專利名稱：：瘤胃菌體蛋白循環(huán)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)(FLRB)，用于測定反芻動物瘤胃菌體蛋白循環(huán)(原蟲捕食細(xì)菌)的方法。
背景技術(shù)：
：眾所周知，由于瘤胃微生態(tài)中原蟲對細(xì)菌的吞噬，導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌蛋白質(zhì)的循環(huán)(Coleman，1975)，使得瘤胃的微生物蛋白質(zhì)(MCP)量及其氨基酸(AA)組成發(fā)生改變，進(jìn)而改變MCP對宿主動物十二指腸的AA的供應(yīng)(Leng，1982；Wallace等，1987；Ivan等，2000)。長期以來，由于瘤胃微循環(huán)的研究缺少簡易可行的研究方法，導(dǎo)致了對瘤胃內(nèi)菌體蛋白循環(huán)的研究，還基本停留在原蟲的祛除與否對瘤胃內(nèi)菌體蛋白量、供給小腸MCP量、宿主的生產(chǎn)性能的影響上(Hsu等，1991a、1991b；Koenig等，2000；韓春艷等，2002；Hristov等，2004；Wang等，2007)，對于真正的菌體蛋白循環(huán)量卻鮮有研究，使之成為該領(lǐng)域多年來不可逾越的“黑箱”，而阻滯了反芻動物消化道蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究與調(diào)控技術(shù)的發(fā)展。因此亟待解決的關(guān)鍵問題是瘤胃菌體蛋白微循環(huán)研究方法的建立。為此有人采用同位素標(biāo)記方法，但此方法涉及特殊設(shè)備以及環(huán)境問題，不適宜于一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)測定使用。
發(fā)明內(nèi)容為了突破目前反芻動物瘤胃微生物蛋白質(zhì)循環(huán)不能進(jìn)行研究的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種瘤胃菌體蛋白循環(huán)的測定方法，該方法采用熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)(FLRB)，有效地解決了問題。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明的測定方法，包括有以下步驟1)無菌瘤胃液的制備；2)熒光標(biāo)記細(xì)菌(FLRB)的制備；3)吞噬試驗(yàn)；4)氮換算；其中2)步驟中瘤胃液先經(jīng)過400目濾膜過濾后離心，收集沉淀為細(xì)菌，然后用PBS溶液洗滌后懸浸于PBS溶液中；接著加染液對細(xì)菌染色后，將染液倒出，再用PBS溶液洗滌，最后密封冷凍保存待用；3)步驟中將FLRB平衡至39°C后加內(nèi)有活化原蟲的培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬試驗(yàn)，該培養(yǎng)液為由從瘤胃瘺管動物中采集的瘤胃液通過步驟1)制備成的無菌瘤胃液和人工唾液鹽以體積比12的比例配制而成。下面對各步驟進(jìn)行詳細(xì)闡述本發(fā)明的1)步驟中的無菌瘤胃液的制備方法為從瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液經(jīng)充分混合后29，OOOXg,20min離心，收集上清，4°C保存，一周內(nèi)使用。本發(fā)明的2)步驟中熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌(FLRB)的制備方法為(1)采集瘤胃液過400目濾膜(孔徑38μm)濾膜，濾液離心(22，OOOXg，12min)，收集沉淀為細(xì)菌，用PBS溶液充分洗滌，然后懸浸于同體積的PBS溶液中；(2)加DTAF(三氯三嗪基氨基熒光素)染液(V/V=1/5樣品懸液)染色，60°C水浴2h；⑶離心(22，OOOXg，12min)，將上層DTAF溶液倒出，再用PBS溶液充分洗滌，即密封冷凍保存沉淀(_20°C)待用。本發(fā)明的3)步驟中的吞噬試驗(yàn)的具體操作方式為(1)采集瘤胃液，過80目濾布；(2)無菌生理鹽水充分原蟲洗滌，將原蟲置于培養(yǎng)液(無菌瘤胃液人工唾液鹽=12)，設(shè)置盡量與瘤胃內(nèi)一樣的條件(39°C、厭氧、50r/min搖床)培養(yǎng)30min活化原蟲；(3)取FLRB解凍置于水浴鍋溫度平衡至39°C，加活化原蟲培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，以2、5、10、15、20、25、30、35、40min的時間點(diǎn)用微型吸管分別吸取少量液體，轉(zhuǎn)移至載玻片上，迅速加等量的甲醛固定以停止吞噬活動，采樣制片立即鏡檢；(4)設(shè)置可見光100-400倍觀察原蟲形態(tài)，熒光(460nm)檢測每個原蟲體內(nèi)的FLRB數(shù)，每時點(diǎn)皆3重復(fù)，每片以12個原蟲均值記。