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      一個棉花體細胞胚發(fā)生受體類激酶基因及其應用的制作方法

      文檔序號:583891閱讀:327來源:國知局
      專利名稱:一個棉花體細胞胚發(fā)生受體類激酶基因及其應用的制作方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及一個棉花的體細胞胚發(fā)生類受體激酶,命名為GhSERKl,及其編碼基因序列。本發(fā)明還涉及含有該基因的表達載體,以及利用該基因培育的轉基因植株。
      背景技術
      植物胚胎發(fā)育生物學的范疇廣義地說包含著花的形成,雌雄配子體的發(fā)生,配子 的形成,受精與親和性,以及果實,種子等孢子體形成過程中結構與功能的關系,形態(tài)建成 的生理與分子基礎,以及遺傳信息展現(xiàn)的時空順序等生殖發(fā)育的多個方面(唐錫華等, 2001)。目前,已在植物的花萼、花瓣、花藥、花柱和子房等生殖器官的細胞組織中檢測到 了一些特異蛋白質,這些蛋白質是植物細胞在不同的生殖發(fā)育時期特異基因的表達產物, 被認為與各個時期細胞的功能或組織的形態(tài)建成密切相關?;ǚ郯l(fā)育是一個復雜交錯的過 程。在花粉粒釋放時許多反應都達到最大量。影響花粉發(fā)育的不同階段的突變體已研究了 很多。許多已報道的花粉敗育突變體都是由于孢子體突變,比如花藥的藥室內壁或絨氈層, 因為花藥中壁細胞和孢子細胞間的互作對于小孢子和花粉粒成熟都起著重要的作用。Schmidt等在胡蘿卜(Daucus carota)中尋找能夠監(jiān)測懸浮細胞培養(yǎng)體細胞 向胚性細胞轉變的標記基因時發(fā)現(xiàn)的一段cDNA克隆,氨基酸順序以及激酶體外分析表 明,該基因編碼一種亮氨酸重復受體類激酶LRR-RLK(Schmidt等,2001)。隨后體細胞 胚發(fā)生相關類受體蛋白激酶(SERK)基因相繼地在擬南芥、水稻等多種植物中克隆和表 達,并被證實是植物界中廣泛存在的結構保守基因家族。SERK基因不僅在胚性組織中 表達,還在非胚性組織中表達,參與了植物胚胎發(fā)育、雄性發(fā)育、病害防御和信號傳導等 活動。目前研究發(fā)現(xiàn)SERK基因的表達參與下列過程首先,SERK可標記有胚胎發(fā)生能 力的細胞無論是DcSERK、AtSERK還是MtSERK,研究表明SERK是胚胎發(fā)生細胞的一個 很好的標記。與其它標記如單克隆抗體JIM8、JIM13以及同功酶、酯酶等相比,SERK在 培養(yǎng)條件下顯得具有非常的獨特性,能夠顯示其它標記所不能顯示的被標記細胞與細 胞成胚能力之間的關系(Schmidt ED, 1997 ;Thomas TL,1993 Jianru Ζ, 2002) 其次, SERK 參與油菜素類固醇(brassinosteroid, BR)信號轉導(Russinova E 等,2004) BR參與了包括植物生長發(fā)育、抵抗逆境等許多生理活動。目前已鑒定BR信號轉導的部 分組分,如 BRIl(BR insensitive 1)、BAKl(BRI1-associated receptor kinase 1)、 BIN2 (BR-insensitive2)、BESl (BRI 1-EMS-suppressor lprotein,即 BIN2 底物 1 蛋白)、 BZRl (brassinazoleresistantl protein,即BIN2底物2蛋白)等,各組分的功能和相互 之間的關系也已有了解。BAKl是一種SERK蛋白,等同于AtSERK3。遺傳和生化實驗證明, BAK1/BRI1復合物引發(fā)BR信號。AtSERK3 (BAKl)的一個作用可能是通過改變質膜與胞內體 中BRIl的平衡介導BR信號(Rumyana K等,2006)。第三,SERK參與植物病害防御=LRR-RLKs 參與植物抗病反應的報導較多,如Xa21基因參與了水稻抗白葉枯病反應。OsSERKI屬于 LRR-RLKs之一,不僅能被稻瘟菌侵染誘導表達,還參與了水稻抗稻瘟菌的反應。