專利名稱：(2r,3r)-2，3-丁二醇脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa ATCC12321)的(跗，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2，3-丁二醇0，3-butanediol，BD)廣泛用于化工、食品、航空航天燃料等領(lǐng)域。 其脫水產(chǎn)物甲乙酮可作樹脂、油漆等的溶劑；酯化后的脫水產(chǎn)物1，3_ 丁二烯可用于合成橡 膠、聚酯和聚亞胺酯；熱值較高饑200kJ/kg)可作為燃料添加劑；與甲乙酮脫氫形成辛烷 異構(gòu)體可生產(chǎn)高級(jí)航空用油；BD還可制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸 藥及藥物手性載體等。BD化學(xué)合成成本高且過程繁瑣，工業(yè)化生產(chǎn)較困難。生物法制備 BD目的是避免化學(xué)合成的困難，實(shí)現(xiàn)由傳統(tǒng)的石油冶煉向可再生資源為原料的生物煉制轉(zhuǎn) 型。而作為手性中間體的(2R，3R)-2，3_ 丁二醇主要用于高附加值的藥物中間體和液 晶材料等精細(xì)化學(xué)品，其價(jià)格是內(nèi)消旋型2，3_ 丁二醇的1000倍以上，雖然其市場需求不 大，但是利潤驚人。相對(duì)于內(nèi)消旋型2，3- 丁二醇，手性純OR，3R) -2，3- 丁二醇的研究還比 較少，對(duì)其基因和酶學(xué)的研究更是少見?，F(xiàn)唯一報(bào)道過的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶僅有 從釀酒酵母中分離獲得的菌株，但是該菌株并不適宜用于工業(yè)生產(chǎn)丁二醇，產(chǎn)量極低(ImM 左右)，該酶僅是維持酵母菌自身生理功能所需，沒有實(shí)際工業(yè)應(yīng)用價(jià)值J. Bio. Chem.， 275(46)，35876-35885(2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種工業(yè)應(yīng)用價(jià)值較高的(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶。本發(fā)明所提供的OR，3R)-2，3_ 丁 二醇脫氫酶來源于多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus po lymyxa ATCC12321)，購自美國生物資源保藏中心(http://www.atcc. org/)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO=I的氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代、缺失或 添加且具有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶或乙偶姻還原酶作用的蛋白質(zhì)，新蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 1同源性達(dá)到80%或更高。。序列表中的SEQ ID NO :1由350個(gè)氨基酸殘基組成。編碼上述(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；3)所編碼的序列80%或以上同源于序列表中SEQ ID NO 1且具有QR，3R)_2， 3-丁二醇脫氫酶或乙偶姻還原酶作用的核苷酸序列；
4
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 2限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. IX SSPE (或0. 1 X SSC) ,0. 1 % SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 2由1050個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第1-1050位 堿基，具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述OR，3R) -2，3- 丁二醇脫氫酶的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶的方法，是將含有上述 (2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到(2R，3R)-2， 3-丁二醇脫氫酶。所述宿主為任一可表達(dá)外源基因的原核或真核細(xì)胞。所述原核細(xì)胞可為大腸肝菌，如E. coli BL21、E. coli M15、Ε. coli JM109、 Ε. coliDH5 α或Ε. coli LG90等；也可為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis或多粘類芽孢 Ifisf Paenibacillus polymyxa。所述真核細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞等。包括C0S-7、CH0、 BHK-21、NIH3T3、Pichia pastoris 或 TBY2 等。用于構(gòu)建含有(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā) 載體可為 pET-22b、pET28、pET32、pQE-30、pGEX_4T_2、pBR322 或 pUC18 等。以pET_22b為出發(fā)載體構(gòu)建的含有所述(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的大腸 桿菌分泌表達(dá)載體命名為pET22b-2R3R。上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。當(dāng)所述宿主為大腸肝菌時(shí)，需加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所加入IPTG的濃度為 0. 01mM-5mM，優(yōu)選為 ImM。培養(yǎng)含有本發(fā)明的(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。本發(fā)明的應(yīng)用，包括直接利用(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶，或者利用(2R，3R)_2， 3-丁二醇脫氫酶基因宿主細(xì)胞進(jìn)行(2R，3R)-2，3-丁二醇的生產(chǎn)或乙偶姻的生產(chǎn)。本發(fā)明所提供的利用含有(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的細(xì)胞生產(chǎn)QR， 3R)-2，3-丁二醇的方法，具體包括以下步驟1)將(2R，3R)-2，3- 丁二醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pET22b_2R3R導(dǎo)入大腸桿 菌 E. coli BL21(DE3)pLysS 后，獲得重組大腸桿菌 E. coli RBDH ；2)將E. coli RBDH單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、ImM IPTG條件下誘導(dǎo) 蛋白表達(dá)，得到所述具有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶活力的細(xì)胞作為生物催化劑；3)利用步驟2)獲得的生物催化劑，添加(3R)-乙偶姻作為底物，37°C下反應(yīng)12 個(gè)小時(shí)，得到目標(biāo)產(chǎn)物(2R，3R)-2，3-丁二醇。底物添加量為IOOOmM時(shí)，檢測得到目標(biāo)產(chǎn)物 871mM0
