專利名稱：GPIIIa和COX-1基因SNP檢測液相芯片以及特異性引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及一種COX-I 和GPnia基因SNP檢測液相芯片以及特異性引物。
背景技術(shù)：
血小板膜糖蛋白(Glycoprotein Illa，GPIIIa)是主要的血小板整合素和激活劑，
它是一種跨膜的糖蛋白復合物。其作用是作為受體，介導纖維蛋白原結(jié)合于血小板表面 及隨后的血小板聚集。GPIIIa包含人類血小板抗原1 (human platelet antigen, ΗΡΑ)或 ΡΙΑ,此基因存在與纖維蛋白原結(jié)合的多態(tài)性位點，美國一項病例對照研究觀察到GPIIIa 基因的白氨酸-33被脯氨酸取代，即HPA-I的T196C突變(Leu33Pro，rs5918，即PLAl/
A2異型抗原系統(tǒng))與急診血栓形成之間有關(guān)聯(lián)，其預告意義在高血壓、吸煙、高膽固醇 血癥或糖尿病等已知冠心病危險因子之上。環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化成類花生酸類物質(zhì)途徑中 重要的限速酶，如前列腺素的合成(Prostaglandins，PGs)。環(huán)氧合酶存在兩種同工 酶，即為COX-I和COX-2，COX-I (Cyclooxygenase 1)屬于管家酶，又名前列腺素內(nèi)過 氧化物 G/H 合成酶(prostaglandin endoperoxide G/H synthase, PTGS1)，在機體的各組織
中均有表達，它產(chǎn)生的前列腺素參與機體正常的生理過程和保護功能，在大多數(shù)正常細 胞中都呈穩(wěn)定表達。一般情況下活性穩(wěn)定，在應激狀態(tài)下或受某些激素、生長因子刺激 時，其活性可輕度增加2倍 4倍。COX-I蛋白由576個氨基酸組成，其編碼基因位于 染色體9，大小約22kb，含有11個外顯子。有研究表明，攜帶不平衡完全連鎖的C50T和 A842G單核苷酸突變的患者，阿司匹林在前列腺素H2合成過程中比正常的基因型起著更 大的抑制作用。此外，COX-I的G123A位點多態(tài)性與阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance， AR)相關(guān)。其中，C50T(rs3842787)位于 COX-I 的 exon2 上，A842G(rsl0306114)發(fā)生 在COX-I的啟動子區(qū)域，G123A(rs3842788)發(fā)生在C0X-1的exon3上。目前對COX-I和GPIIIa多態(tài)性檢測的產(chǎn)品一般基于PCR技術(shù)的熒光定量PCR 法、RFLP法和DNA測序法等，存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點，同時 由于檢測通量的局限性，不能滿足實際應用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，該液相芯片可用 于檢測GPIIIa基因常見基因型T196C的野生型和突變型。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(A)針對GPnia基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對 每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成， 所述特異性引物是針對GPIIIa基因T196C SNP位點的SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A) 中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有T196C SNP位點的GPIIIa基因目標序列的擴增引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為針對GPIIIa基因T196C SNP位點的SEQ ID N0.31 SEQ IDN0.32。更優(yōu)選地，所述ASPE引物對為針對GPIIIa基因T196C SNP位點的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.15組成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16組成的序列。本發(fā)明還提供了 GPIIIa基因SNP檢測的特異性引物，包括有針對T196C SNP 位點的野生型和突變型的SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.16。本發(fā)明的另一目的，是提供一種COX-I和GPnia基因SNP檢測液相芯片，該液 相芯片可以對COX-I和GPIIIa基因進行同步檢測。具體技術(shù)方案如下一種GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(A)針對COX-I基因和GPIIIa基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的 ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異 性引物組成，所述特異性引物是針對COX-I基因C50T SNP位點的SEQ ID N0.9和SEQ ID NO. 10,針對 COX-I 基因 A842GSNP 位點的 SEQIDN0.11*SEQIDN0.12、和 / 或針 對 COX-I 基因 G123A SNP 位點的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ；以及針對GPIIIa 基因 T196C SNP 位點的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A) 中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增具有C50T、A842G和/或G123A SNP位點的COX-1基因目標序 列的擴增引物；以及用于擴增具有T196C SNP位點的GPIIIa基因目標序列的擴增引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為針對COX-I基因C50T SNP位點的SEQ ID N0.25 SEQ ID N0.26，針對 COX-1 基因 A842G SNP 位點的 SEQ ID N0.27 SEQ ID N0.28， 和/或針對COX-I基因G123A SNP位點的SEQ ID N0.29 SEQ ID N0.30 ；以及針對 GPIIIa 基因 T196C SNP 位點的 SEQID N0.31 SEQ ID N0.32。進一步地，所述ASPE引物對為針對COX-1基因C50T SNP位點的由SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.9組成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.IO組成的序列、 針對COX-I基因A842G SNP位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11組成的序列以及由 SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 12組成的序列、禾口 /或針對COX-1基因G123A SNP位點的 由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13組成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 14組成 的序列；以及針對GPIIIa基因T196C SNP位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 15組成 的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16組成的序列。
