專利名稱：一種山羊品種ssr分子標(biāo)記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于基因組SSR分子標(biāo)記鑒定山 羊品種的方法。
背景技術(shù)：
分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平 遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記——形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo) 記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十 分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不 同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo) 性狀的表達(dá)，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在 DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系 鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。常見的分子標(biāo)記有 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制 性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)，ISSR(inter_simple sequence r印eat，簡單序列重復(fù))， RAPD (random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA)，SSR(Simple Sequence R印eats，簡單序列重復(fù))等。RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標(biāo)記位點數(shù)量不受 限制，通?？蓹z測到的基因座位數(shù)為1-4個。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn) 基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。 RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記最主要的缺點是其顯性本質(zhì)，不能區(qū)別與之相關(guān)的位點是純合還是 雜合。SSR為簡單重復(fù)序列(Simple Sequence repeats)的縮寫，是一類以2-6個核苷酸 串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，處于染色體的非編碼區(qū)，是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型遺傳標(biāo)記， 能夠反映動植物在遺傳物質(zhì)DNA水平上的差異，具有較高的多態(tài)性信息量、共顯性分離、標(biāo) 記位點?；浴⒃囼炛貜?fù)性好等特點。已在生物起源、進(jìn)化、遺傳多樣性研究和品種資源鑒 定中得到廣泛應(yīng)用。SSR廣泛分布于真核生物基因組中，山羊品種間同一位點的SSR重復(fù) 次數(shù)的差異，造成品種間等位位點的差異。利用由SSR位點兩翼的非重復(fù)核苷酸序列設(shè)計的 引物，對山羊DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在特定條件下可擴(kuò)增出相應(yīng)位點的DNA片段，經(jīng)過電泳分離， DNA帶紋顯現(xiàn)于凝膠上。凝膠上所顯現(xiàn)的DNA序列長度多態(tài)性片段即為SSR標(biāo)記。鑒于SSR 標(biāo)記方法具有經(jīng)濟(jì)、快捷、分辨率高的優(yōu)點，目前是鑒定山羊品種的最佳分析方法之一。山羊 的SSR指紋是由某些SSR位點所產(chǎn)生的帶型而形成的。目前記錄帶型的方法是，在凝膠某區(qū) 段用1表示有SSR帶紋，用0表示沒有SSR。山羊的每個SSR等位位點的帶型是由2-6個條 帶組成，用1和0記錄帶型時，只記錄每組帶的最上面一條，以下的帶作為影子帶對待帶紋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以鑒別山羊品種的SSR分子標(biāo)記鑒定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下，包括以下步驟(1)在擬鑒定山羊品種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品中隨機(jī)抽取血樣，用樹脂型 基因組DNA提 取試劑盒提取基因組DNA;(2)篩選SSR引物，用每一對SSR弓丨物對不同山羊DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，從中篩選出擴(kuò)增結(jié)果有差異的引物，用于山羊的品種鑒定；(3)利用所篩選的SSR引物對所鑒定山羊的基因組DNA進(jìn)行遺傳參數(shù)的分析，計算 各個山羊群體在SSR座位上的等位基因組成及其頻率，各個群體的基因雜合度和多態(tài)信息 含量，并計算兩群體間遺傳距離；(4)根據(jù)基因雜合度和多態(tài)信息含量判定所鑒定山羊品種是原種還是其雜交后 代；(5)通過分析兩個群體之間遺傳距離值，確定是否是同一品種；(6)利用PopGene32軟件對所鑒定山羊品種與對照品種進(jìn)行聚類，確定是否屬于 同一品種。