水稻受稻瘟菌侵染后,OsSERKl被誘導表達,且它的表達量與水稻的抗病性有定性關系(Song WY等,1995 ;Staskawicz BJ等,1995)。最后,SERK參與孢子體發(fā)育目前,有報導稱擬南芥serkl 或serk2的單突變體不能引起孢子體發(fā)育的任何異常表型,但serklserk2雙突變體導致孢 子體發(fā)育不完全或雄性不育。serklSerk2雙突變體的造孢細胞產生小孢子母細胞只能進 行減數(shù)分裂到四分體時期,隨后母性細胞消失,導致雄性完全不育(Catherine A等,2005)。 Tean等觀察到SerklSerk2雙突變體的造孢細胞的外層細胞只能發(fā)育成3層細胞,缺乏野生 型的絨氈層細胞,使孢子體不能正常發(fā)育成成熟的花粉粒,這與emsl/exs和tpdl突變體表 型相似。SerklSerk2雙突變體的不育性可通過用野生型花粉?;謴?,且產生的種子可以正 常發(fā)育。然而目前尚未見SERK基因在重要經濟作物棉花中的報道。

      發(fā)明內容
      本發(fā)明的一個目的是提供棉花GhSERKl基因的基因組序列,全長cDNA序列與氨基 酸序列,它們分別為序列表中SEQ ID NO1、2、3 所示。本發(fā)明的另一個目的是提供棉花GhSERKl基因的開放讀碼框序列,為序列表中 SEQ ID NO 4 所示。本發(fā)明的再一個目的是提供棉花GhSERKl基因的表達載體pK7GGS11683 (CGMCC No 3879),以及這個表達載體上所含有的cDNA序列,它為序列表中SEQ ID NO 5所示。同 時用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體。含有該發(fā)明GhSERKl基因的表 達載體和細胞系,以及含有該類基因的植物品系種均為本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還有一個目的是所述的表達載體可通過使用農桿菌侵染,花粉管通道,基 因槍轉化等導入植物細胞,可使用本發(fā)明的方法轉化的植物宿主包括單子葉植物和雙子葉 植物,例如棉花、水稻、小麥、玉米、油菜、甘蔗、黃瓜、苜蓿等。


      圖1表示利用簡并引物擴增棉花基因組DNA獲得的GhSERKl基因的DNA片段的電 泳圖。圖2表示含有GhSERKl基因組DNA的BAC克隆酶切圖。圖3表示GhSERKl編碼基因開放讀碼以cDNA為模板PCR擴增結果的瓊脂糖電泳 圖。圖4為GhSERKl基因基因組結構(包含預測的轉錄起始位點)。圖5為GhSERKl基因外顯子與內含子結構示意圖。圖6為GhSERKl基因全長cDNA中5,UTR,開放讀碼框(CDS)與3,UTR結構示意圖。圖7為GhSERKl蛋白跨膜結構域預測示意圖。圖8為GhSERKl蛋白結構域示意圖。圖9為在雄性不育系和可育系與生殖發(fā)育相關組織中,GhSERKl基因的表達差異。圖10為轉GhSERKl基因表達載體(pK7GGS11683與pK7GGS17016)的構建過程示意圖。
      圖11為轉表達載體pK7GGS17016棉花的PCR鑒定。圖12為轉表達載體pK7GGS11683棉花的PCR鑒定。圖13為轉表達載體pK7GGSl 1683棉花的花器官表型圖。圖14為轉表達載體PK7GGS17016棉花的花器官表型圖。
      具體實施例方式實施例1棉花GhSERKl編碼基因的克隆材料與方法1)棉花材料棉花材料選用自選品種Y18R。2)菌種大腸桿菌 E. coli DH5 α。3)載體pMD18_T、pK7GWIWG2 (I)。4)工具酶和修飾酶各種限制性內切酶和修飾酶購自TaKaRa公司、NEB公司及 Fermentas 公司。5)化學試劑化學藥品均為國內外分析純。6)引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。下述實施例中所有方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1,棉花GhSERKl基因的克隆(1)棉花基因組的制備采用改良CTAB法提取陸地棉品種Y18葉片部位的基因 組,用于PCR;1)提取液配制IL 提取液含Tris_HCl (PH8. 