在上述生產(chǎn)(2札3幻-2，3-丁二醇方法中，所述步驟幻中具有(2R，3R) _2，3_ 丁二 醇脫氫酶活力的細(xì)胞的表達(dá)方法具體為從平板上隨機(jī)挑選一個(gè)E. coli RBDH單菌落轉(zhuǎn)接 到5mL含有100 μ g/mL氨芐西林和34 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12小時(shí)， 然后按1 %比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含有100 μ g/mL氨芐西林和34 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)至菌體OD6tltl值達(dá)到0. 6，然后加入ImM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)5小時(shí)，收集菌 體重懸于200mM的磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)菌體OD6tltl值為20，獲得所述具有QR，3R) -2，3- 丁 二醇脫氫酶活力的細(xì)胞。本發(fā)明所提供的利用(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶生產(chǎn)(2R，3R) _2，3_ 丁二醇的方 法，是利用所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶，添加(3R)-乙偶姻作為底物和輔酶NADH，在 PH 8.0的磷酸鹽緩沖液體系中，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(2R，3R)-2，3-丁二醇。本發(fā)明(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶的應(yīng)用，還進(jìn)一步包括a)以 NAD+ 為輔酶，用(2R, 3R) _2，3_ 丁二醇脫氫酶，以(2R, 3R) _2，3_ 丁二醇為底 物70°C, pH 11. 0制備(R)-乙偶姻。b)以NADH為輔酶，用(2R，3R) _2，3-丁二醇脫氫酶，以丁二酮為底物70°C，pH 11.0制備(R)-乙偶姻。c)以NAD+為輔酶，用(2札3幻-2，3-丁二醇脫氫酶，以消旋型1^80-2，3-丁二醇為 底物70°C，pH 11.0制備(S)-乙偶姻；d)以NADH為輔酶，用(2R，3R)_2，3_ 丁二醇脫氫酶，以內(nèi)消旋型(S)-乙偶姻為底 物70°C，pH 8. 0制備內(nèi)消旋型meso-2，3- 丁二醇。具體的，本發(fā)明提供生產(chǎn)(3R)_乙偶姻的方法，用所述(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫 酶進(jìn)行以下之一的操作a)在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH 11. 0)體系中，添加2mM的NADH為輔酶，IOOmM 丁二酮作為底物，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3R)-乙偶姻(3R)-乙偶姻；b)在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH 11. 0)體系中，添加4mM的NAD+為輔酶， 100福^ ，31 )-2，3-丁二醇為底物，701反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3R)-乙偶姻(3R)-乙偶姻。具體的，本發(fā)明提供生產(chǎn)(3S)_乙偶姻的方法，利用所述(2R，3R)-2，3_ 丁二醇 脫氫酶，在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH 11. 0)體系中，添加4mM的NAD+為輔酶，IOOmM的 meso-2，3-丁二醇作為底物，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3S)-乙偶姻。在本發(fā)明所述全部應(yīng)用中，(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為70°C ； 所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶參與二醇氧化反應(yīng)的最適pH值為11.0，參與酮還原反應(yīng) 的最適PH值為8.0。本發(fā)明提供了 一個(gè)來源于多粘類芽孢桿菌(Paenihcillus polymyxa ATCC12321)的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶及其編碼基因。通過酶學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)該酶具有 嶄新的特性，以NAD+為輔酶，催化(2R，3R)-2，3-丁二醇生成(R) _乙偶姻，催化內(nèi)消旋型 meso-2，3-丁二醇生成(S)-乙偶姻；以NADH為輔酶，催化(R)-乙偶姻生成(2R，3R)_2， 3-丁二醇，催化(S)-乙偶姻生成內(nèi)消旋型的meSO-2，3-丁二醇，催化丁二酮，只生成 (R)-乙偶姻。此外，該酶底物特異性高，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為SDS-PAGE (A)和native_PAGE (B)檢測純化蛋白的分子量大小圖2為QR，3R) _2，3_ 丁二醇脫氫酶最適反應(yīng)pH值測定結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的獲得及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建來自多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa ATCC12321)的 QR， 3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因是通過全基因組測序、注釋分析后，通過PCR手段從 Paenibacilluspolymyxa ATCC12321 基因組擴(kuò)增獲得的。其中 Paenibacillus po lymyxa ATCC12321菌株購自美國生物資源保藏中心(http://WWW. atcc. org/)，公眾可以直接從美 國生物資源保藏中心自由購買。