優(yōu)選地，所述anti-tag序列與微球連接中間的間隔臂序列為5-10個T。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%。所制備的COX-I 和GPIIIa基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及 anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及 tag標簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應，實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢 測。2.本發(fā)明設計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別 的基因型。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，四種SNPs檢測可通過一步多重PCR即可完成四 個具有SNP位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多 不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合 實際應用需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復性差的缺 陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目， 具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提 高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例1 GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對COX-I 基因的三種常見 SNP 位點 C50T(rs3842787)、A842G(rsl0306114) 和G123A(rs3842788)、GPIIIa基因的SNP位點T196C (rs5918)，分別設計特異性引物序 列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對GPIIIa基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成，所 述特異性引物是針對GPIIIa基因T196C SNP位點的SEQ ID NO.15和SEQ ID N0.16 ； 所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中 所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有T196CSNP位點的GPIIIa基因目標序列的擴增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對GPIIIa基因T196C SNP位點的SEQ ID N0.31 SEQ ID N0.32。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為針對GPIIIa基因T196C SNP位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的GPIIIa基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂 序列為5-10個T。
5.用于GPIIIa基因SNP檢測的特異性引物，其特征是，包括有針對T196CSNP位 點的野生型和突變型的SEQ ID NO. 15和SEQ ID N0.16。
6.一種GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對COX-I基因和GPIIIa基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的 ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特 異性引物組成，所述特異性引物是針對COX-I基因C50T SNP位點的SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10、針對 COX-I 基因 A842G SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.12、 禾口 /或針對COX-I基因G123A SNP位點的SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14 ；以及針對 GPIIIa 基因 T196C SNP 位點的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.16 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.8 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQ ID NO. 17 SEQ ID N0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中 所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增具有C50T、A842G和/或G123ASNP位點的C0X-1基因目標序列的 擴增引物；以及用于擴增具有T196C SNP位點的GPIIIa基因目標序列的擴增引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對COX-I基因C50T SNP位點的SEQ ID N0.25 SEQ ID N0.26，針對 COX-I 基因 A842G SNP 位點的 SEQ ID N0.27 SEQ ID N0.28，和 / 或針對 C0X-1 基因 G123ASNP位點的 SEQIDN0.29 SEQIDN0.30 ；以及針對GPIIIa基因 T196C SNP 位點的 SEQ IDN0.31 SEQ ID N0.32。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為針對COX-I基因C50T SNP位點的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.9組成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 10組成的序列、針對COX-1基因 A842G SNP位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11組成的序列以及由SEQ ID N0.4禾口 SEQ ID NO. 12組成的序列、禾口 /或針對COX-1基因G123A SNP位點的由SEQ ID N0.5 禾口 SEQ ID NO. 13組成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列；以及針 對GPIIIa基因T196C SNP位點的由SEQ IDN0.7和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 16組成的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8所述的GPIIIa和COX-I基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所 述間隔臂序列為5-10個T。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GPIIIa基因SNP檢測液相芯片和特異性引物，其主要包括有針對GPIIIa基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對，每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與每種ASPE引物中所選的tag序列互補配對；用于擴增出含有T196C SNP位點的GPIIIa基因目標序列的擴增引物。本發(fā)明還提供了一種COX-1和GPIIIa基因SNP檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片除了具有GPIIIa基因的對應的組成外，還具有針對COX-1基因SNP位點的ASPE引物對、包被有特異的anti-tag序列的微球以及擴增引物。所述檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，能夠避免交叉反應，且可以實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。
文檔編號C12N15/11GK102010900SQ201010196858
公開日2011年4月13日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司