0)0. IMEDTA (PH8. 0)0. 02MNaCl1. 5MPVP40 (w/v)2%CTAB (w/v)2%以上溶液各自溶解后混合,定容到IL ;臨用前加2% β-巰基乙醇。2)稱取0. 3g幼嫩棉花葉片放入2mL離心管里,加入鋼珠,液氮速凍后,放置于 Genegrid研磨儀上振蕩30s,加入ImL預熱65°C提取緩沖液。顛倒混勻。3)將溶液置于65°C水浴中40分鐘;加等體積氯仿異戊醇(24 1,V/V)振 蕩混勻,4°C離心機12000rpm離心10分鐘,將上清轉移到另一離心管中,用氯仿異丙醇 (24 1,V/V)再抽提一次,離心收集上清;4)加入0. 6倍體積的冰預冷的異丙醇,緩慢顛倒離心管混勻,室溫靜置30min。用 毛細管將絮狀DNA挑出,或者直接室溫12000rpm離心10分鐘,用70%的酒精洗滌1_2次, 再用100%酒精洗滌1次,室溫干燥DNA。5)加 200 μ L TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ΡΗ8. 0)或者純水(ddH20),室溫放置 1小時,或者65°C水浴使DNA完全溶解;6)加入20ul無DNA酶的RNA酶水(10mg/mL),37°C保溫1小時,用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1,V/V)抽提1 2次,將上清轉移到另一個離心管中;7)加0. 1倍體積的3M NaAc (PH5. 2),2倍體積的冰預冷的無水乙醇,混勻后放置5分鐘。緩緩水平轉離心管5分鐘,此時將于界面處形成一團粘稠透明的絮狀沉淀用毛細管輕輕鉤出,轉移到1. 5ml的離心管中;或者直接12000rpm離心10分鐘,沉淀DNA。8)加lmL70%的酒精洗滌沉淀,IOOOOg離心10分鐘,去掉上清,再用70%、100% 的酒精各洗沉淀一次,在空氣中使核酸沉淀干燥;9)用50ul的TE重新溶解沉淀,于_20°C或_70°C貯存。結合生物信息學獲取SERK基因保守片斷EST序列根據(jù)GenBank庫SERK基因結 構特點,結合保守結構域序列設計2條簡并引物上游引物5,CAGTTTCARACHGARGTDGAG3,下游引物5,ATGTTTGCWGCTTTYACRTC3,(M =AorC ;K =GorT ;W =AorT ;R =AorG ;Y =CorT ;S =CorG ;D =AorGorT ;H =AorCorT ;N AorCorGorT)擴增獲得一個目的擴增結果,大小為1500bp,回收后與pMDIS-T載體連接、16°C過 夜,轉化受體菌DH5 α,菌液PCR及酶切鑒定正確的菌株送測序。(圖1中,M =Marker, 1,,2, 3,4,5分別是GhSERKl以棉花基因組DNA為模板PCR擴增獲得1. 5Kb片段)在已知序列的基礎上,設計特異引物上游引物5‘ CAGTTTCAGACAGAAGTAGAG3 ‘下游引物5‘ ATGTTTGCTGCTTTCACATC3 ‘篩選棉花Y18基因組BAC文庫,獲得陽性克隆后(圖2中,1 =Marker, 2 箭頭所指 為陽性BAC克隆插入片段大小),測序獲得GhSERKl的全長基因組序列,為序列表中SEQ ID NO :1 (圖4 為利用Softberry軟件分析獲得GhSERKl基因基因組結構,包含預測轉錄起始 位點后GhSERKl基因全長為6920bp ;其中⑶S表示外顯子,共11個外顯子,10個內含子; TSS表示預測的轉錄起始位點,轉錄起始位點TSS至ATG為453bp ;圖5為GhSERKl基因中 外顯子與內含子的位置及相對片段長度,其中方框為外顯子,直線為內含子,共6467bp ;)。3) GhSERKl全長cDNA序列的獲得采用3,RACE 和 5,RACE 的方法得到 了 GhSERKl 全長 cDNA 序列,3,RACE 和 5,RACE 按TaKaRa公司的3,RACE和5,RACE試劑盒說明操作。具體方法包括以下步驟1、總RNA的提取1)將0. 2g冷凍的材料放入預冷的研缽中,研磨成粉狀,倒入2mL離心管中,加ImL 預熱至80°C的基本提取液,10 μ 1 DTT貯備液和25 μ 1蛋白酶K貯備液,混勻;2) 420C,IOOrpm,溫和搖動 90 分鐘;3)每管加入80 μ 1 2mol/L KCl溶液,調整KCl終濃度至160mmol/L,冰浴1小時;4) 12,OOOrpm離心 20 分鐘,取 900 μ 1 上清液,加入 300 μ 1 8mol/L LiCl,混勻,冰 上過夜沉淀;5) 12,OOOrpm離心20分鐘,棄上清,沉淀用2mol/L LiCl (冰預冷)洗2 3次,直