本發(fā)明的4)步驟中的氮換算方式為用FLRB平均體積為0.ΙΟμπι3，氮的換算系數(shù)0.054pg/μm3計(jì)算微生物N的吞噬量。本發(fā)明的培養(yǎng)液的制作方式為1)按照和所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物所食用的日糧準(zhǔn)備試驗(yàn)用培養(yǎng)底物，并根據(jù)所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物的唾液配置試驗(yàn)用人工唾液鹽，同時從所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液制備無菌瘤胃液(以減少培養(yǎng)液中的自由細(xì)菌數(shù)，使之大大小于所要加入的FLRB濃度)；2)將培養(yǎng)底物放入培養(yǎng)瓶中，據(jù)體積21的比例將人工唾液鹽和無菌瘤胃液加入到培養(yǎng)瓶中，再加入經(jīng)過濾、洗滌的原蟲沉淀，將培養(yǎng)瓶置于39°C水浴搖床、持續(xù)通二氧化碳(以營造成厭氧環(huán)境)進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速控制在50r/min0本發(fā)明的原理是熒光素?fù)?jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同可對DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行染色，進(jìn)而可在熒光顯微鏡下相應(yīng)波長下對生物分子進(jìn)行檢測。瘤胃細(xì)菌含有DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此可據(jù)以上所述進(jìn)行熒光標(biāo)記與檢測。而如果測定原蟲吞噬到體內(nèi)的細(xì)菌量就應(yīng)該先進(jìn)行吞噬試驗(yàn)，使原蟲先吞噬熒光標(biāo)記的細(xì)菌，而后在光鏡下觀察原蟲形態(tài)進(jìn)行分類，而后再轉(zhuǎn)置為熒光背景檢測原蟲體內(nèi)的熒光標(biāo)記細(xì)菌數(shù)。本方法的技術(shù)方案即是基于以上所述的技術(shù)原理設(shè)計(jì)。先選擇DTAF(三氯三嗪基氨基熒光素，染細(xì)胞質(zhì)蛋白)進(jìn)行瘤胃細(xì)菌的熒光標(biāo)記，再進(jìn)行瘤胃原蟲的吞噬試驗(yàn)，采樣制片后經(jīng)可見光與熒光(460nm)分別顯微分析原蟲與其吞噬細(xì)菌的速率。最后采用給定的N轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算N的吞噬速率與循環(huán)量。從而實(shí)現(xiàn)對瘤胃菌體蛋白循環(huán)的檢測。基于以上原理，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，具有以下技術(shù)效果本熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)操作簡便、成本低、適于實(shí)驗(yàn)室測定瘤胃原蟲吞噬速率所用，該方法的使用將有助于打開瘤胃內(nèi)微生物循環(huán)的“黑箱”，促進(jìn)瘤胃微生態(tài)及宿主AA營養(yǎng)的研究。另外，進(jìn)一步的，該方法還可同時對原蟲進(jìn)行種類鑒定及各種屬吞噬速率的測定，這對于深入研究瘤胃內(nèi)蛋白循環(huán)機(jī)理和有效利用瘤胃微生態(tài)營養(yǎng)原理的調(diào)控瘤胃蛋白質(zhì)營養(yǎng)都有一定的參考意義。進(jìn)一步的，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)400目濾膜(孔徑38μπι)與2μπι濾膜相比試驗(yàn)速度加快、減少對厭氧細(xì)菌的操作時間，增加了瘤胃細(xì)菌保真性。2)PBS溶液充分洗滌、懸浸；并密封冷凍保存沉淀，與生理鹽水洗滌相比細(xì)胞團(tuán)塊現(xiàn)象變少，染色充分、計(jì)數(shù)客觀，可靠性增加；保存沉淀比保存細(xì)胞懸浸液對細(xì)胞損傷少、解凍與平衡迅速、易于試驗(yàn)操作。