專利名稱：一種從木糖母液得到木糖醇與d-半乳糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)領(lǐng)域制備糖醇的方法，具體涉及通過(guò)構(gòu)建木糖異構(gòu)酶基因 破壞的工程菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis BSxyl (CGMCC No. 3692)凈化木糖母液得 到木糖與D-半乳糖，提供了一種方便有效的從木糖母液中凈化木糖以及D-半乳糖，進(jìn)一步 生成木糖醇與D-半乳糖醇方法。
背景技術(shù)：
蔗渣和玉米芯酸水解液經(jīng)過(guò)中和、脫色、離子交換以及濃縮等凈化工藝后得到富 含木糖的糖膏，梯度降溫結(jié)晶分離木糖后留下的茶褐色粘稠液體即為木糖母液。平均每結(jié) 晶分離一噸的木糖即得到一噸的木糖母液。我國(guó)目前有十余家木糖制造企業(yè)，年產(chǎn)木糖約 5萬(wàn)噸，即有約5萬(wàn)噸的木糖母液。木糖母液含有豐富的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及 D-半乳糖，其含量依木糖母液來(lái)源以及批次不同而異。其中木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及 D-半乳糖的含量分別在40% -50%、15% -25%、10-20%以及7% -15%左右。由于其高糖 濃度使得其粘度很大，而且其成分較為復(fù)雜，除了含有上述單糖外，還含有大量的色素以及 膠體(應(yīng)用化工，38(1) :8-10. 2009)，無(wú)法再通過(guò)現(xiàn)行結(jié)晶技術(shù)分離其中的木糖。因此，目 前各大制造商均以低廉的價(jià)格出售，大大降低了企業(yè)的利潤(rùn)。木糖母液中還含有10%左右 的D-半乳糖，D-半乳糖可以加氫合成D-半乳糖醇(也稱衛(wèi)矛醇)，用來(lái)制備二去水衛(wèi)矛 醇、二溴二去水衛(wèi)矛醇以及二乙酰去水衛(wèi)矛醇，它們除了對(duì)治療慢性粒細(xì)胞白血病具有顯 著的效果外，對(duì)肺癌、骨髓瘤以及肝癌細(xì)胞也具有顯著的抑制作用(中國(guó)癌癥雜志，14(4) 309-312. 2004)。Bacillus subtilis 168具有代謝木糖以及半乳糖的酶系統(tǒng)，但是其不能在含有 木糖或者半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，需要在含有木糖或者半乳糖的培養(yǎng)基中加 入L-阿拉伯糖才能進(jìn)一步利用木糖或者半乳糖，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，加入L-阿拉伯糖后能 夠誘導(dǎo)araE蛋白的表達(dá)，該蛋白除了能夠運(yùn)輸L-阿拉伯糖外還能夠運(yùn)輸木糖以及半乳糖 進(jìn)入細(xì)胞(J Bacteriol. 180(12) :3250_3252· 1998)。B. subtilis 168 利用木糖、L-阿拉 伯糖以及D-半乳糖的代謝途徑研究的也非常深入?？莶菅挎邨U菌代謝木糖的基因組成 一個(gè)操縱子，包含三個(gè)基因，分別為木糖阻遏蛋白基因(xylose repressor, xylR)、木糖異 構(gòu)酶基因(xylose isomerase, xylA)以及木酮糖激酶基因(xylulose kinase, xylB) (J Bacteriol. 171(7) :3840_3845· 1989 ;J Bacteriol. 170(7) :3102_3109· 1988)。破壞木糖 異構(gòu)酶基因后，將使其不能代謝利用木糖，但仍能代謝利用葡萄糖、L-阿拉伯糖以及D-半 乳糖。由于B. subtilis 168本身利用D-半乳糖的能力較弱，因此工程菌BSxyl發(fā)酵凈 化木糖母液后富集了木糖和D-半乳糖，然后進(jìn)一步凈化發(fā)酵液(通過(guò)離子交換、脫色)，將 凈化液加氫，分別得到木糖醇以及D-半乳糖醇。再根據(jù)木糖醇與D-半乳糖醇的溶解度與 熔點(diǎn)的巨大差異很容易將木糖醇與D-半乳糖醇分離(木糖醇在70°C時(shí)是90g，20°C時(shí)為 51g)。通過(guò)常規(guī)的分離結(jié)晶分離到木糖醇與D-半乳糖醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以帶有KpnI與SacI酶切位點(diǎn)的正向引物PxylA-F :5’_tg ggt acc atggct caa tct cat tcc agt tc_3，與反向弓I物 PxylA-R :5，_tg gag ctc t tat act tct aaa atg tattgg ttc-3，為引物，以 Bacillus subtilis 168 總 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR，將 PCR 產(chǎn)物(約1. 