      至上清液無色;6)懸浮 LiCl-RNA 沉淀于 400 μ 1 10mmol/L Tris-Cl (ρΗ7· 5),混勻,12,OOOrpm 離 心10分鐘,轉移上清至新離心管中;7)加入1/10體積的2mol/L KAc (ρΗ5· 5),混勻,冰浴15分鐘;
      8) 12,OOOrpm離心10分鐘,除去鹽不溶性物質,取上清;9)用2. 5倍體積的無水乙醇于_20°C沉淀過夜或_70°C沉淀2 3小時;10)用70%冷乙醇洗滌RNA沉淀,真空快速干燥,溶于DEPC水中;11)力卩 RNase-Free DNase, 37°C, 30 分鐘;
      12)加等體積的氯仿異戊醇抽提;13)用2. 5倍體積的無水乙醇于_20°C沉淀過夜或_70°C沉淀2 3小時;14)用70%乙醇洗滌沉淀,干燥;15)將RNA溶于DEPC處理的水中備用。2、第一鏈cNDA的合成用東洋紡公司的ReverTra Ace- α -反轉錄酶試劑盒,按試 劑盒說明書進行操作反應體系RNA (1-5 μ g)11. 0μ 1RNase Inhibitor (IOU/μ 1)Ι.ΟμΙ5 X RT buffer4. 0 μ 1dNTP Mixture(IOmmo1/L each)2. 0 μ 1AMV Oligo (lOpmol/μ 1)1· 0 μ 1ReverTra Ace_1. 0 μ 1total20. 0μ 1反應條件42°C,20min;99°C,5min ;4°C,5min ;瞬間離心,_20°C保存。3、設計引物進行3,RACE和5,RACE用于3' RACE 引物3, Primer 5 ‘GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3,3’ Nested Primer 5 ‘CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3’3' RACE fpl 5' -CCTCCTTTTGTACCACCACCGCC-3‘3' RACE fp2 5' -CGCCAATTTCTTCTCCAAGTGGG-3‘用于5,RACE的特異引物5’ Primer 5 ‘ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3‘5' Nested Primer 5' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3‘5' RACE rpl 5' -GTCCAAGATGAACTTCTGGGTCCTC-3‘5' RACE rp2 5' -AATTCTTGAGGTTTCCGCCGACGCC-3‘將擴增出的DNA片段用1 %的瓊脂糖膠分離、回收并連接到pMDIS-T easy Vector,轉化Ε. coli DH5 α,酶切鑒定正確后送華大基因測序,利用生物軟件Vector9. 0、 Conting對獲得的序列進行拼接,獲得基因的全長cDNA序列,為序列表中SEQ IDNO :2,根據(jù) BLAST的分析結果,因為與擬南芥的SERKl基因相似性最高,因此命名為GHSERK1。(圖6為 GhSERKl基因全長cDNA結構,其中5,肌1 為42牝?,開放讀碼框(CDS)為1884bp,3,UTR為 194bp ;)根據(jù)獲得的序列設計引物擴增其開放讀碼框cDNA序列,3'端引物為fp2,5'端 引物為rp2,為方便鑒定,在其5'端引物加入HindIII酶切位點,在其3'端引物加入SalI 酶切位點rp2 5' -CGCAAGCTTATGGAAGGAAGCAAAAAGG-3‘
