專利名稱：一種水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備及方法，尤其涉及一種基于固定化 發(fā)光細菌生物敏感元件的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備和方法，屬于環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和人類活動的加劇，近年來突發(fā)性環(huán)境污染事故頻發(fā)，因為缺 少在線預警措施，不僅給當?shù)卦斐蓸O大的經(jīng)濟損失，還會造成人員傷亡。為了加強河水以及 飲用水源的保護、工業(yè)廢水排放等的預警和管理，國際上紛紛出臺相關(guān)規(guī)定，要求實現(xiàn)水質(zhì) 的連續(xù)毒性控制。但是傳統(tǒng)的毒性試驗都因時間長、費用高，操作繁瑣，不適宜突發(fā)環(huán)境事 件的預警。因此急需一種快速、簡便、經(jīng)濟的檢測方法以便給決策者提供參考。隨著環(huán)境微生物學的發(fā)展，多采用微生物作為指示生物分析水質(zhì)毒性，其中發(fā) 光細菌由于具有較高的靈敏度和操作方便，適于在線分析和應(yīng)用。國外從20世紀60年 代中期開始研究使用發(fā)光細菌檢測環(huán)境，80年代美國的貝克曼公司研制了 Microtox檢 驗技術(shù)的相關(guān)儀器和試劑，在我國直到90年代中期才頒布發(fā)光細菌毒性檢測方法(GT/ T15441-1995)。但它們在測量中需要配制一系列的空白和標準液，操作過程復雜、耗時、繁 瑣，只能在實驗室里檢測，而不能用于現(xiàn)場連續(xù)原位自動化檢測，極大地削弱了該方法的應(yīng) 用。所以國內(nèi)外的研究人員利用發(fā)光菌毒性檢測在水環(huán)境監(jiān)測上的優(yōu)勢研制了不同的發(fā)光 菌傳感器用于現(xiàn)場連續(xù)原位自動化檢測，比如美國SDI公司研制出Deltatox水質(zhì)毒性檢測 儀、Hach公司的LumistOX300等，他們都采用將低溫保存的發(fā)光菌菌液復蘇后作為檢測液， 這就難免會遇到發(fā)光菌發(fā)光不穩(wěn)而出現(xiàn)假陽性，所以近些年有發(fā)展了發(fā)光菌固定化技術(shù)， 比如美國的oak Ridge國家實驗室和Tennessee大學聯(lián)合研制了基于生物發(fā)光的毒性檢測 芯片，將瓊脂固定的菌膜與電路結(jié)合檢測；以色列和韓國的研究者則采用光纖探頭的結(jié)構(gòu)， 把發(fā)光細菌固定于裸光纖頂端，或?qū)l(fā)光細菌固定于連接光纖的套管中。國內(nèi)一些研究中 將發(fā)光細菌吸附固定于混合纖維膜上，敏感膜與硅光二極管直接相連。但是要運用起來面 臨幾個問題發(fā)光細菌世代很短，不能保證其長期穩(wěn)定的發(fā)光；插入凝膠里的光纖探頭檢 測時感光性較差；不能重復利用等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于固定化發(fā)光細菌生物敏感元件的水 質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題，是提供上述設(shè)備對水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備，它包括發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排 液系統(tǒng)、程序控制系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)；發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)由營養(yǎng)液儲備瓶、儲液槽、泵、反應(yīng)試管和軟管組成；營養(yǎng) 液儲備瓶倒置放置通過軟管與儲液槽相連通，儲液槽通過軟管與反應(yīng)試管相連通，并由泵控制儲液槽向反應(yīng)試管8的營養(yǎng)液流加速度，反應(yīng)試管置于可開合的暗室內(nèi)，反應(yīng)試管內(nèi) 放有1 10粒發(fā)光細菌生物敏感元件；加樣系統(tǒng)由樣本槽、泵和軟管組成，樣本槽通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中 的反應(yīng)試管相連通，并由泵控制樣本向反應(yīng)試管的流加速度，插入反應(yīng)試管中的軟管要接 近反應(yīng)試管的底部；排液系統(tǒng)由廢液槽、泵和軟管組成，廢液槽通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中 的反應(yīng)試管相連通，并由泵控制反應(yīng)試管中檢測完畢后的廢液向廢液槽的排放速度，插入 