專利名稱：丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列和編碼的氨基酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥用植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一條丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基 因序列、編碼產(chǎn)物及其在丹參水溶性活性成分合成中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科多年生草本植物，在中國及其它亞 洲國家廣泛種植。根入藥，在臨床上可用于心腦血管疾病，癌癥及各種炎癥的治療。丹參位 居我國“十大”大宗藥材之首，其年需求量近2. 4萬噸，銷售價(jià)格近年來一直維持在10元/ 千克左右，僅藥材生產(chǎn)銷售近2. 3億元，以丹參為主要原料制成的中成藥其產(chǎn)值超過100億 元，具有廣闊的開發(fā)利用前景。近年來，伴隨著丹參藥材需求的日益擴(kuò)大和野生資源的逐漸減少，提高丹參藥材 活性成分的含量、培育優(yōu)質(zhì)新品種已成為丹參資源開發(fā)中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。丹參 的活性物質(zhì)分為兩大類一類為水溶性的酚酸類物質(zhì)，包括咖啡酸、丹參素、迷迭香酸、丹酚 酸、紫草酸等；另一類為脂溶性的丹參酮類物質(zhì)，包括丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮等，屬 于二萜醌類化合物。其中，丹參水溶性活性成分因其與傳統(tǒng)中藥以水煎服的用藥方式相一 致越來越受到人們的重視。利用基因工程技術(shù)對(duì)植物代謝途徑的遺傳特性進(jìn)行改造，改良植物性狀及品質(zhì)， 培育能夠大量積累目標(biāo)次生代謝物的植物品種，愈來愈受到人們的關(guān)注。而了解目標(biāo)產(chǎn)物 的生物合成途徑及其調(diào)控方式是利用植物基因工程提高目標(biāo)產(chǎn)物積累、改良植物品質(zhì)的前 提。因此，挖掘丹參的基因資源、篩選丹參的重要功能基因，對(duì)丹參次生代謝物質(zhì)的調(diào)控、分 子育種及品質(zhì)成因等研究等具有重要的意義。迷迭香酸是丹參主要的水溶性成分之一，也是一些復(fù)雜酚酸類化合物的核心組成 單位，丹酚酸和紫草酸等均是由迷迭香酸衍生而來的。目前對(duì)迷迭香酸的生物合成途徑研 究較多，對(duì)丹參的同科植物紫蘇的研究結(jié)果顯示，苯丙烷類代謝途徑和酪氨酸代謝途徑共 同參與了迷迭香酸的合成。酪氨酸代謝途徑中的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)和羥基苯丙酮酸 還原酶(HPPR)，苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和 4-香豆素輔酶A連接酶(4CL)以及迷迭香酸合酶(RAQ均在迷迭香酸的生物合成中發(fā)揮重 要的作用。盡管越來越多的迷迭香酸合成相關(guān)基因從丹參中克隆，但仍有一些酶基因和調(diào) 控基因的序列尚無報(bào)道。?；鳛橐活愔匾男揎椃绞綄?duì)植物次生代謝物的多樣性形成具有重要的意 義。羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶主要參與酚酸類物質(zhì)的生物合成，屬于BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族。目前 羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在煙草(Nicotiana tabacum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、毛 果楊(Populus trichocarpa)等多數(shù)植物中均有報(bào)道，但至今尚無藥用植物丹參中羥基肉 桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列及其功能的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因編 碼的氨基酸序列。本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因 的用途。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是它具有SEQ No. 1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的SEQ No. 1所示的核苷酸序列中，包含一個(gè)長度為1284個(gè)堿基的開放 讀碼框，位于第23-1306位核苷酸。丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆方法步驟如下1、提取核酸取丹參種子在盛有蛭石與草木灰的質(zhì)量比為3 1的基質(zhì)中萌發(fā)，在光照強(qiáng)度為 20001x、相對(duì)濕度為80%的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗交替培養(yǎng)，種子萌發(fā)并 長出第一對(duì)真葉后移栽至營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽中的培養(yǎng)條件與萌發(fā)的條件相同，每隔3天澆 灌一次水，培養(yǎng)60天的丹參幼苗提取DNA、RNA。丹參總DNA的提取采用OMEGA公司的Ε. Ζ. N. A. Plant DNA試劑盒，丹參總RNA 的提取采用OMEGA公司的Ε. Ζ. N. A. Plant RNA試劑盒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA 的質(zhì)量，用分光光度計(jì)測定DNA、RNA的含量。2.克隆基因全長采用RT-PCR和DNA步移方法進(jìn)行基因全長的克隆。分三個(gè)階段進(jìn)行(1)用RT-PCR克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段采用PCR 方法，以 HCTl-D-F 5，-GGCCCTGGTGCCATTCtayccnwwbgc-3‘和 HCT1-D-R5 ’-CGGGCCTGCCCcanccraartc-3’分別為上下游引物，擴(kuò)增得到長度為900個(gè)堿基的羥基肉桂 酰轉(zhuǎn)移酶基因片段，回收，連接到PMD19-T載體上，用T7或M13作為通用引物，測序。上述的pMD19-T載體由日本Takara公司生產(chǎn)。(2)用DNA步移法克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段的上游和下游序列按羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段設(shè)計(jì)序列特異性引物，采用DNA步移法獲得羥基肉 桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段的上游和下游未知序列。PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD19-T載體上，用T7或M13作為通用引物，送至上海生工 生物工程有限公司測序。(3)克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因全長將步驟2的⑴和⑵測序獲得的片段進(jìn)行拼接，按拼接后的序列在起始密碼子 和終止密碼子的兩端分別設(shè)計(jì)上下游特異引物，以丹參cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得丹參羥 基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的全長基因序列(SEQ No. 1)。本發(fā)明具有SEQ No. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的SEQ No. 2由427個(gè)氨基酸殘基組成，在SEQ No. 2所示的氨基酸序列 中，第153-157位的氨基酸序列為His-His-Val-Ala-Asp，第374-378位的氨基酸序列為 Asp-Phe-Gly-Trp-Gly0從丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因得到其編碼的氨基酸序列方法如下
利用DNAMar軟件分析羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列，查找開放閱讀框并翻譯獲得 SEQNo. 2所示的羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列。丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在丹參迷迭香酸和丹酚酸B積累過程中的用途。其使 用方法如下將SEQ No. 1基因位于第814-1023之間的310個(gè)堿基的序列反向連接到中間載體 pKANNIBAL的限制性內(nèi)切酶Bio 1 I與Kpn I之間，將上述310個(gè)堿基的序列正向連接到中間 載體pKANNIBAL的限制性內(nèi)切酶BamH I與Cla I之間，獲得干涉盒，將中間載體上包含35S 啟動(dòng)子-干涉盒-OCS終止子的序列克隆到植物表達(dá)載體PART27的Not I位點(diǎn)，獲得丹參羥 基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的干涉載體，采用氯化鈣方法將該干涉載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中； 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參外源基因轉(zhuǎn)化方法(Yan YP,Wang ZZ. Genetic transformation of the medicinal plant Salvia miltiorrhiza by Agrobacterium tumefaciens-mediated method Plant Cell Tissue Organ Cult，2007，88 :175-184.)獲得丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶 基因干涉的植株。分別采用福林試劑比色法、亞硝酸鈉-氯化鋁比色法和高效液相色譜法 檢測丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因干涉的植株中總酚、總黃酮、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。本發(fā)明克隆基因丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，其表達(dá)量明顯 增加，對(duì)應(yīng)條件下丹參迷迭香酸的積累也有所增加。丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)變化與迷迭香酸和丹酚酸B的積累密切相關(guān)。 丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于調(diào)節(jié)丹參中迷迭香酸及其衍生的丹酚 酸B的含量。因此，該基因的克隆對(duì)于研究丹參次生代謝物質(zhì)調(diào)控、闡明丹參品質(zhì)成因及 培育新品種具有重要的意義。


圖1是茉莉酸甲酯處理?xiàng)l件下丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)分析。圖2A是茉莉酸甲酯處理?xiàng)l件下迷迭香酸的含量。圖2B是茉莉酸甲酯處理?xiàng)l件下丹酚酸B的含量。圖3是丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因RNA干涉載體干涉盒示意圖。
圖4A是未轉(zhuǎn)化對(duì)照丹參株系中迷迭香酸及丹酚酸B的含量測定色譜圖。 圖4B是丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因RNA干涉株系中迷迭香酸及丹酚酸B的含量測定 色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆方法步驟如下1.提取核酸丹參種子采自陜西天士力植物藥業(yè)商洛有限公司商州藥源基地。取丹參種子在盛 有蛭石與草木灰的質(zhì)量比為3 1的基質(zhì)中萌發(fā)，在光照強(qiáng)度為20001x、相對(duì)濕度為80% 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗交替培養(yǎng)，種子萌發(fā)并長出第一對(duì)真葉后移栽至 營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽中的培養(yǎng)條件與萌發(fā)的條件相同，每隔3天澆灌一次水，培養(yǎng)60天的丹參 幼苗提取DNA、RNA。