      fp2 5' -CGCGTCGACCCTTGGACCGGATAACTCAAC-3'PCR反應體系cDNAΙ.ΟμΙ反應buffer (IOX)5. O μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)4. O μ 1fp2(10yM)1. Ομ 1Γρ2(10μΜ)1. Ομ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)1. 25μ 1ddH.O_36. 75 μ 1total50. Ομ 1反應條件:95°C,5min;95°C,30 秒;55°C,45 秒;72°C,2min30s ;35 個循環(huán);72°C, 5min ;4°C,pause。反應結束后,對PCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結果如圖 3所示(泳道M為marker,泳道1為GhSERKlRT-PCR產物得到分子量約為1. 8kb的條帶), 與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收該片段,然后將該回收片 段與pGEM-T Easy (Promega公司)載體進行連接。連接體系PCR 回收產物3. 0μ1pMD18-TΙ.ΟμΙT4DNA LigaseΙ.ΟμΙ反應buffer (10Χ)Ι.ΟμΙddH20_4. 0μ 1total10. 0μ 116 °C保溫過夜。用上述連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)。將重組體系加入感受態(tài)細胞溶液 中,輕輕混勻,置冰上30分鐘。在42 °C下熱激處理90秒,立即置冰上,冰浴2分鐘。加 入500 μ 1 LB液體培養(yǎng)基,37 °C搖床180rpm,培養(yǎng)45分鐘,然后涂布在有氨芐青霉素 (50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)37°C過夜,篩選陽性克隆,得到重組質粒命名為 pGEMTGSl⑶S(CGMCC No 3878)。以該載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷 酸序列測定。最后獲得GhSERKl基因的開放讀碼框序列,為序列表中SEQ ID N0:3,根據(jù)開 放讀碼框序列推測出其蛋白序列為序列表中SEQ ID NO :4。(圖7 為根據(jù)GhSERKl基因的 氨基酸序列預測的跨膜結構域,其中胞外結構域1_241位氨基酸;跨膜結構域242-264位 氨基酸;胞內結構域265-627位氨基酸;圖8為GhSERKl蛋白結構域示意圖,其中外顯子1 編碼信號肽(signal peptide, SP);外顯子2編碼亮氨酸拉鏈結構(leu zipper, ZIP);外顯 子3 6編碼5個富亮氨酸重復序列(leu-rich repeat, LRR),其中除外顯子4編碼LRR2 和LRR3外,其他每一個外顯子編碼一個LRR ;外顯子7編碼含SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富 脯氨酸結構域;外顯子8編碼跨膜結構域(transmembrane region, TM);外顯子9 11編 碼胞內激酶活性結構域。)實施例2GhSERKl基因在棉花中的表達特性分析1,模板制備采用改良的熱硼酸法(上文已述),從棉花兩個雄性可育系(Y18與P30B)和一個雄性不育系(P30A)的與生殖發(fā)育相關的組織花蕾(6個發(fā)育時期 2-day-old, 5-day-old, 7-day-old, 11-day-old, 14-day-old, 18-day-old,以 i @ 3mm 的 花蕾作為現(xiàn)蕾第一天),花萼,花瓣,花藥,胚珠中提取總RNA,其中與可育系Y18與P30B 相比,雄性不育系P30A的表型雌蕊正常發(fā)育,而花粉完全敗育。提取的RNA質量由OD26tl/ OD280比值和0. 