專利名稱：新疆哈密瓜aflp指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新疆哈密瓜AFLP指紋圖譜，可用于哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒別 與保護(hù)。
背景技術(shù)：
廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記僅 是指DNA標(biāo)記，是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映，一般所稱的分子標(biāo)記概念即被界定在 這個范疇之內(nèi)。生物在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的可遺傳變異，都是由于DNA堿基序列變異所 致。同一物種內(nèi)存在極為豐富的DNA堿基序列變異，為開發(fā)和利用分子標(biāo)記奠定了堅實(shí)基 石出。DNA分子標(biāo)記是指生物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò) 增或兩者結(jié)合等措施處理后電泳，檢測到的反映基因組某種變異特征的特異性DNA片段。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性,是一 種基于RFLP和PCR基礎(chǔ)上發(fā)明的DNA指紋技術(shù)。它具有快速、靈敏、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富等特 點(diǎn)，所以被認(rèn)為是一種十分理想、有效、先進(jìn)的分子標(biāo)記。由于AFLP可以為任何來源和復(fù)雜程度的DNA提供有力的DNA指紋，所以是用來評 估遺傳多樣性的理想標(biāo)記，可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關(guān)系，從而確定親本間的 遺傳距離，并進(jìn)而劃分雜交優(yōu)勢，提高雜種優(yōu)勢潛力。Cervera等僅用了 2個AFLP引物組合就揭示了在西班牙收集的67個不同的葡萄 樣品之間的遺傳相似性。Greef等用6個AFLP引物組合得到的200個多態(tài)位點(diǎn)，分析了歐 洲芒屬植物的遺傳多態(tài)性，并據(jù)此分析推測了雜種的形成。遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析的 結(jié)果將有利于更好地利用這些豐富的育種資源。DNA指紋能同時在許多位點(diǎn)上提供可靠的遺傳標(biāo)記，與其它方法相比，具有高度個 體特異性和穩(wěn)定可靠性，大大提高了遺傳分析的效率。AFLP技術(shù)既可以用于檢測品種的質(zhì) 量和純度，也可運(yùn)用于稀有珍貴植物資源和名、特、優(yōu)品種的鑒定、引種以及瀕危植物的考 察和保護(hù)工作。高質(zhì)量指紋圖譜可作為新品種登記、注冊和產(chǎn)權(quán)保護(hù)的重要依據(jù)。AFLP檢 測的位點(diǎn)數(shù)多，保證了其鑒定的高度準(zhǔn)確性，因而被公認(rèn)為園藝作物建立指紋圖譜效率最 高的標(biāo)記。Che等用4個AFLP引物組合得到15條譜帶的指紋圖譜可區(qū)分30份西瓜種質(zhì)，并 將西瓜種質(zhì)PU96341的特異片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。Aranzana等對210個桃品種作AFLP 分析，47個AFLP標(biāo)記可區(qū)分196個品種，利用3對AFLP引物組合可區(qū)分187個桃品種。房 經(jīng)貴等采用AFLP技術(shù)，利用16對引物構(gòu)建了 2個芒果育種親本的指紋圖譜，獲得了 2個品 種間分子水平上的多態(tài)性信息。魯鳳娟建立了梨樹44個品種的AFLP指紋圖譜。此外，AFLP 技術(shù)還被應(yīng)用到葡萄、香蕉、大豆、小麥等多種作物的指紋圖譜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種基于AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的哈密瓜指紋圖譜，將其用 于哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒別與保護(hù)。將不同哈密瓜采集葉片，提取基因組DNA，經(jīng)過酶 切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇擴(kuò)增，PAGE電泳，得到高低不同的大量DNA條帶，具有相同DNA條帶 的哈密瓜被認(rèn)為是擁有同樣的遺傳位點(diǎn)，具有不同大小的DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為擁有不 同的遺傳位點(diǎn)，據(jù)此建立不同哈密瓜種質(zhì)的指紋圖譜，用于不同哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒 別與保護(hù)種質(zhì)保護(hù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在直接對哈密瓜基因組DNA進(jìn)行檢測，不受田間環(huán)境等因 素對甜瓜表型的影響，另外使用該方法可在幼苗期對幼苗進(jìn)行檢測鑒定，大大縮短檢測周期。