3)FLRB平衡至39°C后加活化原蟲培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，與原蟲培養(yǎng)液加FLRB細(xì)胞懸浸液相比，瘤胃內(nèi)環(huán)境、瘤胃內(nèi)細(xì)菌與原蟲密度模擬程度高，這些因素都將影響原蟲的吞噬力，因此，提高了試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性圖1為內(nèi)毛屬原蟲吞噬細(xì)菌熒光照片圖2為雙毛屬原蟲吞噬細(xì)菌熒光照片圖3是原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(25min)對照組(不添加油脂)圖4是原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(25min)A組(添加菜籽油)圖5是原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(25min)B組(添加豆油)圖6是原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(25min)C組(添加玉米油)圖7是原蟲吞噬細(xì)菌量與時間的回歸分析(25min)D組(添加花生油)具體實(shí)施例方式本發(fā)明的測定方法，包括有以下步驟1)無菌瘤胃液的制備；2)熒光標(biāo)記細(xì)菌(FLRB)的制備；3)吞噬試驗(yàn)；4)氮換算；其中2)步驟中瘤胃液先經(jīng)過400目濾膜過濾后離心，收集沉淀為細(xì)菌，然后用PBS溶液洗滌后懸浸于PBS溶液中；接著加染液對細(xì)菌染色后，將染液倒出，再用PBS溶液洗滌，最后密封冷凍保存待用；3)步驟中將FLRB平衡至39°C后加內(nèi)有活化原蟲的培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬試驗(yàn)，該培養(yǎng)液為由從瘤胃瘺管動物中提取的瘤胃液通過1)步驟中制備成的無菌瘤胃液及人工唾液鹽配制而成。下面對各步驟進(jìn)行詳細(xì)闡述本發(fā)明的1)步驟中的無菌瘤胃液的制備方法為從瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液經(jīng)充分混合后29，OOOXg,20min離心，收集上清，4°C保存，一周內(nèi)使用。本發(fā)明的2)步驟中熒光標(biāo)記細(xì)菌(FLRB)的制備方法為(1)采集瘤胃液過400目濾膜(孔徑38μm)濾膜，濾液離心(22，OOOXg，12min)，收集沉淀為細(xì)菌，用PBS溶液充分洗滌，然后懸浸于同體積的PBS溶液中；(2)加DTAF(三氯三嗪基氨基熒光素)染液(V/V=1/5樣品懸液)染色，60°C水浴2h；(3)離心(22，OOOXg,12min)，將上層DTAF溶液倒出，再用PBS溶液充分洗滌，即密封冷凍保存沉淀(_20°C)待用。本發(fā)明的3)步驟中的吞噬試驗(yàn)的具體操作方式為(1)采集瘤胃液，過80目濾布；收集原蟲沉淀(2)無菌生理鹽水充分洗滌原蟲沉淀，置于培養(yǎng)液，設(shè)置盡量與瘤胃內(nèi)一樣的條件(39°C、厭氧、50r/min搖床)培養(yǎng)30min，培養(yǎng)活化原蟲；(3)取FLRB解凍置于水浴鍋溫度平衡至39°C，加活化原蟲培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，以2、5、10、15、20、25、30、35、40min的時間點(diǎn)用微型吸管分別吸取少量液體，轉(zhuǎn)移至載玻片上，迅速加等量的甲醛固定以停止吞噬活動，采樣制片立即鏡檢；(4)在可見光設(shè)置100-400倍數(shù)下查找原蟲并觀察其形態(tài)，熒光(460nm)觀察并檢測每個原蟲體內(nèi)的FLRB數(shù)，每時點(diǎn)皆3重復(fù)，每片以12個原蟲均值記。本發(fā)明的4)步驟中的氮換算方式為用FLRB平均體積為0.ΙΟμπι3，氮的換算系數(shù)0.054pg/μm3計(jì)算微生物N的吞噬量。本發(fā)明的培養(yǎng)液的制作方式為1)按照和所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物所食用的日糧準(zhǔn)備試驗(yàn)用培養(yǎng)底物，并根據(jù)所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物的唾液配置試驗(yàn)用人工唾液鹽，同時從所圈養(yǎng)的瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液制備無菌瘤胃液，以減少培養(yǎng)液中的自由細(xì)菌數(shù)，使之大大小于所要加入的FLRB濃度而降低對試驗(yàn)的干擾；2)據(jù)體積21的比例將試驗(yàn)唾液和瘤胃液加入到有培養(yǎng)底物的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶持續(xù)通二氧化碳，以營造成厭氧環(huán)境，并將培養(yǎng)瓶置于39°C水浴搖床進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速控制在50r/min。