專利名稱：產(chǎn)醌類化合物的重組酵母菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)醌類化合物的微生物菌種技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及產(chǎn)醌類化 合物的重組酵母菌技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醌類化合物(quinonoids)是具有共軛體系的環(huán)己二烯二酮類化合物，主要有苯 醌、萘醌、菲醌和蒽醌四種類型，是一類重要的氧化還原物質(zhì)，在生物體內(nèi)起著抗其他生物 侵害的保護(hù)作用，有些醌類化合物還是重要的藥物。游離醌類化合物一般具有升華性，極性較小，一般溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶 劑。常用菲格爾(Feigl)反應(yīng)、博恩特瑞格(Borntrager)反應(yīng)進(jìn)行顯色反應(yīng)。常用硅膠 薄層色譜進(jìn)行色譜鑒定，展開劑多用混合溶劑，如苯-乙酸乙酯-乙酸(75 24 1)、甲 苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)，醌類化合物在日光下多顯紅色、黃色，在紫外光(UV)下 多顯紅色、黃棕色、橙色熒光，隨其分子中酚羥基等助色團(tuán)數(shù)量的增多而顏色加深。醌類化合物早期作為一種天然色素，曾用于染料工業(yè)，后來研究發(fā)現(xiàn)它們具有瀉 下、抑菌、利尿、止血等多方面的生物活性。醌類物質(zhì)chrysarobin具有較強(qiáng)的抗霉菌作用， 是治療疥癬等皮膚病的有效藥物。最近的研究證明，多數(shù)醌類化合物具有明顯的抗腫瘤作 用，對小鼠黑色素瘤、艾氏腹水癌細(xì)胞、大鼠乳癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞具有明顯 的抑制作用，其中醌類物質(zhì)emodin可通過增強(qiáng)Bu25TK細(xì)胞核凝聚、膜聯(lián)蛋白黏合及DNA斷 裂而抑制癌細(xì)胞的DNA合成并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其途徑為Caspase介導(dǎo)的線粒體途徑，表現(xiàn) 在Caspase3、Caspase9的激活和多糖酶的斷裂。離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因是20世紀(jì)90年代中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室在研 究注入離子與生物體相互作用的基礎(chǔ)上，首先提出的一種新的轉(zhuǎn)基因方法。作為一種全新 的轉(zhuǎn)基因手段，離子注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因有其自身的特點(diǎn)首先，不需要事先知道或克隆出目的 DNA片段，其次可轉(zhuǎn)移DNA大片段，適于多基因或基因簇的轉(zhuǎn)導(dǎo)；其次，轉(zhuǎn)入的外源DNA是直 接整合入宿主總DNA中，因此具有較好的遺傳穩(wěn)定性。注入離子對細(xì)胞具有極強(qiáng)的刻蝕作 用，致使細(xì)胞表面形成可使外源DNA進(jìn)入的通道，這一點(diǎn)與基因槍方法并無差異。注入離子 對細(xì)胞的刻蝕和濺射作用屬于冷加工性質(zhì)，不傷及鄰近組織和細(xì)胞，比產(chǎn)生熱效應(yīng)的激光 束法具有明顯的優(yōu)勢。同時由于注入正離子的積累，大大降低了細(xì)胞表面的負(fù)電性，從而減 少了細(xì)胞對溶液中帶負(fù)電的外源DNA的靜電斥力，有利于外源基因的導(dǎo)入。加之通道局部 區(qū)域也由于帶正電，便于吸引帶負(fù)電性的DNA主動進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，目前離子注入 在真空環(huán)境中進(jìn)行，真空造成的負(fù)壓使細(xì)胞內(nèi)部的部分水分蒸發(fā)，當(dāng)干燥的細(xì)胞進(jìn)入含有 DNA的緩沖液中時，由于吸脹作用加強(qiáng)，也增加了外源DNA進(jìn)入通道的機(jī)會。此外，離子注入 會對受體細(xì)胞內(nèi)染色體造成直接損傷(如斷裂)和間接損傷(如自由基作用)，也增加了外 源DNA與受體細(xì)胞DNA重組和整合的機(jī)會。正是這些因素使得離子束介導(dǎo)DNA大分子的遺 傳轉(zhuǎn)化具有較高的轉(zhuǎn)化率。酵母菌與人類的關(guān)系源遠(yuǎn)流長，目前已建立了酵母菌的基因組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。酵母菌作為單細(xì)胞低等生物，具有易培養(yǎng)、繁殖快、便于基因操作、能對外源蛋白進(jìn) 行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生或很少有毒物質(zhì)等特性，已成為外源基因表達(dá)的合適宿主。甘草(Glycyrrhiza)是豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(PapiliantaeTaub.)，屬 多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐熱、抗鹽堿等優(yōu)良特性，適應(yīng)性強(qiáng)，生命力旺盛，根系 發(fā)達(dá)，是荒漠、半荒漠地區(qū)保持水土、改良土壤、防風(fēng)固沙的重要藥用植物，被國家列為二級 野生藥材物種。通過離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA在酵母菌中的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)重組酵母菌發(fā)酵生產(chǎn) 醌類化合物的技術(shù)突破，將對我國民族制藥業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過對照現(xiàn)有技術(shù)，針對重組酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)醌類化合物未見報道，而通 過離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化獲得有效的微生物菌種發(fā)酵獲得醌類化 合物也未見報道。