該圖為不同新疆甜瓜材料AFLP指紋圖，每一泳道為一個甜瓜材料，分別為
1、黃花皮白肉
2、米籽黃旦子
3、小青皮
4、卡拉其千里
5、八一香
6、巴登
7、伯克扎德
8、一包糖
9、米籽瓜
10、俄羅斯可洪
11、納西甘
12、新密7號
13、巴吾喜克
14、且介可洪
15、皮極甘
16、塔石可洪
17、桔可口奇
具有相同DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為是擁有同樣的遺傳位點(diǎn)，具有不同大小的DNA
條帶的哈密瓜被認(rèn)為擁有不同的遺傳位點(diǎn)，據(jù)此將不同的哈密瓜品種區(qū)分開，可用于新疆 哈密品種保護(hù)與品種鑒別。
具體實(shí)施例方式新疆甜瓜基因組DNA的提取(1)取250mg左右新鮮甜瓜葉片于液氮中(加4% PVP)研磨成粉，轉(zhuǎn)至IOml無菌 離心管中，加入3ml預(yù)熱的2XCTAB緩沖液(臨用時加2% β-巰基乙醇)上下顛倒混勻， 65°C水浴lh，期間輕輕搖勻數(shù)次；(2)取出離心管冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇04 1)，輕緩顛倒混勻， 靜置IOmin ；
(3)室溫下 12000r/min 離心 IOmin ；(4)將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/10體積的CTAB/NaCl和等體積氯仿/異戊 醇(24 1)，顛倒混勻，12000r/min 離心 IOmin ；(5)將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/2體積5mol/L NaCl混勻，再加入等體積預(yù) 冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜置15min ；(6) 12000r/min 離心 lOmin，棄上清；(7) 70%乙醇洗滌沉淀2次，將沉淀轉(zhuǎn)移至1. 5ml EP管，4000r/min離心2min，棄
盡上清，室溫下微干；(8)將沉淀溶于含Rnase A(10mg/ml)的100 μ 1 TE緩沖液中37°C水浴Ih ；(9)取出離心管，加入400 μ 1 TE緩沖液，然后加1/10體積CTAB/NaCl和等體積的 酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，顛倒混勻，放置IOmin ；(10) 40C，13000r/min 離心 IOmin ；(11)取上清于另一 Ep管，加入等體積的氯仿/異戊醇04 1)，顛倒混勻，放置 IOmin ；(12)4°C，12000r/min 離 IOmin ；(13)取上清于另一 EP管，加入1/10體積3mol/L NaAc (PH5. 2)和2倍體積無水乙 醇，顛倒混勻，-20°C靜置Ih(時間盡量延長，可過夜)；(14) 13000r/min 離心 lOmin，棄上清；(15)用70%乙醇洗滌沉淀2次，4000r/min離心2min，棄盡上清，室溫干燥；(16)將沉淀溶于50 μ 1雙蒸水中，-20°C保存。測定DNA濃度利用紫外分光光度計測定雙鏈DNA OD260 = 1. O時溶液濃度為50ug/ μ 1，那么DNA 樣品濃度(ng/μ ) =OD26tlXN(樣品稀釋倍數(shù))X50。取少量提取的DNA稀釋后，0. 8%瓊 脂糖凝膠電泳，DL2000為對照，可根據(jù)條帶的亮度與Marker相比，以Marker的濃度來估計 所提DNA的濃度。AFLP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化樣品DNA的完全酶切用EcoR I-Mse I 2種限制性內(nèi)切酶各3U對300ng DNA進(jìn)行酶切，設(shè)ai、3h、4h、 證、^!共5個處理，以確定適宜的酶切時間。取0. aiil Ep管，加入下述溶液，總反應(yīng)體積為 40 μ 1，混勻后37°C水浴。樣品DNA300ngNEB Buffer 2 (10 Χ) 2μ 1BSA(10mg/ml)0. 4 μ 1EcoR I (20U/ μ 1)0· 15 μ 1Mse I(10U/y 1)0. 3 μ 1補(bǔ)ddH20 至 40 μ 1反應(yīng)結(jié)束后70°C處理15min，使酶失活，然后立即冰浴。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢 測酶切是否完全。完全酶切樣品與接頭的連接
用于AFLP分析的接頭序列 EcoR I adapter :5’ -CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5 Mse I adapter :5’ -GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5 接頭的制備EcoR I adapter (5uM, 60 μ 1)EcoR I adapter 1 (1 μ g/μ 1)EcoR I adapter 2(1 μ g/μ 1)NEB Buffer2 (IOX)