7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以其為模板按下列方案進行逆轉錄反應在一 個PCR小管中加入2yg總RNA和IyL Oligo (dT) 1(1,65°C溫育lOmin,然后迅速置于冰上 2min,再力口入 5 XMMLV (RNase H free) Buffter 5 μ L, dNTP (25mmol/L) 5 μ L, Ribonuclease Inhibitor 20U, MMLV 200U,最后用 Nuclease free 水補充至總體積 25 μ L,42 °C 溫育 90min, 72°C lOmin, 95°C水浴 5min 滅活匪LV,得到的 cDNA_20°C保存?zhèn)溆谩?,模板cDNA的相對定量及內標引物的設計根據(jù)棉花延伸因子基因EFl α的序列 信息,內參引物設計如下GhEFl α fp 5' -GCGATCTGGTAAGGAGCTTG 3‘GhEFl α rp 5' -GGAGAAGGTTTCCACAACC-3‘以棉花cDNA做模板,用該引物進行PCR擴增。PCR 反應體系模板 1 μ 1,PCR Buffer 5 μ 1, IOmMdNTP 3 μ 1, GhEFl α fp 1 μ 1, GhEFl α rp 1 μ 1,Taq IU,ddH20 8 μ 1。PCR 條件94 °C,2min ;94 °C,30Sec ;55 °C,30Sec ;72 °C,30Sec ;30cycle ;72 "C, lOmin。根據(jù)PCR產物的電泳結果對模板cDNA進行稀釋,調整模板cDNA的用量,直到 GhEFl α fp和GhEFl α rp引物擴增出的DNA條帶的量基本一致,使每微升溶液中模板cDNA 的含量基本一致。3)熒光定量PCR分析根據(jù)內參基因EFla所設計的引物GhEFl a fp和GhEFl a rp,以及GhSERKl基因的 特異引物SPl 5' -GTTGGCCGAGAGATGGGATG-3‘SP2 5' -ATGCGGACTGGGCTTACAGG 3‘以棉花兩可育系(Y18與P30B)和一個不育系(P30A)上述與生殖發(fā)育相關的組 織cDNA為模板PCR擴增,每個樣品設置3次重復。實時定量PCR擴增體系反應體系如下 cDNA模板0. 2μ L、10y L 2 X SYBR Green I MIXUOymol Γ1 正向引物 0. 4 μ L、10 μ mo 1 L-1 反向引物0. 4μ L,加水到總體積20 μ L0 PCR程序94°C預變性5min ; 94 °C 30s, 59 °C 30s, 721308,44個循環(huán);72151^11,41保存。SYBR Green I染料購買于Toyobo公司,實時熒 光定量PCR儀選用MJ公司的PTC-200,BIO-RAD公司的Chromo4軟件收集數(shù)據(jù)。參考Jiang 等(2007年)所描述的方法用2_Δ Δετ法處理GhPG2基因在各個組織之間相對表達的CT值。 (圖9 中,F(xiàn)B =Flower Bub (花蕾);S印als (花萼);Petal (花瓣);Anther (花藥);Ovule (胚 珠))3,結合棉花發(fā)育特點,熒光定量結果表明1)在花蕾發(fā)育的前三個時期,P30A的花萼與花瓣原基正常分化,此時P30A中 GhSERKl基因表達與可育系相同,呈遞增趨勢;2)在花蕾發(fā)育的第四期至第五期,此時正值棉花雄蕊分化與發(fā)育。根據(jù)細胞學形態(tài)觀察,P30A雄蕊中絨氈層發(fā)育異常,而此時GhSERKl基因表達下降;
      3)到第六期,花蕾已進入雌蕊分化與發(fā)育階段,此時GhSERKl基因表達上升。4)P30A成熟花藥中GhSERKl基因的表達明顯低于P30B。其成熟花萼,花瓣和胚珠與P30B的相近。結論=GhSERKl與棉花的生殖發(fā)育相關,而且可能參與花粉的絨氈層發(fā)育。實施例3、棉花GhSERKl植物表達載體的構建利用Invitrogen公司的GATEWAY系統(tǒng)構建植物表達載體,選擇GhSERKl中兩個 cDNA片段,它們分別為序列表中SEQ IDNO :5、6。分別命名為1683和7016,其中片段1683和 7016是SERK基因保守結構域的兩個部分。