3kb)連接入pMD18 T-simple載體中，構(gòu)成新質(zhì)粒pMD-xyl，用KpnI與SacI酶 切 pMD-xyl，回收 KpnI/xyl/SacI 片段，用 KpnI 與 SacI 雙酶切的 pBlueScript II SK(-) 連接，構(gòu)成新質(zhì)粒pBS-xyl，轉(zhuǎn)化E. coli 5α，提取質(zhì)粒用NdeI酶切，回收酶切后的線性 pBS-xyl DNA0 以正向弓丨物 Pcm-F :5，_tg cat atg agg aggatg atg aac ttt aat aaa att gat tta g_3，禾口反向弓I物 Pcm-R :5，_tg cat atg tt ata aaa gcc agtcat tag gcc_3，為 引物，以質(zhì)粒PBCJ164. 3為模板進(jìn)行PCRJf PCR產(chǎn)物連接入pMD18 T-simple載體中，構(gòu)成 新質(zhì)粒pMD-cm，用NdeI酶切質(zhì)粒pMD-cm，回收Ndel/cm/Ndel片段，與 用NdeI酶切后的線 性pBS-xyl DNA連接，構(gòu)成3. 9kb的新質(zhì)粒pBS-Xyl-Cm。以下培養(yǎng)條件未特殊標(biāo)志均為37°C，在LB平板上劃線培養(yǎng)B. subtilis 168 ；挑 取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落轉(zhuǎn)接到含3ml LB液體的試管中培養(yǎng)過(guò)夜；從過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)液中取 200μ 1至8ml SPI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600為0. 8-1. 2 ；取200μ 1至2mlSPII培養(yǎng)基中 IOOrpm培養(yǎng)90分鐘；加入20 μ 1 10mmol/L EGTA到培養(yǎng)基中，繼續(xù)IOOrpm培養(yǎng)10分鐘； 將上述處理的菌液分裝成0. 5ml每管，每管加入5 μ IpBS-Xyl-Cm質(zhì)粒DNA，250rpm培養(yǎng)90 分鐘；將菌液涂布在含有10 μ g/ml氯霉素的LB平板中，培養(yǎng)直至單菌落出現(xiàn)。SP鹽溶 液(0. 2%硫酸銨、1. 4%磷酸氫二鉀、0. 6%磷酸二氫鉀、0. 02%七水合硫酸鎂、0. 檸檬酸 鈉)；CAYE (IOOx) (2% Casamina acid, 10%酵母浸粉)；SPI培養(yǎng)基(SP鹽溶液中加入1% 體積的50%葡萄糖與體積的IOOxCAYE) ；SPII培養(yǎng)基(SPI培養(yǎng)基中加入體積的 50mMCaCl2，體積的 250mMMgCl2)。挑取具有氯霉素抗性的B. subtilis 168轉(zhuǎn)化菌株在含有10 μ g/ml氯霉素的LB 中培養(yǎng)，提取總DNA，以轉(zhuǎn)化菌株DNA為模板，以PxylA-F與PxylA-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段大小為1. 3kb。選取PCR驗(yàn)證陽(yáng)性株在含有 木糖的LB液體試管中培養(yǎng)，以B. subtilis 168為對(duì)照培養(yǎng)24小時(shí)，8000rpm離心5分鐘得 到菌體，超聲破碎菌體細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，選取不表達(dá)木糖異構(gòu)酶的木糖異構(gòu)酶基 因缺失株BSxyl。BSxyl細(xì)胞呈桿狀，成鏈狀排列，兼性好氧，單芽孢，芽孢橢圓或圓形，菌落呈乳白 色不透明，邊緣整齊，表面有皺褶、隆起。能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、乳糖和 D-甘露糖產(chǎn)酸，但利用D-半乳糖的能力較弱，不能利用木糖。最適生長(zhǎng)溫度35-37°C，革蘭 氏染色陽(yáng)性，M. R試驗(yàn)、V. P試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，可利用丙二酸鹽。該菌株的名 稱枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BSxyl，保藏號(hào)=CGMCC NO. 3692，保藏單位中國(guó)普 通微生物保藏中心，保藏日期是2010年3月25日。接種BSxyl到LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木 糖母液，1. 0%酵母粉，0. 