反應(yīng)試管中的軟管要接近反應(yīng)試管的底部；光電檢測系統(tǒng)設(shè)置在反應(yīng)試管底部，數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)通過線路與光電檢測系 統(tǒng)連接，自動計算相對發(fā)光強度，并將數(shù)據(jù)存儲在數(shù)據(jù)存儲卡中，數(shù)據(jù)結(jié)果在數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng) 里顯示； 發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排液系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系 統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)都是由程序控制系統(tǒng)控制實現(xiàn)全自動操作。其中，所述發(fā)光細菌生物敏感元件為直徑為凝膠小球；由如下方法制備得到將 發(fā)光細菌菌懸液與海藻酸鈉溶液混合均勻，將混合液逐滴滴入到氯化鈣溶液中，固化。上述發(fā)光細菌生物敏感元件的制備方法，包括如下步驟(1)將斜面發(fā)光細菌菌種接種到ASW培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 18小時，培養(yǎng)溫度為18 22°C，轉(zhuǎn)速為 180 250r/min ；(2)取步驟(1)制得的菌懸液，進行稀釋至光密度為0. 1 0. 6，將稀釋液加入已 滅菌的冷卻的海藻酸鈉溶液中，在18 22°C下混合均勻；(3)將步驟(3)制得的混合液，用注射器逐滴滴入氯化鈣溶液中，然后固化4 6 小時，用蒸餾水清洗，即得。步驟(2)中，優(yōu)選的條件是，菌懸液，進行稀釋至光密度為0. 1 0. 2。步驟(2)中，所述的海藻酸鈉溶液的濃度為40 80g/L，優(yōu)選40 50g/L。步驟(2)中，所述稀釋液與所述海藻酸鈉溶液的體積比為1 1 10，優(yōu)選 1 1 2。步驟(3)中，所述的氯化鈣溶液的濃度為20 30g/L，優(yōu)選20 23g/L。步驟(3)中，所述混合液與所述氯化鈣溶液的體積比為2 3 100。上述發(fā)光細菌生物敏感元件的保存方法，將發(fā)光細菌生物敏感元件在4°C條件下 保存于儲液中，所述儲液為含有30 40g/L NaCl和0. 5 lg/L CaCl2的水溶液。其中，所述的光電檢測系統(tǒng)使用的可以是任一種光電傳感器。利用上述設(shè)備進行水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的方法，向反應(yīng)試管內(nèi)放入3 5粒發(fā) 光細菌生物敏感元件，利用發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)向反應(yīng)試管內(nèi)加入營養(yǎng)液，再利用加樣 系統(tǒng)向反應(yīng)試管內(nèi)加入樣本，光電檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光強度，數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)采集數(shù)據(jù) 并進行數(shù)據(jù)處理，檢測結(jié)束后，由排液系統(tǒng)將反應(yīng)試管內(nèi)的廢液排入廢液槽，發(fā)光細菌生物 敏感元件繼續(xù)保留在反應(yīng)試管中重復加入發(fā)光細菌培養(yǎng)基、加入樣本、檢測發(fā)光強度、采集 數(shù)據(jù)和排液的操作，連續(xù)監(jiān)測7 10天后，更換新的發(fā)光細菌生物敏感元件，繼續(xù)在線監(jiān) 測。有益效果本發(fā)明的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，操作方便，非專業(yè)人員只需經(jīng)過簡單培訓即可操作和維護；本方法能完全實現(xiàn)水質(zhì)連續(xù)自動化急性毒 性監(jiān)測，而且靈敏度與國標的發(fā)光細菌法相當，極大的簡化監(jiān)測步驟。使用本裝置和方法為 突發(fā)環(huán)境事故提供預警及時的采取相應(yīng)措施，可以極大減少損失。