本發(fā)明的目的是提供一種為獲得醌類化合物的重組酵母菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明提供了重組酵母工程菌菌株，通過離子注入介導(dǎo)甘草 基因組DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的方法獲得的二株產(chǎn)醌類化合物的重組酵母菌，其分別為釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434 和異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435，這兩種菌種通過傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝都可以有效獲得醌類化合物。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的兩種菌種都為酵母菌，具有常規(guī)酵母菌的一些共同的技 術(shù)特征，都通過傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)有效獲得醌類化合物，是基于提取天然藥物醌類化合物共 同技術(shù)要求前提下實現(xiàn)。具體地，本發(fā)明采用已公開的技術(shù)，具體技術(shù)已經(jīng)通過申報國家發(fā)明專利，并獲得 發(fā)明專利授權(quán)，其申請?zhí)枮?006100114027，即通過改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘 草(Glycyrrhiza uralensis)并獲得總DNA，通過在酵母中轉(zhuǎn)化從而獲得本發(fā)明產(chǎn)醌類化 合物的兩株重組酵母菌。本發(fā)明技術(shù)方案所用酵母菌并不限于酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬 (Hansenula)和其他酵母屬通過發(fā)酵可獲得醌類化合物，本發(fā)明技術(shù)效果的再現(xiàn)，同時在 于，通過離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的技術(shù)方案的結(jié)合。具體地，本發(fā)明 優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC. No. 3434和異常漢遜酵母(Hansenula anomala)CGMCC. No. 3435。一方面，本發(fā)明提供了一種重組酵母菌株的菌株，編號命名為5005，其主要次生 代謝產(chǎn)物為醌類化合物。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單 位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2009年11月9 日，保藏號是CGMCC. No. 3434。根據(jù)受體菌的來源，經(jīng)微生物學(xué)鑒定，5005菌為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，該菌株的菌落呈顏色乳白色，中央隆起，邊緣圓整；斜面菌 種培養(yǎng)溫度28-30°C，培養(yǎng)時間24h ；液體搖瓶培養(yǎng)溫度28-30°C，轉(zhuǎn)速200_220r/m，培養(yǎng)時 間96h?？刹捎萌缦路椒▽ζ溥M(jìn)行保存采用常規(guī)的斜面?zhèn)鞔４娣?，此方法是將本發(fā)明菌 種接種于只要適合于酵母菌生長的斜面培養(yǎng)基表面，常規(guī)培養(yǎng)和保存即可。或是利用真空 冷凍干燥法將本發(fā)明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏即可。本發(fā)明進(jìn)一步建立菌種保
4藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。另一方面，本發(fā)明提供了一種重組酵母菌株，編號命名為6076，其主要次生代謝產(chǎn) 物為醌類化合物。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2009年11月9日，保藏號是 CGMCC.No. 3435。根據(jù)受體菌的來源，經(jīng)微生物學(xué)鑒定，6076菌為異常漢遜酵母(Hansenula anomala)，該菌株的菌落呈乳白色，中央隆起，邊緣圓整；斜面菌種培養(yǎng)溫度30_32°C，培養(yǎng) 時間24h ；液體搖瓶培養(yǎng)溫度30-32°C，轉(zhuǎn)速200-220r/m，培養(yǎng)時間96h。可采用上述保存 5005菌的方法對其進(jìn)行保存。通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以通過技術(shù)方案獲得的二 株重組酵母菌，即釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434和異常漢遜酵母 (Hansenula anomala) CGMCC 3435，通過傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù)手段有效獲得醌類化合物 的有益效果。


無
具體實施例方式實施例一產(chǎn)醌類化合物的重組釀酒酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)的基因 組 DNA。取細(xì)胞濃度為1.0X107CFU/mL的釀酒酵母菌體稀釋液0. lmL均勻涂布于直徑 90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于IXD1000型離子注入機(jī)小真空靶室的無 菌靶臺上進(jìn)行Ar+注入。Ar+注入能量lOKeV、劑量15X 1015ions/cm2，真空度10_3Pa。用2mL烏拉爾甘草基因組DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的酵母菌膜，28°C溫育 2h后，洗脫至YEPD平板。其中，YEPD培養(yǎng)基的成分為(w/v)酵母膏1. 0%、蛋白胨2. 0%、葡萄糖2. 0%、瓊 脂2.0%，其余為無菌水。將YEPD平板上生長的菌落接入斜面培養(yǎng)，再進(jìn)行液體培養(yǎng)。收集培養(yǎng)液，進(jìn)行薄 層色譜(TLC)檢測。獲得一株編號為5005的重組釀酒酵母菌，其培養(yǎng)液中含有紅色的醌類 化合物，用甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)展開時，其Rf值為0.24。重組釀酒酵母菌5005于2009年11月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為3434。實施例二 產(chǎn)醌類化合物的重組異常漢遜酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)的基因 組 DNA。取細(xì)胞濃度為1. 0 X 107CFU/mL的異常漢遜酵母菌體稀釋液0. lmL均勻涂布于直 徑90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于IXD1000型離子注入機(jī)小真空靶室的 無菌靶臺上進(jìn)行Ar+注入。Ar+注入能量lOKeV、劑量15X 1015ions/cm2，真空度10_3Pa。用2mL烏拉爾甘草基因組DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的酵母菌膜，28°C溫育 2h后，洗脫至YEPD平板。
