專利名稱：Nppa基因snp檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種NPPA基 因SNP檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)屬于利鈉肽家族，ANP通過與受
體結(jié)合激活鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸水平升高，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。心 房利鈉肽具有利鈉、利尿、舒張血管平滑肌、抑制細(xì)胞增殖等多種作用，在維持血壓、 水/鈉平衡以及在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。心房利鈉肽的編碼基因 (Natriuretic peptide precursor A, NPPA)位于染色體 Ip36，研究表明，NPPA 基因多態(tài)性 在哮喘和高血壓發(fā)生進(jìn)展過程中起著重要作用，此多態(tài)性位點(diǎn)包括位于外顯子3中的 T2238C(rs5065)突變，此突變使第152位的精氨酸被蘇氨酸取代(Argl52Ter)，發(fā)生在外 顯子1中的G664A突變(rs5063)，此突變使第32位的蛋氨酸突變成纈氨酸(Met32Val)， 以及發(fā)生在3，非編碼區(qū)的T85C突變，即rs5067 (A > G)。目前，檢測(cè)NPPA突變的檢測(cè)方法一般是基于PCR技術(shù)的RT-PCR、熒光定量 PCR, PCR-RFLP等，該技術(shù)存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，同時(shí)由 于檢測(cè)通量的局限性，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片。該液相芯片可用于檢 測(cè)NPPA基因三種常見基因型rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和rs5067 (A > G)的野生
型和突變型。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有(A)針對(duì)NPPA基因的SNP位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì) 每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物組成，所述特 異性引物是針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的SEQ IDN0.7和SEQ IDN0.8、針對(duì)rs5065SNP位點(diǎn) 的 SEQ IDN0.9 和 SEQ IDN0.10、禾口 / 或針對(duì) rs5067SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO.12 ；所述 tag 序列選自 SEQID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQ IDN0.13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A) 中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴(kuò)增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067的SNP位點(diǎn)的ADRBl基因 目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.19和SEQ ID N0.20、針對(duì) rs5065SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、和 / 或針對(duì) rs5067SNP位點(diǎn)的 SEQ ID N0.23 和 SEQ IDN0.24。 優(yōu)選地，所述ASPE弓丨物對(duì)為針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.7組成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8組成的序列、針對(duì)rs5065SNP位 點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.9組成的序列以及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 10組 成的序列、禾日/或針對(duì)rs5067SNP位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 11組成的序列以 及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12組成的序列。優(yōu)選地，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述間隔臂序列 為5-10個(gè)T。本發(fā)明的另一目的是提供用于NPPA基因SNP檢測(cè)的特異性引物。具體技術(shù)方案如下一種用于NPPA基因SNP檢測(cè)的特異性引物，包括有針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、針對(duì) rs5065SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID N0.10、 和 / 或針對(duì) rs5067SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的液相芯片與測(cè)序法的結(jié)果吻合率高達(dá)100%。所制備的NPPA 基因SNP檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列 之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與 具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)的并行檢測(cè)。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別 的基因型。3.本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡單，三種SNPs檢測(cè)可通過一步多重PCR即可完成三 個(gè)含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多 不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合 實(shí)際應(yīng)用需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺 陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目， 具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提 高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對(duì)NPPA 基因的三種常見基因型 rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和 rs5067 (A
>G)的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性 引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表INPPA基因的ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對(duì)NPPA基因的SNP位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì)每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物組成，所述特異性 引物是針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8、針對(duì)rs5065SNP位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、禾口 / 或針對(duì) rs5067SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQID NO. 13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中 所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴(kuò)增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067SNP位點(diǎn)的ADRBl基因目標(biāo)序列 的擴(kuò)增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引 物為針對(duì) rs5063SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.20、針對(duì) rs5065SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.22、禾Π / 或針對(duì) rs5067SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 對(duì)為針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的序列以及由SEQ ID N0.2 和 SEQ IDN0.8 組成的序列、針對(duì) rs5065SNP 位點(diǎn)的由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9 組成的序列以及由SEQID N0.4和SEQ ID NO. 10組成的序列、和/或針對(duì)rs5067SNP位 點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ IDNO.ll組成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12組 成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述 間隔臂序列為5-10個(gè)T。
5.—種用于NPPA基因SNP檢測(cè)的特異性引物，其特征是，包括有針對(duì)rs5063SNP 位點(diǎn)的 SEQID N0.7 和 SEQ ID N0.8、針對(duì) rs5065SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、和 / 或針對(duì) rs5067SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種NPPA基因SNP檢測(cè)特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物是針對(duì)rs5063SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、針對(duì)rs5065SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或針對(duì)rs5067SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的液相芯片與測(cè)序法的結(jié)果吻合率高達(dá)100％。所制備的NPPA基因SNP檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102010899SQ20101019684
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會(huì)娟, 許嘉森 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司