5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子 全部接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，制得含木糖與D-半乳糖的發(fā)酵液。將含木 糖與半乳糖的發(fā)酵液在SOOOrpm離心10分鐘，取上清采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(80°C，每分鐘100轉(zhuǎn))，濃縮到含總糖濃度到30% (質(zhì)量體積百分比)以上。然后依次通過(guò)陽(yáng)離子大孔交換樹(shù)脂以 及陰離子大孔交換樹(shù)脂進(jìn)行脫鹽，加入2% (質(zhì)量體積百分比)的粉末狀活性炭脫色60分 鐘以上，進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使總糖濃度達(dá)到70% (質(zhì)量百分比)以上。按2%比例加入 冰醋酸混勻，在4°C加入硼氫化鈉反應(yīng)4小時(shí)，即完成催化加氫的過(guò)程。離心分離晶體，晶體 中加入純凈水，不溶的為D-半乳糖醇，溶液進(jìn)一步重復(fù)結(jié)晶可得到純度大于98%的木糖醇 結(jié)晶。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm培養(yǎng)48小 時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)48小時(shí)的凈化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖代謝不完全，發(fā)酵液中木糖與半乳糖的總純度達(dá)到70. 6%。實(shí)施例2接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm培養(yǎng)60小 時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)60小時(shí)的凈化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木糖與半乳糖的總純度達(dá)到88. 8%。實(shí)施例3接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm培養(yǎng)72小 時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)72小時(shí)的凈化，L-阿 拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木糖與半乳糖的總純度達(dá)到89. 2%。實(shí)施例4接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml發(fā)酵培養(yǎng)基(20%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與 D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)60小時(shí)的凈化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木 糖與半乳糖的總純度達(dá)到87. 5%。實(shí)施例5接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml發(fā)酵培養(yǎng)基(30%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與 D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)60小時(shí)的凈化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木糖與半乳糖的總純度達(dá)到86. 2%。實(shí)施例6接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml發(fā)酵培養(yǎng)基(40%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與 D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)60小時(shí)的凈化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木 糖與半乳糖的總純度達(dá)到56. 2%。實(shí)施例7接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml發(fā)酵培養(yǎng)基(40%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與 D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)72小時(shí)的凈化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木 糖與半乳糖的總純度達(dá)到60. 