其中，YEPD培養(yǎng)基的成分為(w/v)酵母膏1. 0%、蛋白胨2. 0%、葡萄糖2. 0%、瓊 脂2.0%，其余為無菌水。將YEPD平板上生長的菌落接入斜面培養(yǎng)，再進(jìn)行液體培養(yǎng)。收集培養(yǎng)液，進(jìn)行薄 層色譜(TLC)檢測。獲得一株編號為6076的重組異常漢遜酵母菌，其培養(yǎng)液中含有紅色的 醌類化合物，用甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)展開時，其Rf值為0.51。重組異常漢遜酵母菌6076于2009年11月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為3435。實施例三重組酵母菌培養(yǎng)液中醌類化合物的薄層色譜(TLC)鑒定以甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)為展層劑，硅膠薄板層析，利用 醌類化合物在日光和紫外光下特異的綠色，確定醌類化合物的存在。釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) CGMCC 3434 和異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435所產(chǎn)醌類化合物在日光下顯紅色，在紫外光(UV)下顯紅色熒光，前者的Rf值為0. 24， 后者的Rf值為0.51。實施例四重組酵母菌培養(yǎng)液中醌類化合物的氣相色譜_質(zhì)譜(GC-MC)鑒定利用PE Turbemass-Autosystem XL氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MC)儀對收集和純化的 重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434和重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435培養(yǎng)液中的醌類化合物進(jìn)行檢測，檢測條件為GC-MC 儀柱型PE-5MS 30mX0. 25mmX0. 25 u ；程序升溫70°C保持 lOmin ；4°C /min 升至 120°C，保持 5min ；5. 8°C /min 升至 250°C，保持 37min ；進(jìn)樣口溫度280°C;分流比60 1 ；載氣流速15psi;載氣氦氣(99.999% )；離子源200°C；傳輸線260°C；掃描范圍30amu 550amu ；功率70ev ；電離方式EI ；光電倍增270V;進(jìn)樣量1.0iiL。重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434培養(yǎng)液中的醌類化 合物的保留時間(RT)為12.092min，與WILEY化合物庫中的醌類化合物CAS1211-29-6 和CAS42536-97-0的相似性分別為70. 9 %和72. 1 %。重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435培養(yǎng)液中的醌類化合物的RT為21. 311min,與Nist化合物庫中的醌 類化合物CAS1000192-59-3^P Nbs化合物庫中的醌類化合物CAS111-70-6的相似性分別 為 69. 7%和 54. 6%。確定重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434 和重組 異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)CGMCC 3435培養(yǎng)液中的醌類化合物均為新的醌類化合 物。
通過上述的實施例，更容易理解本發(fā)明。上述實施例只是舉例性的描述，而不應(yīng)當(dāng) 被理解為用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用酵母菌并不限于酵母菌屬(Saccharomyces)、 漢遜酵母菌屬(Hansenula)和其他酵母菌屬通過發(fā)酵可獲得醌類化合物，同時在于，通過 離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的技術(shù)方案的結(jié)合。另外，在上述的說明中， 如無特別說明，％皆指重量百分比。
權(quán)利要求
產(chǎn)醌類化合物的重組酵母，通過離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化獲得重組酵母發(fā)酵能夠獲得醌類化合物，其特征在于，所述的重組酵母菌分別為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434和異常漢遜酵母(Hansenula anomala)CGMCC 3435，這兩種菌種通過傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝都有效獲得醌類化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產(chǎn)醌類化合物的重組酵母菌，通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的方法獲得的二株產(chǎn)醌類化合物的重組酵母菌，其分別為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC.No.3434和異常漢遜酵母菌(Hansenula anomala)CGMCC.No.3435。實現(xiàn)重組酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)醌類化合物的技術(shù)突破，將對于天然產(chǎn)物的研發(fā)具有重要意義。
文檔編號C12R1/865GK101851590SQ20101004551
公開日2010年10月6日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者呂杰, 樊永紅, 毛培宏, 金湘 申請人:新疆大學(xué)