專利名稱：一種檢測乙型肝炎病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測乙型肝炎病毒DNA或RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于 疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域都具有十分重要的 意義。以往在這方面較為準(zhǔn)確靈敏的檢測方法有熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記等方法，這些方法 都需要復(fù)雜的操作和特殊的設(shè)備，應(yīng)用范圍很窄。1993年P(guān)E公司的Dr. Kary B. Mullis發(fā) 明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應(yīng) 用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進(jìn)入了新的時代，Dr. Mullis為此還獲得了 1993 年的諾貝爾化學(xué)獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、操作較簡單等優(yōu)點(diǎn)，但由于其 反應(yīng)進(jìn)行和產(chǎn)品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室 和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學(xué)株式會社研制出了一種新型DNA擴(kuò)增方式，環(huán)介導(dǎo)等溫核酸 擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的高效快速擴(kuò)增，該方法反應(yīng)條件簡單，DNA擴(kuò) 增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。但是對LAMP擴(kuò)增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī) 的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴(kuò)增所帶來的假陽性問題，而且需 要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus)簡稱乙肝病毒，是指引起人類急、慢性肝炎的 DNA病毒，也稱丹氏顆粒，簡稱HBV。乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科，為部分雙鏈環(huán) 狀DNA。HBV的抵抗力較強(qiáng)。我國的乙肝病毒感染率約60%-70% ；乙肝表面抗原攜帶率 約占總?cè)丝诘?. 18%，以此計(jì)算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中乙肝患者大約有 3000萬。目前針對乙型肝炎病毒缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測乙型肝炎病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，從而判定乙型肝炎病毒的存在與否。本發(fā)明試劑盒結(jié)合 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、 快速、準(zhǔn)確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、 傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的乙型肝炎病毒病毒檢測。本發(fā)明試劑盒包括兩部分1.標(biāo)記有可以識別乙型肝炎病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；2.可以擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待 檢測樣品中的乙型肝炎病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。該試劑盒的工作原理為
1.納米金顆粒標(biāo)記有能識別乙型肝炎病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定 在納米金顆粒的表面。 2.待檢測樣品中的乙型肝炎病毒DNA分子或乙型肝炎病毒RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸 擴(kuò)增技術(shù)大量復(fù)制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程后大量復(fù)制，乙型肝炎病毒的目標(biāo)片段被放大IO9倍， 產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA具有多重重復(fù)序列。3.混合納米金顆粒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系，乙型肝炎病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸 擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識別乙型肝炎病毒特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所 示)，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可 以判斷待測樣品是否具有乙型肝炎病毒DNA或RNA。
四

標(biāo)記有分子探針的納米金顆粒與乙型肝炎病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后 的產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集 體。
五具體實(shí)施例方式本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標(biāo)記有可以識別乙型肝炎病毒特定序列的 分子探針的納米金顆粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ 1可以擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病 毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸 擴(kuò)增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20nm的納米金顆粒，濃度為1. 2nM，納米金顆粒表 面標(biāo)記有巰基修飾的DNA探針。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系成分如下0. 2μ M F3禾口 Β3弓丨物，1·6μΜ FIP和BIP引 物，0. 4Mbetaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，IOmM MgSO4,1. 4mM dNTPs, 1 X ThermoPol reactionbuffer(New England Biolabs, Ipswich, MA),80 U Bst DNA polymerase(New England Biolabs) ,6. 25 U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。巰基修飾的DNA探針序列5' -CCTGTTCCGACTACTGAAAAAAAA-SH-3‘引物序列乙型肝炎病毒的F3引物5 ‘ -GCAGTGGAACTCCACAACT-3‘乙型肝炎病毒的B3引物5 ‘ -CAAGAAAAACCCCGCCTGTA-3‘乙型肝炎病毒的FIP引物5 ‘ -TGAACTGGAGCCACCAGCAG-TTCCACCAAACTCTGCAAGA-3‘乙型肝炎病毒的BIP引物5 ‘ -TTCTCGAGGATTGGGGACCCT-GGGGTCCTAGGAATCCTGAT-3‘操作過程如下
1.向裝有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系的管中加入10 μ 1提取的核酸或者血液樣品。2.將裝有混合物的管放入60°C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時混合后的溶液為紅色。4.60°C水浴反應(yīng)15分鐘。觀察反應(yīng)后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有乙型肝炎病毒感染特異性RNA或乙型肝炎病毒DNA ；如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有乙型肝炎病毒感染特 異性的RNA或乙型肝炎病毒DNA。此種情況下，如果樣品是血液樣品，那么提供血樣的人已 經(jīng)被乙型肝炎病毒所感染。
權(quán)利要求
一種用納米金顆粒檢測乙型肝炎病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(1)標(biāo)記有可以識別乙型肝炎病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(1)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢 測樣品中的乙型肝炎病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待 檢測樣品中的乙型肝炎病毒RNA ；⑵納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA 雜交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導(dǎo)致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣 品是否含有乙型肝炎病毒DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分 是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別乙型肝炎病毒的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對象可以是乙型肝 炎病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā) 生在溶液中或者固體表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶 液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢 測。
8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識別環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能 分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反 應(yīng)時間等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測乙型肝炎病毒DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的乙型肝炎病毒檢測。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標(biāo)記有可以識別乙型肝炎病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的乙型肝炎病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
文檔編號C12Q1/68GK101824493SQ201010174488
公開日2010年9月8日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者孫國明 申請人:天津朝?？萍加邢薰?br>