所述的篩選SSR引物的要求是獲得2-6個等位基因；等位基因分子量的差異在 4bp以上；擴(kuò)增條帶清晰可辨；重復(fù)驗證時，條帶大小誤差不得超過2bp，最終篩選出19對 SSR引物，具體見圖1。所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測采用的是非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。對不同山羊DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，可采用下述擴(kuò)增體系IOul 擴(kuò)增體系中含有10XPCR Buffer (Mg2+Free) Iul, 10mmol/L dNTP 0. 8ul, 25mmol/LMgC12 0. 6ul，20umol/L 兩側(cè)引物各 0. 25ul，Taq DNA 聚合酶 0. 5U，模板 10ng，用 超純水補(bǔ)足IOul。以PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序可為940C 5min — (94°C 30s，退火 45s，72°C 30s) X 30 — 72°C 7min — 4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠于80V下電泳2. 5h，EB(Ethidium bromide，溴化乙錠)染色30min，電泳結(jié)果用Tanon2500R凝膠成像系統(tǒng)記錄和分析。所述的遺傳距離是指Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明方法穩(wěn)定可靠，實驗操作簡單，試驗費用較低，不受生長季節(jié)和年齡差異的 影響，為山羊品種的鑒定、選育和評價提供了科學(xué)依據(jù)。


圖1表示經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選的SSR引物序列及相應(yīng)的重復(fù)類型圖2表示位點BMS2508的電泳圖譜圖3表示位點GClOl的電泳圖譜圖4表示位點BMS648的電泳圖譜
具體實施例方式以下所示實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1
1.在擬鑒定山羊品種和標(biāo)準(zhǔn)對照山羊品種(崇明白山羊)中隨機(jī)抽取30只的血 樣，用樹脂型 基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)提取基因組DNA ；
的瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度計(Beckman DU800)檢測其質(zhì)量，_20°C 保存?zhèn)溆?。樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA的具體操作步驟(1)將全血輕輕混勻后轉(zhuǎn)移0. 3 0. 5ml到Iml純化樹脂中，顛倒混勻5 6次。 室溫下放置3分鐘，其間顛倒混勻一次，5000rpm離心3秒，收集沉淀。 (2)用Iml GN結(jié)合液將純化樹脂懸浮，顛倒混勻，5000rpm離心3秒，收集沉淀。(3)用0. 5ml漂洗液漂洗純化樹脂兩次，顛倒混勻，5000rpm離心3秒，收集沉淀。 如果純化樹脂仍然呈現(xiàn)黃色或褐色，重復(fù)第3步一次。(4)用0. 8ml無水乙醇懸浮純化樹脂，裝入離心純化柱，12000rpm離心1分鐘，倒 掉廢液收集管中的乙醇，3000rpm再離心1分鐘，盡量除盡乙醇。(5)將離心純化柱套入一個干凈的1. 5ml離心管中，開蓋放置2 3分鐘使乙醇揮 發(fā)干凈。加入100 μ ι TE緩沖液(或超純水)于純化樹脂上(不能粘在管壁上)，室溫下 放置3分鐘，12000rpm離心2分鐘。如果對基因組DNA的需求量較大，則重復(fù)第5步1 2 次，這樣可以獲得高產(chǎn)量的基因組DNA。TE緩沖液或超純水的用量視用戶對濃度的要求而 定。將TE緩沖液或超純水50度預(yù)熱對提高回收效率有一定幫助。(6)離心管中收集的液體即是洗脫下來的基因組DNA，取2μ 1電泳(1%瓊脂糖， 120V，20分鐘)檢測。2.篩選引物，擴(kuò)增條帶；(1)從聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和國際動物遺傳學(xué)會(ISAG)聯(lián)合推薦的引物中選取 58對微衛(wèi)星引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按照篩選SSR引物的要求獲得2-6 個等位基因；等位基因分子量的差異在4bp以上；擴(kuò)增條帶清晰可辨；重復(fù)驗證時，條帶大 小誤差不得超過2bp，從中篩選出19對擴(kuò)增條帶清晰，重復(fù)性好的位點(如圖1所示)；(2) SSR-PCR 擴(kuò)增，采用 IOul 反應(yīng)體系，其中 10XPCR Buffer (Mg2+Free) Iul， IOmmol/LdNTP 0. 8ul,25mmol/L MgCl2 0. 6ul，20umol/L 兩側(cè)引物各 0. 25ul，Taq DNA 聚合 酶0. 5U，模板10ng，用超純水補(bǔ)足IOul。PCR擴(kuò)增反應(yīng)均在東盛公司EDC-810PCR擴(kuò)增儀 上進(jìn)行，反應(yīng)程序為94°C 5min — (94°C 30s，退火 45s，72°C 30s) X 30 — 72°C 7min — 4°C 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠于80V下電泳2. 