1. 7μ 1 1. 5μ 1 3 μ 1 ddH20
53. 8μ 1Mse I adapter (50uM, 60 μ 1)Mse I adapter 1 (1 μ g/μ 1)Mse I adapter 2(1 μ g/μ 1)NEBBuffer 2 (IOX)
16 μ 1 14 μ 1 3 μ 1 27 μ 1 ddH20將上述成分分別混合，95°C 5min，緩慢降至室溫即得EcoR I adapter和Mse I adapter,在完全酶切產(chǎn)物(40 μ 1)中加入10 μ 1下述反應(yīng)液，總體積50 μ 1，混勻后，16°C過 夜。連接產(chǎn)物經(jīng)ddH20稀釋后作為下面預(yù)擴(kuò)增的模板。EcoR I adapter (5pmol/μ 1) 1 μ 1Mse I adapter (50pmol/μ 1) 1 μ 1T4 Ligase Buffer(IOX)1 μ 1Τ4 DNA Ligase (350U/μ 1)0. 5 μ 1ddH206. 5 μ 1連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增引物序列E00 即 E+1 primer :5，-GACTGCGTACCAATTC+AM。。即 M+1 primer :5，-GATGAGTCCTGAGTAA+C對連接后的產(chǎn)物設(shè)3個稀釋倍數(shù)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，即連接產(chǎn)物稀釋5倍、10倍和20 倍。預(yù)擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，確定適宜的連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)。將連接產(chǎn)物用 ddH20稀釋一定倍數(shù)后取5 μ 1作為預(yù)擴(kuò)增的模板，向其中加入15 μ 1如下混合液，反應(yīng)總體 積 20 μ 1。PCR Buffer(IOX)2μ 1dNTP Mixture (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1E00 (50ng/y 1)0. 6 μ 1M00 (50ng/y 1)0. 6 μ 1Taq 酶(5υ/μ1)0. 3 μ 1ddH2011 μ 1
預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下
Step 194 0C 2min
Step 294 °C 30s
Step 356 °C30s
Step 472 °CImin
Step 5Goto Step 230Cycles
Step 672 °C7min
Step 74 °COO
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取6 μ 1預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，1 %瓊脂PCR Buffer(IOX)2μ 1
dNTP Mixture (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1
E+3 primer(50ng/μ 1)0. 8 μ1
M+3 primer(50ng/μ 1)0. 8 μ1
Taq 酶(5U//μ 1)0. 3μ 1
(MH2O10. 6μ 1
選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下
Step 194 °C2min
Step 294 °C30s
Step 365 °C (--rc/Cycles)30s
Step 472 °CImin
Step 5Goto Step2IOCycles
Step 694 °C30s
Step 756 °C30s
Step 872 °CImin
Step 9Goto Step624Cycles
Step 1072 °C7min
Step 114 °COO
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取6 μ1預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，1.5% 酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴(kuò)增效果。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)膠板的準(zhǔn)備用去污劑和清水將玻璃板洗滌干凈，并用蒸餾水沖洗，最后用95%乙醇擦拭、干燥。將Iml R印el-Silane (剝離硅烷)均勻涂抹于長方形玻璃板整個表 面，室溫干燥5min，用95%乙醇擦去多余的R印el-Silane。加8μ1 Bind-Silane (親和硅 烷)于1. 5ml含8μ 1醋酸的95%乙醇中，充分混合后均勻涂抹于凹形玻璃板整個表面，室 溫干燥5min，用95%乙醇擦去多余的Bind-Silane。取0. 