3%。實(shí)施例8接種工程菌株BSxyl到IOml LB中培養(yǎng)過(guò)夜為一級(jí)種子，將一級(jí)種子5ml轉(zhuǎn)接到 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12%木糖母液，1.0%酵母粉，0.5%蛋白胨，pH6. 5)中200rpm培養(yǎng)過(guò)夜 得到二級(jí)種子，將二級(jí)種子50ml全部接種到450ml發(fā)酵培養(yǎng)基(30%木糖母液，1. 0%酵母 粉，0.5%蛋白胨，pH6.5)中，200rpm培養(yǎng)60小時(shí)，取樣檢測(cè)木糖的含量與純度。將木糖與 D-半乳糖合并計(jì)算，經(jīng)過(guò)72小時(shí)的凈化，L-阿拉伯糖以及葡萄糖均代謝完全，發(fā)酵液中木 糖與半乳糖的總純度達(dá)到88.2%。將含木糖與半乳糖的發(fā)酵液在SOOOrpm離心10分鐘，取 上清采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(80°C，每分鐘100轉(zhuǎn))，濃縮到含總糖濃度到30% (質(zhì)量體積百分比) 以上。然后依次通過(guò)陽(yáng)離子大孔交換樹(shù)脂以及陰離子大孔交換樹(shù)脂進(jìn)行脫鹽，加入2% (質(zhì) 量體積百分比)的粉末狀活性炭脫色60分鐘以上，進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使總糖濃度達(dá)到 70% (質(zhì)量百分比)以上。按2%比例加入冰醋酸混勻，在4°C加入硼氫化鈉反應(yīng)4小時(shí)，即 完成催化加氫的過(guò)程。離心分離晶體，晶體中按2被體積加入純凈水，不溶的為半乳糖醇， 反復(fù)兩次，溶液進(jìn)一步重復(fù)結(jié)晶可得到純度大于98%的木糖醇與D-半乳糖醇。
權(quán)利要求
一種基于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168基因工程菌株Bsxyl，該菌株已經(jīng)于2010年03月25日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保存編號(hào)為CGMCC No.3692。
2.如權(quán)利1要求所述出發(fā)菌株為Bacillussubtilis。
3.如權(quán)利1要求所述破壞Bacillussubtilis的木糖異構(gòu)酶基因，將使其不能代謝利 用木糖，但仍能代謝利用葡萄糖、L-阿拉伯糖以及D-半乳糖，從而達(dá)到凈化木糖母液得到 木糖和D-半乳糖的目的。
4.如權(quán)利1要求所述工程菌株為Bsxyl。
5.如權(quán)利3要求所述采用Bsxyl凈化木糖母液得到木糖和D-半乳糖，進(jìn)一步生產(chǎn)木糖 醇和D-半乳糖醇的目的。
6.如權(quán)利5要求所述最終凈化發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖母液濃度為30%以下，其他培養(yǎng)基成 分為1. 0%酵母粉，0. 5%蛋白胨；發(fā)酵液pH值為6. 0-7. 0 ；200rpm以上搖瓶培養(yǎng)或給與相 應(yīng)的通氣量。培養(yǎng)時(shí)間為60-72小時(shí)。
全文摘要
一種從木糖母液得到木糖醇與D-半乳糖醇的方法本發(fā)明公開(kāi)了一種采用同源交換的方法構(gòu)建枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168木糖異構(gòu)酶基因(xylA)缺失株Bsxyl，利用工程菌株Bsxyl來(lái)凈化木糖母液得到木糖和D-半乳糖，進(jìn)一步催化加氫并結(jié)晶分離得到木糖醇與半乳糖醇的方法。Bsxyl菌株已經(jīng)于2010年03月25日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保存編號(hào)為CGMCC No.3692，該菌種可以凈化木糖母液得到木糖和D-半乳糖。該菌種可以凈化含木糖母液的發(fā)酵培養(yǎng)液，使木糖與半乳糖的總純度達(dá)到88.8％以上，進(jìn)一步催化加氫并結(jié)晶分離得到純度為98％以上的木糖醇與D-半乳糖醇。
文檔編號(hào)C12R1/125GK101870961SQ201010198199
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者姜明國(guó), 楊立芳, 王犇 申請(qǐng)人:廣西民族大學(xué)