5h檢測，EB (Ethidium bromide，溴化乙錠)染色30min。電泳結(jié)果用Tanon2500R凝膠成像系統(tǒng)記錄和分析。如圖 2，圖3，圖4所示，其中M為Marker ； 1-8為8個電泳泳道。圖2中泳道1，2 ；圖3中泳道5， 6 ；圖4中1-4，7都是擴(kuò)增出1個條帶，說明在各自位點上是純合的；其余泳道都是擴(kuò)增出2 個條帶，說明各個體在各自位點上是雜合的。3.利用19對SSR引物對所鑒定的山羊品種的基因組DNA進(jìn)行分析，計算各個山 羊品種在19個SSR座位上的等位基因組成及其頻率，兩個群體的基因雜合度和多態(tài)信息含 量，并計算兩群體間Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。等位基因頻率、基因雜合度和Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離均由軟件P0PGENE32計算得到， 多態(tài)信息含量由多態(tài)信息計算程式PIC計算得到。群體基因雜合度H計算公式H=I-Iijif
其中i為第i個等位基因，Pi為第i個等位基因頻率，η為等位基因數(shù)。多態(tài)信息含量計算公式 其中i、j為第i和j個等位基因，Pi和Pj分別為第i和第j個等位基因頻率，η為等位基因數(shù)。Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離Ds，是由下面的公式計算得到的 式中Xij-X群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率，Yij-Y群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率，mr第j個座位上的等位基因數(shù)；r_檢測的座位數(shù)。計算得到的擬鑒定的山羊品種基因雜合度為0.6368，崇明白山羊為0.6316，兩群 體間Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離為0. 3030，兩個群體的多態(tài)信息含量如表1所示表 1 4.基因雜合度的值反映兩個等位基因不相同的可能性，多態(tài)信息含量表示微衛(wèi) 星多態(tài)性高低的程度。多態(tài)信息含量小于0.25時，為低度多態(tài)性位點；當(dāng)多態(tài)信息含量在 0.25-0. 5之間時為中度多態(tài)性位點；當(dāng)其值大于0.5時，為高度多態(tài)性位點。本發(fā)明中多 態(tài)信息含量在0. 7221-0. 9300之間，均為高度多態(tài)性位點，能夠滿足個體識別的要求。根據(jù) 計算得到的兩個群體的基因雜合度分別為0. 6368和0. 6316，雜合度普遍偏高，因此判定崇 明白山羊和所鑒定的品種大部分都為雜交后代。5.通過分析兩個群體之間遺傳距離值，確定是否是同一品種或同一群體。如果 兩者之間的遺傳距離小于0. 05，說明是同一品種或同一群體；如果兩者之間的遺傳距離 在0. 05-0. 20，說明兩者是親本與其雜交后代的關(guān)系；如果大于0. 20，表明兩者可能親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)或者不是來自同一群體；根據(jù)計算得到的兩群體間Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離為 0. 3030，說明擬鑒定的群體和崇明白山羊親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，不是同一群體。6.利用PopGene32軟件對所鑒定的山羊品種與對照品種進(jìn)行聚類，結(jié)果在0. 05的 聚類水平上聚為兩類，與根據(jù)Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離判定的結(jié)果一致。上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā) 明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的 一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表
<110>楊姣劉志學(xué)陳士超羅倩倩鄭佩培
<120> 一種山羊品種SSR分子標(biāo)記鑒定方法
<160>38
<210> 1 <211>21 <212>DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.) <400> 1
TCTTCTCTGC ACTTTGGTTG C
<210>2 <211>20 <212> DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.) <400>2
ATAGCTGACA TCCACTGGGC
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.) <400>3
ATCAGTCGTT CCCAGAATGT C
<210>4 <211>22 <212> DNA
<213> 山羊禾中(Capra hircus L.) <400>4
TTGATATCCT CTCTGTCAAG CC
<210> 5 <211>21 <212>DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.)