將它們分別與pMD18-T連接,命名為pMDGS11683 與pMDGS17016,分別與入門載體pD0NR211進行BP重組反應,將它們重組到pD0NR211上。BP重組體系pMDGS11683orpMDGS170161.0μ 1(50 IOOng)pD0N0R221 (30 50ng)0. 5 μ 1BP enzyme MixΙ.ΟμΙddH20_2. 5μ 1total5. 0μ 125°C保溫 1 小時,加 1 μ 1 Proteinase K,37°C,IOmin 終止反應。將重組產物轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài),經卡那篩選得到陽性克隆,將重組子命 名為 pD0NR211-1683 與 pD0NR211-7016。提取陽性克隆質粒pD0NR211-1683 與 pD0NR211-7016 (統(tǒng)稱 pD0N0R221_GhSERK), 利用LR重組反應將它們分別重組到植物表達載體pK7GWIWG2(I)上。LR重組體系pD0N0R221-GhSERK 質粒(50 IOOng)1. 0 μ 1pK7GWIWG2 (I) (30 50ng)0. 5 μ 1LR enzyme Mix0. 5 μ 1ddH,0_0. 5μ 1total2. 5μ 125°C保溫 1 小時,加 1 μ 1 Proteinase K,37°C,IOmin 終止反應。用上述重組體系轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài),經壯觀霉素篩選得到陽性克隆,將 重組子命名為 PK7GGS11683 (CGMCC No 3879)與 pK7GGS17016。(圖 IOEntry Clone (入門 載體)pD0NR211-1683, pD0NR211-7016 ;Destination Vector (表達載體):pK7GWIWG2 (I); Gene =GhSERKl中兩個cDNA片段,分別命名為1683和7016 ;Binary Vector (雙元載體) PK7GGS11683,pK7GGS17016。)實施例4、棉花GhSERKl轉基因棉花的篩選與獲得1、棉花GhSERKl植物表達載體轉化棉花用gene pulser Xcell電轉儀(美國Bio Rad公司)并參照說明書進行操作,將 質粒PK7GGS11683與pK7GGS17016用電擊轉化法轉化農桿菌LBA4404,經含利福平和壯觀霉 素的抗性平板進行篩選得到農桿菌陽性克隆,再利用噴施農桿菌法,在上述陽性克隆農桿 菌的介導下將PK7GGS11683與pK7GGS17016轉化棉花。
      2、抗性篩選轉基因植株噴施農桿菌法轉化后收到的種子,播種于大田中,培養(yǎng)到幼苗長出8-10片真葉且較粗壯時噴施卡那霉素,可發(fā)生顯色反應的為陽性植株。同時剪取葉片,提基因組DNA鑒定 是否為轉基因株系,鑒定正確的轉基因株系記為Tl代轉基因材料。3、轉基因棉花的PCR鑒定1)棉花基因組DNA的提取上文已詳述。2)轉基因植株的PCR鑒定以步驟1基因組DNA為模板,上游引物1683-sp :5, -GAATGCTGGAAGGTGATGGG-3,;7016-sp :5, -TTGCGTTGGGATCTGCTAGG-3,;下游引物5,-CCATAGGGGTTTAGATGCAACTG-3,;用PCR的方法對轉基因植株進行鑒定,其中上游引物根據(jù)所選擇的棉花SERKl cDNA片段序列設計,下游引物根據(jù)植物表達載體PK7GWIWG2 (I)載體序列設計。PCR反應體系基因組DNAΙ.ΟμΙ反應buffer (IOX)2. 0 μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)1. 6μ 1上游引物(10μ Μ)0. 5μ 1下游引物(10μ Μ)0. 5μ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)0. 5 μ 1dd Η,Ο_13. 9μ 1total20. 