4mm的邊條，置于左右兩側(cè)，將凹 形板壓于長方形板上，用夾子固定住兩側(cè)，試一下鯊魚齒是否可順利插入；以IX TBE配制 瓊脂糖凝膠，吸入玻璃板底部，冷卻20min后用膠帶密封；將玻璃板近水平傾斜放置，準(zhǔn) 備灌膠。(2)制膠配制50ml 6 %的變性聚丙烯酰胺凝膠，40 %丙烯酰胺7. 5ml，尿素 21g/32. 5ml (加熱溶解)，5XTBE 10ml，搖晃均勻后加入10%過硫酸銨225 μ 1，混勻后加 50 μ 1 TEMED，混勻后立即灌膠。(3)灌膠將配好的膠液沿玻璃板緩慢倒入膠板間的空隙，注意不要在膠中留有 氣泡。倒?jié)M膠后，水平放置膠板將鯊魚齒的平端插入膠液下5mm左右處，于室溫下靜置Ih 使膠完全聚合。(4)預(yù)電泳膠聚合以后，撕去膠布，輕輕拔出梳子，用蒸餾水沖洗膠面，洗去碎 膠。反轉(zhuǎn)梳子，將鯊魚齒插入凝膠膠面下約0.5mm，梳齒間即樣品槽。將膠板固定在電泳槽 上，上槽中加入0. 5 X TBE至沒過膠面，下槽中加入IX TBE。U = 2000V，預(yù)電泳30min，以去 除氣泡。(5)點(diǎn)樣把DNA樣品與上樣緩沖液(8 3)混合，95°C變性8min，立即置于冰上 冷卻待用，每個加樣孔加5 7 μ 1樣品DNA。(6)電泳U = 2000V,溴酚藍(lán)至膠的四分之三處時(一般約1. 5 2h)，終止電泳。 放掉電泳液，取下膠板，將兩塊板輕輕分開，膠留在親水化的方形玻璃板上。銀染(1)固定(脫色)在托盤1中加入IL固定/終止液，將有膠的玻璃板膠面向上放 入托盤中，輕搖30min直到膠全部脫色；也可將膠在溶液中浸泡過夜(不搖動)。將溶液回 收待用。(2)洗膠在托盤2中用IL雙蒸水洗凝膠3次，每次aiiin。將膠板取出時，豎直滴 干水10 20s (此期間配制染色液)。(3)染色在托盤3內(nèi)加入IL染色液，將膠板放入托盤中輕搖30min。(此期間配 制顯色液)(4)洗膠。從染色液中取出膠板，雙蒸水沖洗數(shù)秒，浙干水，立即將膠置于預(yù)冷的顯 色液中。注意，從用水沖洗膠板到將其放入顯色液中，時間不超過5 10s。(5)顯影輕搖顯色液，直至膠上所有的條帶都出現(xiàn)。(6)定影(終止顯色)將回收的固定/終止液倒入顯色液中，搖晃2 ;3min。(7)洗膠將膠板用雙蒸水洗2次，每次aiiin。(8)干膠室溫下自然干燥，在淺色背景下即可進(jìn)行觀察拍照。結(jié)果記錄高低不同的大量DNA條帶，具有相同DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為是擁有同樣的遺傳 位點(diǎn)，具有不同大小的DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為擁有不同的遺傳位點(diǎn)，據(jù)此建立不同哈密 瓜種質(zhì)的指紋圖譜，用于鑒定不同的哈密瓜品種及其遺傳關(guān)系，用于輔助甜瓜育種與種質(zhì)保護(hù)。
權(quán)利要求
1.一種新疆哈密瓜AFLP指紋圖譜，可用于哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒別與保護(hù)。
2.如權(quán)利要求1所述的哈密瓜AFLP指紋圖譜，其特征在于用選擇性引物ME與E9對 提取的哈密瓜DNA進(jìn)行AFLP擴(kuò)增、電泳，得到多條清晰的多態(tài)條帶，可將不同哈密瓜材料加 以區(qū)別。
3.如權(quán)利要求1所述的指紋圖譜的使用，其特征在于用AFLP反應(yīng)引物ME與E9，對未 知甜瓜材料的基因組DNA進(jìn)行AFLP擴(kuò)增、電泳，將得到的電泳圖譜與權(quán)利要求1中所述的 指紋圖譜比較，獲知未知材料與已知哈密瓜品種的親緣關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種基于AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的哈密瓜指紋圖譜，將其用于哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒別與保護(hù)。將不同哈密瓜采集葉片，提取基因組DNA，經(jīng)過酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇擴(kuò)增，PAGE電泳，得到高低不同的大量DNA條帶，具有相同DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為是擁有同樣的遺傳位點(diǎn)，具有不同大小的DNA條帶的哈密瓜被認(rèn)為擁有不同的遺傳位點(diǎn)，據(jù)此建立不同哈密瓜種質(zhì)的指紋圖譜，用于不同哈密瓜種質(zhì)的鑒定、品種鑒別與保護(hù)種質(zhì)保護(hù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在直接對哈密瓜基因組DNA進(jìn)行檢測，不受田間環(huán)境等因素對甜瓜表型的影響，另外使用該方法可在幼苗期對幼苗進(jìn)行檢測鑒定，大大縮短檢測周期。
文檔編號C12Q1/68GK102134584SQ20101004552
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者李冠, 王賢磊, 趙瓊珍, 高興旺 申請人:新疆大學(xué)