圖1是本發(fā)明的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1是營養(yǎng)液儲備 瓶，2是儲液槽，3是樣本槽，4是廢液槽，5是泵，6是泵，7是泵，8是反應(yīng)試管，9是光電檢測 系統(tǒng)，10是數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)，11是發(fā)光細菌生物敏感元件。圖2是本發(fā)明的發(fā)光細菌生物敏感元件復蘇后的發(fā)光強度圖。圖3是本發(fā)明的發(fā)光細菌生物敏感元件對蒸餾水連續(xù)運行效果圖。圖4是本發(fā)明的發(fā)光細菌生物敏感元件對pH的響應(yīng)圖。圖5是本發(fā)明的發(fā)光細菌生物敏感元件對毒性物質(zhì)的響應(yīng)圖。圖6是本發(fā)明的發(fā)光細菌生物敏感元件重現(xiàn)性實驗。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā) 明。實施例1 發(fā)光細菌生物敏感元件的制備。將斜面發(fā)光細菌菌種接種到ASW液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時左右，培養(yǎng)溫度為 200C，轉(zhuǎn)速為200r/min ；取上述菌懸液，進行50倍的稀釋，光密度在0. 1左右，將稀釋液加 入已滅菌的冷卻的40g/L海藻酸鈉溶液中，稀釋液與海藻酸鈉溶液的體積比為1 1，在 20°C充分混勻；將上述混合液用注射器逐滴滴入20g/L氯化鈣溶液中固化4小時，混合液與 氯化鈣溶液的體積比為2%，用蒸餾水清洗后浸泡于含有30g/L NaCl和0. 5g/L CaCl2的水 溶液中，放在4°C儲存?zhèn)溆?。將保存的發(fā)光細菌敏感元件放在20°C的環(huán)境下復蘇10分鐘(所述復蘇為將敏感 元件從4°C取出來放在20°C的環(huán)境下的過程)，其發(fā)光強度如圖2所示。實施例2 水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備。如圖1所示，水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備包括發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、 排液系統(tǒng)、程序控制系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)。發(fā)光細菌 連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)由營養(yǎng)液儲備瓶1、儲液槽2、泵7、反應(yīng)試管8和軟管組成；營養(yǎng)液儲備瓶1， 倒置放置通過軟管與儲液槽2相連通，儲液槽2通過軟管與反應(yīng)試管8相連通，并由泵7控 制儲液槽2向反應(yīng)試管8的營養(yǎng)液流加速度，反應(yīng)試管8置于可開合的暗室內(nèi)。加樣系統(tǒng) 由樣本槽3、泵6和軟管組成，樣本槽3通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的反應(yīng)試管8 相連通，并由泵6控制樣本向反應(yīng)試管8的流加速度，插入反應(yīng)試管8中的軟管要接近反應(yīng) 試管8的底部。排液系統(tǒng)由廢液槽4、泵5和軟管組成，廢液槽4通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù) 培養(yǎng)系統(tǒng)中的反應(yīng)試管8相連通，并由泵5控制反應(yīng)試管8中檢測完畢后的廢液向廢液槽4 的排放速度，插入反應(yīng)試管8中的軟管要接近反應(yīng)試管8的底部。光電檢測系統(tǒng)設(shè)置在反應(yīng) 試管8底部。數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)通過線路與光電檢測系統(tǒng)連接，自動計算相對發(fā)光強度，并將數(shù)據(jù)存儲在SD卡中，數(shù)據(jù)結(jié)果在數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)里顯示，例如加入試劑、樣本、5分鐘、10 分鐘、15分鐘的發(fā)光強度和相對發(fā)光強度。發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排液系統(tǒng)、光 電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)都是由程序控制系統(tǒng)控制實現(xiàn)全自動操 作。營養(yǎng)液儲備瓶1內(nèi)裝有營養(yǎng)液，營養(yǎng)液包括如下組分發(fā)光細菌的培養(yǎng)基10% (ν/ ν)，CaCl25g/L，NaCl 300g/L，溶劑為水。其中，發(fā)光細菌的培養(yǎng)基組分如下(g/mL) :Tryptone 0. 