專利名稱：一株鎘鹽抗性面包酵母及其應(yīng)用的制作方法
一株鎘鹽抗性面包酵母及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株鎘鹽抗性面包酵母及其在生產(chǎn)富 含谷胱甘肽面包酵母菌體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的生物活 性三肽，在生物體內(nèi)分為還原型和氧化型，其中還原型GSH分子中同時含有Y-谷氨?；?活性巰基，可參與多種生物反應(yīng)，對維持細(xì)胞的正常狀態(tài)具有重要意義。GSH在抗氧化、清除 自由基、解毒、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗癌、抗放射線等方面發(fā)揮重要作用，是重要的功能 因子，因此，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用前景廣闊。谷胱甘肽的生產(chǎn)方法有溶劑萃取法、化學(xué)合成法、生物法，生物法包括酶法和發(fā)酵 法，其中發(fā)酵法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生谷胱甘肽，與其他方法相比具有簡便、易控、易 擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點，是目前主要的谷胱甘肽生產(chǎn)方法。發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的關(guān)鍵問題在于 如何提高細(xì)胞密度以及細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽含量，二者的有機(jī)結(jié)合將有利于谷胱甘肽產(chǎn)量的 大幅度提高。細(xì)胞密度的提高可通過對發(fā)酵過程的優(yōu)化控制(包括高密度培養(yǎng))獲得，而胞 內(nèi)谷胱甘肽含量的提高通常是由菌種選育來實現(xiàn)的，主要有兩種方法一是采用常規(guī)誘變 育種選育高產(chǎn)菌株，二是利用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建具有谷胱甘肽合成酶活性的基因工程菌。目前能較多地積累谷胱甘肽的菌種主要為酵母菌，采用的菌種選育方法主要是化 學(xué)誘變法(亞硝基胍、硫酸二乙酯等)和物理誘變法(紫外線和X射線)，得到的突變株以 乙硫氨酸抗性株、甲硫氨酸敏感株、鋅離子抗性株等為主，本發(fā)明經(jīng)紫外和硫酸二乙酯復(fù)合 誘變，以硫酸鎘抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到一株鎘鹽抗性、胞內(nèi)GSH生成量提高的面包酵母 菌株。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一株鎘鹽抗性面包酵母突變株以及利用該菌株生產(chǎn)富含谷胱 甘肽酵母菌體的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一株鎘鹽抗性面包酵母，所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54-ll_ll 于2010年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC No. 4189。一種應(yīng)用所述鎘鹽抗性面包酵母生產(chǎn)富含谷胱甘肽面包酵母菌體的方法，步驟 為1)從活化斜面上挑取一環(huán)BV54-11-11菌體接入種子培養(yǎng)基中，在溫度為26 30°C下靜置培養(yǎng)20 24h，即得種子液；2)將種子液以5 15%接種量，接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為裝液 量(30 80)mL/250mL、轉(zhuǎn)速 150 200r/min、溫度 26 30°C、pH 值 5. 5 6. 5、培養(yǎng)時間20 30h。所述種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。所述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖25 35g/L、玉米漿0. 3 1. 0% (ν/ν)、 (NH4) H2PO4 (1 3) g/L、KH2PO4 (0. 5 2) g/L、MgSO4 · 7Η20 (0· 05 0. 3) g/L。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明提供了一株鎘鹽抗性、可在胞內(nèi)富集谷胱甘肽的面包酵母菌株，應(yīng)用該面 包酵母可發(fā)酵得到富含谷胱甘肽的面包酵母菌體，谷胱甘肽胞內(nèi)含量可達(dá)19mg/g干菌體； 所得富含谷胱甘肽的面包酵母菌體既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌體蛋白兩 種產(chǎn)品，也可以直接作為功能性酵母使用。
具體實施方式實施例1 鎘鹽抗性、可富集谷胱甘肽面包酵母菌株的誘變篩選1)紫外誘變及篩選以面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54為出發(fā)菌株，從斜面上挑取一環(huán) BV54置于50mL YPD培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)36h，制備一級種子。以2%接種量接種于裝有 50mL YPD的250mL三角瓶中，30°C，150r/min培養(yǎng)10h，使菌體生長處于對數(shù)生長末期。搖 勻后取ImL菌液，用0. 85%的生理鹽水稀釋到菌體濃度103，分別取0. ImL稀釋液涂布于含 有不同濃度鎘鹽的抗性驗證平板上，30°C培養(yǎng)3 4d，觀察其生長情況，如表1所示。表1面包酵母BV54鎘鹽抗性驗證
