僅形成第二擴(kuò)增子。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在第三階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)期間形成第一擴(kuò)增子和第二擴(kuò)增子。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中重復(fù)所述擴(kuò)增步驟直到在所述第二信號(hào)采集溫度下測(cè)定出所述檢測(cè)標(biāo)記。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在每個(gè)所述擴(kuò)增步驟期間，均在所述第一和第二信號(hào)采集溫度檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記的量。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一Tm與所述第二 Tm之間的差為至少4 攝氏度。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第二引物組中的至少一個(gè)引物在所述引物的5’端包含GC-鉗。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在所述第一引物組中的至少一個(gè)引物包含包括 A和T核苷酸的5’序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一引物組的引物的3’端是彼此互補(bǔ)的。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述第一引物組中的一個(gè)引物是包含至少一個(gè)與該引物的3’端相鄰的錯(cuò)配核苷酸的錯(cuò)配引物，其中所述核苷酸與靶核酸是不互補(bǔ)的，但是與第一引物組中的另一個(gè)引物的3'端核苷酸是互補(bǔ)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述第一引物組的錯(cuò)配引物的延伸產(chǎn)物能與第一引物組的另一個(gè)引物雜交。
30.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一引物組的引物之一被阻止引發(fā)所述第一靶核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中被阻止引發(fā)所述第一靶核酸的引物在其3’端包含錯(cuò)配堿基。
32.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述檢測(cè)標(biāo)記是嵌入染料。
33.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中第一靶核酸和第二靶核酸拷貝數(shù)度量所述第一靶核酸相比于所述第二靶核酸的相對(duì)量。
34.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一靶核酸包含串聯(lián)重復(fù)序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一靶核酸獲自樣本。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述第一靶核酸的拷貝數(shù)確定存在于樣本中的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度期間測(cè)定的檢測(cè)標(biāo)記的量與對(duì)照相比。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將在所述第一和所述第二信號(hào)采集溫度期間測(cè)定的檢測(cè)標(biāo)記的量與對(duì)照相比。
全文摘要
本文公開(kāi)了用于用單一檢測(cè)標(biāo)記在單個(gè)反應(yīng)孔中測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法和組合物。例如，本文公開(kāi)了用于用單一檢測(cè)標(biāo)記在單個(gè)反應(yīng)孔中通過(guò)單色多重定量PCR(MMQPCR)測(cè)定相比于第二靶核酸拷貝數(shù)的第一靶核酸拷貝數(shù)的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102439171SQ200980157269
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者R·M·考森 申請(qǐng)人:猶他大學(xué)研究基金會(huì)