5%, Yeast extract 0. 5%, NaCl 3%, Na2HPO4O. 5%, KH2PO4O. 1%，甘油 0. 3%，溶劑為水。使用時，向反應(yīng)試管內(nèi)放入3 5粒用本發(fā)明方法制備的發(fā)光細菌生物敏感元件，利用發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)向反應(yīng)試管內(nèi)加入35 μ L營養(yǎng)液，再利用加樣系統(tǒng)向反應(yīng)試管 內(nèi)加入315 μ L樣本，光電檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光強度，每5分鐘、10分鐘和15分鐘，數(shù)據(jù)處理與 傳輸系統(tǒng)分別采集數(shù)據(jù)并進行數(shù)據(jù)處理，檢測結(jié)束后，由排液系統(tǒng)將反應(yīng)試管內(nèi)的廢液排 入廢液槽，發(fā)光細菌生物敏感元件繼續(xù)保留在反應(yīng)試管中重復加入發(fā)光細菌培養(yǎng)基、加入 樣本、檢測發(fā)光強度、采集數(shù)據(jù)和排液的操作，連續(xù)監(jiān)測7 10天后，更換新的發(fā)光細菌生 物敏感元件，繼續(xù)在線監(jiān)測。實施例3 發(fā)光細菌生物敏感元件對蒸餾水的連續(xù)運行。采用實施例2所描述的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備對蒸餾水的連續(xù)監(jiān)測，監(jiān)測的 效果如圖3所示。說明隨著測試的進行，菌的生長狀況會隨之發(fā)生變化，造成其抑光率發(fā)生 變化，但除個別點外，可以在一定的時間內(nèi)保持相對的穩(wěn)定，可以根據(jù)所測歷史數(shù)據(jù)計算和 設(shè)定動態(tài)報警線來消除這種影響，使計算更為準確。實施例4 發(fā)光細菌生物敏感元件對ρΗ的響應(yīng)。采用實施例2所描述的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備，進行到100個循環(huán)的時候?qū)?樣本槽的樣本換成不同PH的蒸餾水水樣依次進行測試，其效果如圖4所示。說明本發(fā)明的 生物元件有一個較寬的PH耐受范圍，能夠抵抗環(huán)境中酸堿的影響。實施例5 發(fā)光細菌生物敏感元件對毒性物質(zhì)的響應(yīng)。采用實施例2所描述的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備，進行到100個循環(huán)的時候?qū)?樣本槽的樣本換成不同濃度的硫酸鋅水樣依次進行測試，其效果如圖5所示。說明本發(fā)明 能夠靈敏的對不同濃度的毒性物質(zhì)做出響應(yīng)，并且能很快的恢復隨著暴露濃度的提高恢復 時間相應(yīng)的延長，為后續(xù)的測試提供了保障。實施例6 發(fā)光細菌生物敏感元件重現(xiàn)性實驗。用蒸餾水作為樣本進行了 7天的測試，測試的參數(shù)為35 μ L營養(yǎng)液，315 μ L樣本， 時間間隔為2分鐘，反應(yīng)時間15分鐘，連續(xù)自動加樣排液，測試的效果如圖6所示。說明在 連續(xù)測試的過程中小球能夠連續(xù)運行一周的時間而不發(fā)生解體，并且發(fā)光值也穩(wěn)定在一個 很好的范圍內(nèi)，隨著測試時間的延長，會發(fā)生自身的衰減從而使抑光率逐漸上升，但是不影 響測試的進行。
權(quán)利要求
一種水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備，其特征在于它包括發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排液系統(tǒng)、程序控制系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)；發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)由營養(yǎng)液儲備瓶(1)、儲液槽(2)、泵(7)、反應(yīng)試管(8)和軟管組成；營養(yǎng)液儲備瓶(1)倒置放置通過軟管與儲液槽(2)相連通，儲液槽(2)通過軟管與反應(yīng)試管(8)相連通，并由泵(7)控制儲液槽(2)向反應(yīng)試管(8)的營養(yǎng)液流加速度，反應(yīng)試管(8)置于可開合的暗室內(nèi)，反應(yīng)試管(8)內(nèi)放有1～10粒發(fā)光細菌生物敏感元件(11)；加樣系統(tǒng)由樣本槽(3)、泵(6)和軟管組成，樣本槽(3)通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的反應(yīng)試管(