鎘離子濃度(mmol/L)0 0.20 0.40 0.60 0.80 0.901.001.10BV54生長情況+++++++ + +--“++” 表示有較強(qiáng)的生長；“ + ” 表示有較弱的生長；“_” 表示不能生長由表1可知，面包酵母BV54在0. 90mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱的生長，而在
1.OOmmol/L鎘鹽抗性平板上不能生長，故選擇含1. OOmmol/L硫酸鎘的YPD平板作為面包酵 母BV54紫外誘變初篩平板。以面包酵母BV54為出發(fā)菌株，根據(jù)酵母GSH生成量和其鎘鹽抗性的關(guān)系，利用 鎘鹽抗性平板來篩選GSH產(chǎn)量提高的突變株。選擇致死率為85%的紫外誘變劑量(照射 120s)對面包酵母進(jìn)行誘變，將誘變后的菌液均勻涂布于1. Ommol/L的鎘鹽抗性平板上， 30°C避光培養(yǎng)3 4d后挑取突變株，最后獲得39株GSH明顯提高的面包酵母突變株，命名 為BV54-1 BV54-39，選擇谷胱甘肽含量提高明顯的BV54-11菌株進(jìn)行化學(xué)誘變。2)化學(xué)誘變及篩選按上述面包酵母BV54培養(yǎng)方法培養(yǎng)BV54-11，確定鎘鹽抗性篩選平板。結(jié)果見表2。表2面包酵母BV54-11鎘鹽抗性驗證
鎘離子濃度(mmol/L) 0 0.20 0.40 0.60 0.80 0.90 1.00 1.10
-
BV54-11 生長情況+++++++ + + + - “++” 表示有較強(qiáng)的生長；“ + ” 表示有較弱的生長；“_” 表示不能生長
面包酵母BV54-11在1.00mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱的生長，而在1. IOmmol/L 鎘鹽抗性平板上不能生長，故選擇含1. 10mmol/L硫酸鎘的YPD平板作為面包酵母BV54-11 化學(xué)誘變初篩平板。選擇致死率為80. 5%的DES用量(0. 146% )對處于對數(shù)生長末期的面包酵母 BV54-11進(jìn)行誘變處理15min，將誘變后的菌液均勻涂布于含有1. lOmmol/L鎘鹽的YPD平 板上，30°C培養(yǎng)3 4d。待菌落長出后，挑選生長快、菌落大的單菌落點接于YPD平板上，并 編號BV54-11-1 BV54-11-51。將抗性突變株與出發(fā)株分別進(jìn)行GSH發(fā)酵實驗，發(fā)酵22h 后測定胞內(nèi)谷胱甘肽生成量，得到一株GSH產(chǎn)量明顯提高的突變株BV54-11-11，較原菌株 GSH產(chǎn)量提高68 %，結(jié)果見表3。表3突變株與出發(fā)菌株GSH生成量比較
權(quán)利要求
一株鎘鹽抗性面包酵母，其特征在于所述面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BV54 11 11于2010年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4189。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述鎘鹽抗性面包酵母生產(chǎn)富含谷胱甘肽面包酵母菌體的方 法，其特征在于步驟為1)從活化斜面上挑取一環(huán)BV54-11-11菌體接入種子培養(yǎng)基中，在溫度為26 30°C下 靜置培養(yǎng)20 24h，即得種子液；2)將種子液以5 15%接種量，接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為裝液量 (30 80)mL/250mL、轉(zhuǎn)速 150 200r/min、溫度 26 30 °C、pH 值 5. 5 6. 5、培養(yǎng)時間 20 30h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用鎘鹽抗性面包酵母生產(chǎn)富含谷胱甘肽面包酵母菌體的方 法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用鎘鹽抗性面包酵母生產(chǎn)富含谷胱甘肽面包酵母菌體的方 法，其特征在于所述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖25 35g/L、玉米漿0. 3 1. 0% (v/v)、(NH4) H2PO4 (1 3) g/L、KH2PO4 (0. 5 2) g/L、MgSO4 · 7Η20 (0· 05 0. 3) g/L。
全文摘要
一株鎘鹽抗性面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54-11-11于2010年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4189。應(yīng)用該鎘鹽抗性面包酵母生產(chǎn)富含谷胱甘肽面包酵母菌體的方法是1)從活化斜面上挑取一環(huán)BV54-11-11菌體接入種子培養(yǎng)基中，制得種子液；2)將種子液以5～15％接種量，接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。本發(fā)明的優(yōu)點在發(fā)酵得到富含谷胱甘肽的面包酵母菌體中，谷胱甘肽胞內(nèi)含量可達(dá)19mg/g干菌體，既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌體蛋白兩種產(chǎn)品，也可以直接作為功能性酵母使用。
文檔編號C12N1/18GK101955890SQ201010503178
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者呂鴻雁, 張翠英, 杜麗平, 肖冬光, 郭學(xué)武, 陳葉福 申請人:天津科技大學(xué)