本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式為1)以體重為(19.4士0.8)kg的3只裝有永久性瘤胃瘺管的徐淮山羊圈養(yǎng)，每天分別喂以精(玉米一豆餅)粗(稻草)比為3070的日糧，自由飲水，用于采集瘤胃液以獲得瘤胃細(xì)菌和原蟲；2)培養(yǎng)底物，選用玉米、豆粕和稻草，粉碎過Imm篩，并按以上試驗(yàn)動物的日糧配制精粗比為3070的培養(yǎng)底物，干燥后在4°C保存待用；3)制備無菌瘤胃液從瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液經(jīng)充分混合后29，000Xg，20min離心，收集上清，4°C保存待用。熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌(FLRB)采集瘤胃液過400目濾膜(孔徑38μm)濾膜，濾液離心(22，000Xg，12min)，收集沉淀為細(xì)菌，用PBS溶液充分洗滌，然后懸浸于同體積的PBS溶液中；4)加DTAF(三氯三嗪基氨基熒光素)染液(V/V=1/5樣品懸液)60°C水浴染色2h；再離心(22，000Xg，12min)和用PBS洗滌細(xì)菌沉淀，密封冷凍保存沉淀(-20°C)待用；5)瘤胃原蟲樣品采集采集瘤胃液，過80目濾布；收集原蟲沉淀并用無菌生理鹽水充分洗滌原蟲沉淀；6)稱取1.2g試驗(yàn)用培養(yǎng)底物放入培養(yǎng)瓶，然后以體積12的比例量取40mL無菌瘤胃液、SOmL人工唾液鹽混入瓶中，再加入洗滌后原蟲沉淀，并將培養(yǎng)瓶(持續(xù)通二氧化碳)放置在39°C水浴搖床(搖床50r/min)水浴待用，即為原蟲培養(yǎng)液待做吞噬試驗(yàn)。本發(fā)明采用可見光與熒光技術(shù)，通過可見光鏡檢測可清楚的獲知原蟲的種類；通過熒光鏡檢可進(jìn)行各類原蟲的吞噬速率的測定，見圖1、2.本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，做了多次試驗(yàn)，其中之一試驗(yàn)(人工瘤胃培養(yǎng)瘤胃微生物體系中不加油脂作為對照組，A、b、C、D依次為添加菜籽油、豆油、玉米油、花生油)得出吞噬量、吞噬速率結(jié)果如表1表1對照1~!(菜籽油)B(豆油)C^Sl油)D(花生油)—(min)■筮速率吞噬量承籠速率#—"#吞噬3吞噬i吞噬速率(個)個/(個h)(個)個/(個h)(個)個/(個h)(個)個/(個h)(個)個/(個h)215.3459.05.7171.08.7261.010.7321.014.0420.0540.7488.416.7200.426.0312.028.3339.635.7428.41073.7442.231.3187.842.7256.247.7286.254.0324.01584.7338.846.3185.251.7206.868.7274.877.7310.82098.0294.067.3201.980.7242.194.0282.099.7299.125116.7280.184.3202.3108.3259.9115.3276.7123.3295.930126.7253.495.3190.6115.3230.6121.3242.6132.0264.035130.3223.4104.7179.5128.3219.9131.7225.8137.3235.440132.3198.5109.0163.5129.0193.5134.3201.5142.7214.1由以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，當(dāng)10-15min以后，活化原蟲的吞噬速率開始降低，原蟲已開始消化細(xì)菌，隨著時間的延長，原蟲吞噬細(xì)菌和消化細(xì)菌的速率將逐漸達(dá)到平衡，甚至有時候吞噬細(xì)菌的速率將低于消化細(xì)菌的速率，為了減小因原蟲消化細(xì)菌所帶來的計(jì)算誤差，將時間定在15-25min來計(jì)算可靠性較高。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，采用SPSS16.0軟件對對照、A、B、C、D各組的細(xì)胞吞噬量與吞噬時間(25min內(nèi))進(jìn)行線性回歸分析，所擬合的曲線見圖3-圖7，所擬合的回歸方程分別為Y=4.125000X+18.5749254，R2=0.95；Y=3.3614662X-1.0332707，R2=0.99；Y=4.0832707X+0.5268797，R2=0.98；Y=4.5276316X+1.9674812，R2=0.99；Y=4.7746241X+5.2505639，R2=0.99。式中Y為吞噬量(cells/cell)，X為吞噬實(shí)驗(yàn)的時間(min)。R2基本在0.95以上，表明線性關(guān)系良好、結(jié)果可靠。據(jù)回歸方程計(jì)算的原蟲吞噬速率見表2，分別為267.6、196.2、244.4、274.4、285.4cells/(cellh)。以D組添加花生油的最高，而B組添加菜籽油的最低。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由文獻(xiàn)(洪華生，柯林，黃邦欽，林學(xué)舉.