8)相連通，并由泵(6)控制樣本向反應(yīng)試管(8)的流加速度，插入反應(yīng)試管(8)中的軟管要接近反應(yīng)試管(8)的底部；排液系統(tǒng)由廢液槽(4)、泵(5)和軟管組成，廢液槽(4)通過軟管與發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的反應(yīng)試管(8)相連通，并由泵(5)控制反應(yīng)試管(8)中檢測完畢后的廢液向廢液槽(4)的排放速度，插入反應(yīng)試管(8)中的軟管要接近反應(yīng)試管(8)的底部；光電檢測系統(tǒng)(9)設(shè)置在反應(yīng)試管(8)底部，數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)通過線路與光電檢測系統(tǒng)(3)連接，自動計算相對發(fā)光強度，并將數(shù)據(jù)存儲在數(shù)據(jù)存儲卡中，數(shù)據(jù)結(jié)果在數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)(10)里顯示；發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排液系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與傳輸系統(tǒng)和數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)都是由程序控制系統(tǒng)控制實現(xiàn)全自動操作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備，其特征在于所述發(fā)光細菌生 物敏感元件(11)為凝膠小球；由如下方法制備得到將發(fā)光細菌菌懸液與海藻酸鈉溶液混 合均勻，將混合液逐滴滴入到氯化鈣溶液中，固化。
3.利用權(quán)利要求1所述的設(shè)備進行水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的方法，其特征在于向反應(yīng) 試管內(nèi)放入1 10粒發(fā)光細菌生物敏感元件，利用發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)向反應(yīng)試管內(nèi)加 入營養(yǎng)液，再利用加樣系統(tǒng)向反應(yīng)試管內(nèi)加入樣本，光電檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光強度，數(shù)據(jù)處理 與傳輸系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)并進行數(shù)據(jù)處理，檢測結(jié)束后，由排液系統(tǒng)將反應(yīng)試管內(nèi)的廢液排入 廢液槽，發(fā)光細菌生物敏感元件繼續(xù)保留在反應(yīng)試管中重復加入發(fā)光細菌培養(yǎng)基、加入樣 本、檢測發(fā)光強度、采集數(shù)據(jù)和排液的操作，連續(xù)監(jiān)測7 10天后，更換新的發(fā)光細菌生物 敏感元件，繼續(xù)在線監(jiān)測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的設(shè)備，它包括發(fā)光細菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、加樣系統(tǒng)、排液系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)，且能實現(xiàn)全自動操作。本發(fā)明還公開了利用上述設(shè)備進行水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測的方法。本發(fā)明的水質(zhì)急性毒性在線監(jiān)測設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，操作方便，非專業(yè)人員只需經(jīng)過簡單培訓即可操作和維護；本方法能完全實現(xiàn)水質(zhì)連續(xù)自動化急性毒性監(jiān)測，而且靈敏度與國標的發(fā)光細菌法相當，極大的簡化監(jiān)測步驟。使用本設(shè)備和方法為突發(fā)環(huán)境事故提供預警及時的采取相應(yīng)措施，可以極大減少損失。
文檔編號C12Q1/02GK101871927SQ201010200079
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者孫旭, 曹妮妮, 楊柳燕, 肖 琳, 趙背生 申請人:南京大學;深圳市朗石生物儀器有限公司