丹參總DNA的提取采用OMEGA公司的Ε. Ζ. N. A. Plant DNA試劑盒，丹參總RNA 的提取采用OMEGA公司的Ε. Ζ. N. A. Plant RNA試劑盒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA 的質(zhì)量，用分光光度計(jì)測定DNA、RNA的含量。2.克隆基因全長采用RT-PCR和DNA步移方法進(jìn)行基因全長的克隆。分三個(gè)階段進(jìn)行(1)用RT-PCR克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段采用PCR 方法，以 HCTl-D-F 5，-GGCCCTGGTGCCATTCtayccnwwbgc-3‘和 HCT1-D-R5 ’-CGGGCCTGCCCcanccraartc-3’分別為上下游引物，擴(kuò)增得到長度為900個(gè)堿基的羥基肉桂 酰轉(zhuǎn)移酶基因片段，回收，連接到PMD19-T載體上，用T7或M13作為通用引物，送至上海生 工生物工程有限公司測序。上述的pMD19-T載體由日本Takara公司生產(chǎn)。(2)用DNA步移法克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段的上游和下游序列按羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段設(shè)計(jì)序列特異性引物，采用DNA步移法獲得羥基肉 桂酰轉(zhuǎn)移酶基因片段的上游和下游未知序列。DNA步移采用Clonetech公司的試劑盒進(jìn)行。上游未知序列第一輪PCRAPl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，5-GSP1 :5’ -GGGCTGGTACTCGATGTGCTTGAACTG-3，第二輪PCRAP2 :5’ -ACTATAGGGCACGAGTGGT-3，5-GSP2 :5’ -AGTCGGGGCGAAGTCTCCGTAATCATC-3’PCR獲得長度約500個(gè)堿基的片段；下游未知序列第一輪PCRAPl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，3-GSP1 :5’ -ATCGCAACAGACGGGCGGTTTAGGCT-3’第二輪PCRAP2 :5’ -ACTATAGGGCACGAGTGGT-3，3-GSP2 :5’ -CGGGCTACTTTGGCAATGTCATCTTCA-3’PCR獲得長度約500個(gè)堿基的片段；PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD19-T載體上，用T7或M13作為通用引物，送至上海生工 生物工程有限公司測序。(3)克隆羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因全長將步驟2的⑴和⑵測序獲得的片段進(jìn)行拼接，按拼接后的序列在起始密碼子 和終止密碼子的兩端分別設(shè)計(jì)上下游特異引物，5，-TTTCATAAACTACAGTAAAGATATGAAAATC-3，，5，-ACACGGGGCAAAATGGAA-3，以丹參cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因的全長基因序列 (SEQ No. 1)。BLAST結(jié)果證明從丹參中新得到的基因確為一個(gè)羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因。3.丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列同源性比對(duì)
丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的 BLAST軟件搜索已有的Non-redundant Genbank數(shù)據(jù)庫，結(jié)果見表1，其中Query是丹參羥 基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因，Sbjct是唇形科植物彩葉草(Solenostemon scutellarioides)的中 編碼迷迭香酸合酶發(fā)揮作用的羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因，Genbank注冊(cè)號(hào)為AiC83092。由表 1可見，丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因和彩葉草羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在核苷酸水平上具有 65%的同源性。由此可見，丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因與彩葉草羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在 核酸水平上存在較高的同源性，表 1〔9皇
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權(quán)利要求
1.一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列，其特征在于具有SEQ No. 1所示的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列，其特征在于在SEQNo. 1 所示的核苷酸序列中，包含一個(gè)長度為1284個(gè)堿基的開放讀碼框，位于第23-1306位核苷酸。
3.一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列，其特征在于具有SEQ No.2所 示的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求2所述的丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列，其 特征在于SEQ No.2由427個(gè)氨基酸殘基組成，在SEQ No. 2所示的氨基酸序列中， 第153-157位的氨基 酸序列為His-His-Val-Ala-Asp，第374-378位的氨基酸序列為 Asp-Phe-Gly-Trp-Gly0
5.權(quán)利要求1的丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在丹參迷迭香酸和丹酚酸B積累過程中的 用途。
全文摘要
一種丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因序列和編碼的氨基酸序列及其應(yīng)用，具有SEQ No.1所示的核苷酸序列，長為1337個(gè)堿基，在SEQ No.1所示的核苷酸序列中，包含一個(gè)長度為1284個(gè)堿基的開放讀碼框，位于第23-1306位核苷酸；具有SEQ No.2所示的氨基酸序列，第153-157位的氨基酸序列為His-His-Val-Ala-Asp，第374-378位的氨基酸序列為Asp-Phe-Gly-Trp-Gly。丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因丹參羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因在丹參水溶性活性成分積累過程中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102061301SQ20101024581
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者宋婕, 王喆之 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)