用改進(jìn)的熒光標(biāo)記技術(shù)測定具溝急游蟲的攝食速率.海洋與湖沼，2001，32(3)=260-266.)得知細(xì)菌平均體積為0.IOym3JI的換算系數(shù)0.22pg/μm3；由細(xì)菌的C含量為細(xì)胞干重的50.4%，而氮含量為細(xì)胞干重的12.3%，則C/N=50.4/12.3=4.1，換算出氮的換算系數(shù)0.22/4.1=0.054pg/ym3。微生物N吞噬量的計(jì)算吞噬速率(個/h)Χ0·10(μπι7個)Χ0·054(ρβ/μπι3)如例中的267.6(cells/cellh)計(jì)算過程如下267.6(cells/cellh)X0.10(μm3/cel1)X0.054(pg/μm3)=1·445(pg/cellh)；其他三組以此為1·059、1·320、1·541(pg/cellh)。權(quán)利要求一種瘤胃菌體蛋白循環(huán)的測定方法，其特征在于，包括以下步驟將瘤胃細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記后加入到含有原蟲的培養(yǎng)液中進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，在吞噬實(shí)驗(yàn)連續(xù)間隔的時間點(diǎn)采樣、制片并檢測原蟲體內(nèi)的熒光標(biāo)記細(xì)菌數(shù)，根據(jù)檢測到的吞噬量和時間的關(guān)系擬合回歸方程，得出吞噬速率，然后再用熒光標(biāo)記細(xì)菌平均體積為0.10μm3，氮的換算系數(shù)0.054pg/μm3計(jì)算微生物N的吞噬量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘤胃菌體蛋白循環(huán)的測定方法，其特征在于，所說的培養(yǎng)液由無菌瘤胃液和人工唾液鹽組成，無菌瘤胃液與人工唾液鹽的體積比為12。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的瘤胃菌體蛋白循環(huán)的測定方法，其特征在于，具體步驟為1)無菌瘤胃液的制備；從瘤胃瘺管動物中采集瘤胃液經(jīng)充分混合后，離心收集上清，得無菌瘤胃液4°C保存待用；2)收集瘤胃細(xì)菌并制備熒光標(biāo)記細(xì)菌瘤胃液先經(jīng)過400目濾膜過濾后離心，收集沉淀為細(xì)菌，然后用PBS溶液洗滌后懸浸于PBS溶液中；接著加三氯三嗪基氨基熒光素染液對細(xì)菌染色后，將染液倒出，再用PBS溶液洗滌，最后密封冷凍保存待用；3)吞噬試驗(yàn)將冷凍的熒光標(biāo)記細(xì)菌平衡至39°C后加內(nèi)有活化原蟲的培養(yǎng)液進(jìn)行吞噬試驗(yàn)，在不同的時間點(diǎn)用微型吸管分別吸取少量液體，轉(zhuǎn)移至載玻片上，迅速加等量的甲醛固定以停止吞噬活動，采樣制片立即鏡檢；在普通光設(shè)置100-400倍數(shù)下查找原蟲并觀察其形態(tài)，熒光460nm觀察并檢測每個原蟲體內(nèi)的熒光標(biāo)記細(xì)菌數(shù)；4)氮換算用熒光標(biāo)記細(xì)菌平均體積為0.10μm3，氮的換算系數(shù)0.054pg/μm3計(jì)算微生物N的吞噬量。全文摘要本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)，用于測定反芻動物瘤胃菌體蛋白循環(huán)的方法。該方法是將瘤胃細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記后加入到含有原蟲的培養(yǎng)液中進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，在吞噬實(shí)驗(yàn)連續(xù)間隔的時間點(diǎn)采樣、制片并檢測原蟲體內(nèi)的熒光標(biāo)記細(xì)菌數(shù)，根據(jù)檢測到的吞噬量和時間的關(guān)系擬合回歸方程，得出吞噬速率，然后再用熒光標(biāo)記細(xì)菌平均體積為0.10μm3，氮的換算系數(shù)0.054pg/μm3計(jì)算微生物N的吞噬量。本熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)操作簡便、成本低、適于實(shí)驗(yàn)室測定瘤胃原蟲吞噬速率所用，該方法的使用將有助于打開瘤胃內(nèi)微生物循環(huán)的“黑箱”，促進(jìn)瘤胃微生態(tài)及宿主AA營養(yǎng)的研究。文檔編號C12Q1/06GK101805779SQ20101012758公開日2010年8月18日申請日期2010年3月18日優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日發(fā)明者徐愛秋,曹恒春,李國祥,王夢芝,王洪榮,王超,陳旭偉,高楊申請人:揚(yáng)州大學(xué)