0μ 1反應條件:95°C,5min;95°C,30 秒;58°C,45 秒;72°C,2min30s ;35 個循環(huán);72°C, 5min ;4°C,pause。反應結束后,對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結果如圖11, 12所示(圖11 泳道1-9為轉質粒pK7GGS17016的株系,10為陽性質粒pK7GGS17016,11為 野生型,M為marker ;圖12 泳道1_8為轉pK7GGS11683的株系,9為陽性質粒pK7GGS11683, M為Marker,10為野生型植株,11為無模板對照)所有轉基因株系的擴增條帶與陽性質粒 擴增條帶大小一致,與預期大小相符,而野生型則沒有擴增條帶,表明目的基因成功轉入棉 花中。4、轉表達載體pK7GGS11683與pK7GGS17016棉花的花器官表型分別含有干擾載體pK7GGS11683與pK7GGS17016的轉基因棉花花器官的表型為 雌蕊發(fā)育正常,但雄蕊中無花粉粒,即出現(xiàn)雄性完全敗育的現(xiàn)象(圖13 左面為野生型的花 器官,右面為轉表達載體PK7GGS11683棉花的花器官;圖14 左面為野生型的花器官,右面 為轉表達載體PK7GGS17016棉花的花器官)。結合實施例2的結果,說明=GhSERKl基因與棉花生殖發(fā)育相關,而且在雄蕊發(fā)育 中起重要作用。
      權利要求
      一個棉花體細胞胚發(fā)生相關類受體蛋白激酶基因GhSERK1,它的氨基酸序列如SEQ IDNO4所示。
      2.一個棉花體細胞胚發(fā)生相關類受體蛋白激酶基因GhSERKl,其基因組堿基序列如 SEQ IDNO 1 所示。
      3.一個棉花體細胞胚發(fā)生相關類受體蛋白激酶基因GhSERKl,其開放讀碼框(CDS)堿 基序列如SEQ ID NO 3所示。
      4.一個棉花體細胞胚發(fā)生相關類受體蛋白激酶基因GhSERKl,其干擾載體 PK7GGS11683 上含有的 GhSERKl 序列如 SEQ ID NO 5 所示。
      5.根據(jù)權利要求2或3提供的核苷酸序列片段所構建的表達載體,其特征在于含有 任選權利要求2或3所述的其中之一核苷酸片段的表達載體。
      6.根據(jù)權力要求5所述的表達載體,其特征在于所述表達載體為植物表達載體 pK7GGS11683(CGMCC No 3879)。
      7.含有權利要求5、6所述表達載體的轉基因細胞系。
      8.一種培育轉基因植株的方法,其特征在于將權利要求5、6所述的植物表達載體導 入植物細胞,獲得的轉基因植株。
      9.根據(jù)權力要求8所述的方法,其特征在于所述被轉化的目的植物為單子葉植物或 雙子葉植物,如水稻、小麥、棉花、玉米、擬南芥、油菜或大豆等。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一個新棉花體細胞胚發(fā)生相關受體類激酶GhSERK1,及其編碼基因與應用。它的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示;其編碼基因的基因組序列分別如SEQ ID NO1所示;其編碼基因的cDNA序列如SEQ ID NO2所示;其開放讀碼框序列為序列表中SEQ ID NO4所示。本發(fā)明還公開了該基因(GhSERK1)在棉花雄蕊發(fā)育中起重要作用的特性。該基因對培育雄性不育植物品種提供基因源,對培育植物雄性不育系具有重要的意義。
      文檔編號C12N15/63GK101824421SQ20101019047
      公開日2010年9月8日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權日2010年6月3日
      發(fā)明者張銳, 石雅麗, 郭三堆 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所;郭三堆
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