<400> 16
TTTTCTGGAT GTTGAGCCTATT
<210> 17 <211>26 <212>DNA
<213〉山羊種(CaprahircusL.) <400> 17
GACTCTAGAG GATCGCAAAG AACCAG
<210> 18 <211>28 <212> DNA
<213> 山羊禾中(Caprahircus L.) <400> 18
GAGTTAGTAC AAGGATG AC A AGAGGC AC
<210> 19 <211>22 <212>DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.) <400> 19
CCATCACTGC TATTCTACCT CC
<210> 20 <211〉 21 <212>DNA
<213〉山羊種(Caprahircus L.) <400> 20
CACAGCCAAT TTCTGATTTC A
<210>21 <211>23 <212> DNA
<213> 山羊禾中(Caprahircus L.) <400> 21
CACCTTCTAT GCTTCCACTC TAG
<400> 27
GACTTGCCCC AATCCTACTG
<210> 28 <211>21 <212〉DNA
<213> 山羊種(Caprahircus L.) <400> 28
ATTTC AGGTT TGTTGGTTCC C
<210>29 <211>22 <212>DNA
<213> 山羊種(Caprahircus L.) <400> 29
TTTCTGGGAT TACAAAATGC TC
<210>30 <211>22 <212>DNA
<213> 山羊種(Caprahircus L.) <400> 30
TTTCTTAGGG GAGTGTTGAT TC
<210>31 <211>23 <212>DNA
<213> 山羊種(CaprahircusL.) <400>31
CC AGAATATA GAGTTTTGTC AAG
<210> 32 <211>22 <212> DNA
<213> 山羊種(Caprahircus L.) <400> 32
GCCTGATTTG TATTTGTATG AG
權(quán)利要求
一種山羊品種SSR分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟(1)在擬鑒定山羊品種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品中隨機(jī)抽取血樣，用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；(2)篩選SSR引物，用每一對SSR引物對不同山羊DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，從中篩選出擴(kuò)增結(jié)果有差異的引物，用于山羊的品種鑒定；(3)利用所篩選的SSR引物對所鑒定山羊的基因組DNA進(jìn)行遺傳參數(shù)的分析，計算各個山羊群體在SSR座位上的等位基因組成及其頻率，各個群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量，并計算兩群體間遺傳距離；(4)根據(jù)基因雜合度和多態(tài)信息含量判定所鑒定山羊品種是原種還是其雜交后代；(5)通過分析兩個群體之間遺傳距離值，確定是否是同一品種；(6)利用PopGene32軟件對所鑒定山羊品種與對照品種進(jìn)行聚類，確定是否屬于同一品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的篩選SSR引物的要求是獲得2-6個 等位基因；等位基因分子量的差異在4bp以上；擴(kuò)增條帶清晰可辨；重復(fù)驗證時，條帶大小 誤差不得超過2bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用 下述擴(kuò)增體系IOul 擴(kuò)增體系中含有10XPCR Buffer (Mg2+Free) Iul, 10mmol/L dNTP 0. 8ul, 25mmol/LMgC120. 6ul，20umol/L 兩側(cè)引物各 0. 25ul，Taq DNA 聚合酶 0. 5U,模板 IOng,用超 純水補(bǔ)足IOul。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用 PCR擴(kuò)增程序為940C 5min — (94°C 30s，退火 45s，72°C 30s) X 30 — 72°C 7min — 4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測采用的是 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的遺傳距離是指Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距罔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法篩選得到的SSR特異性引物，分別包括下列表格中19對 引物序列全文摘要
本發(fā)明公開了一種山羊品種SSR分子標(biāo)記鑒定方法，主要包括從樣品中隨機(jī)抽取血樣，用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；篩選SSR引物，用每一對SSR引物對不同山羊DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，從中篩選出擴(kuò)增結(jié)果有差異的引物，用于山羊的品種鑒定；利用PopGene32計算等位基因組成及其頻率，通過群體雜合度、多態(tài)信息含量、遺傳距離等遺傳參數(shù)的分析進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定品種。本發(fā)明提供的鑒定山羊品種的SSR分子標(biāo)記方法穩(wěn)定可靠，不受生長季節(jié)和年齡差異的影響，為山羊品種的鑒定、選育和評價提供了科學(xué)依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK101914626SQ20101026741
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉志學(xué), 楊姣, 羅倩倩, 鄭佩培, 陳士超 申請人:同濟(jì)大學(xué)