該基因的克隆過程及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建過程包括以下步驟一、(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的克隆經(jīng)過全基因組測序，并注釋基因組信息后，獲得了一個(gè)可能編碼丁二醇脫氫酶的 基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)如下引物P1 5，-CGCATATGCAAGCATTGAGATGGCATGG-3，(設(shè)計(jì)的 酶切位點(diǎn)為 NdeI)和 P2 :5，-ATCTCGAGGGCTTTCGGAGATACCAGGAT-3，(設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)為 XhoI)，以提取的Paenibacillus po lymyxa ATCC12321總基因?yàn)槟０?，以Pl和P2為引物， 通過PCR的方式擴(kuò)增得到該基因片段。對(duì)克隆的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因進(jìn)行核 苷酸序列測定，序列測定結(jié)果表明該基因具有序列表中SEQ IDNO 2的核苷酸序列，由1050 個(gè)堿基組成，自5，端第1-第1050位堿基編碼序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的 蛋白質(zhì)。在氨基酸水平上進(jìn)行了序列比較，該(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶與來自一株枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的 2，3 丁二醇脫氫酶Appl. Environ. Microbiol. ,74(22), 6832-6838(2008)氨基酸相似水平僅67%，與來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的(2R，3R) -2，3 丁二醇脫氫酶J. Bio. Chem.，275 (46)，35876-35885 (2000)氨基酸相似度 只有 35%，與來自 Thermoanaerobacter brockii 禾口 Clostridium beijerinckii Ifl^SBS [Org. Biomol. Chem.，7，3914-3917 (2009)的氨基酸相似水平低于22%，與來自克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)的 2，3-丁二醇脫氫酶J. Ferment. Bioeng. 83 :32-37(1997)沒 有同源性。二、QR，3R) -2，3_ 丁二醇脫氫酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一經(jīng)PCR獲得的基因片段用NdeI和B10I雙酶切后，連接到經(jīng)同樣酶雙酶 切處理的表達(dá)載體pET22b中，將含有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌E. coli BL21 (DE3)pLysS,經(jīng)PCR和酶切鑒定后將含有QR，3R) -2,3- 丁二醇脫氫酶 基因的陽性克隆質(zhì)粒命名為pET22b-2R3R，可用其進(jìn)行(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶的表 達(dá)。實(shí)施例2、(2R, 3R) -2，3_ 丁二醇脫氫酶在原核系統(tǒng)的表達(dá)、純化將實(shí)施例1獲得的含有(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶基因的原核表達(dá)載體pET22b-2R3R轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3) pLysS，挑選陽性單克隆在37 °C下?lián)u菌至 0D600為0. 6后，加入ImM IPTG誘導(dǎo)，5小時(shí)后離心收集菌體，反復(fù)凍融后重懸于超聲緩沖 液(含20mM磷酸鹽緩沖液，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)中，超聲破碎細(xì)胞，分別收集 上清及沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明攜帶目的基因的原核表達(dá)載體在大腸桿菌 E. coli BL21(DE3) pLysS中獲得大量表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白的單亞基分子量為38kDa，與預(yù) 期結(jié)果相符。通過His-tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白純化，具體方法為經(jīng)超聲波破碎獲得上清液，與 Ni-NTA凝膠結(jié)合，含有His-tag標(biāo)簽的蛋白將結(jié)合到Ni-NTA凝膠上，然后用清洗緩沖液 OOmM磷酸鹽緩沖液，300mM NaCl，50mM咪唑，pH 7.4)洗滌非特異性結(jié)合的雜蛋白，最后用 洗脫緩沖液OOmM磷酸鹽緩沖液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)將目的蛋白洗脫，即得 到純化后的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶，然后使用分子篩凝膠柱更換緩沖液為200mM磷酸 鹽緩沖液(PH 8.0)，獲得酶液為最終的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶。純化結(jié)果如圖IA所 示(泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為純化蛋白)，SDS-PAGE的結(jié)果顯示純化獲得蛋白單 亞基分子量為38kDa，進(jìn)一步通過Native-PAGE檢測純化蛋白在活性狀態(tài)下的分子量大小 (圖1B，泳道3所示)，該蛋白在活性狀態(tài)下的分子量大小為76kDa，表明該蛋白的活性狀態(tài) 是一個(gè)二聚體蛋白。實(shí)施例3、酶學(xué)特性鑒定用下述反應(yīng)進(jìn)行酶學(xué)特性鑒定
乙偶姻+NADife=^2，3-丁二醇+NAD+該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，以NADH的變化做為酶活測定的依據(jù)(獲得的重組蛋白只能利 用NAD+/NADH為輔酶，不能利用NADP+/NADPH為輔酶)。以NAD+為輔酶，催化(2R，3R)-2，3-丁二醇生成(R)-乙偶姻(在70°C、pH 11.0條 件下，以IOOmM的QR，3R) -2，3- 丁二醇為底物，4mM的NAD+為輔酶)，結(jié)果只生成(R)-乙偶 姻；催化內(nèi)消旋型meSO-2，3-丁二醇生成(S)-乙偶姻(在70°C、pH 11. 0條件下，以IOOmM 的內(nèi)消旋型meso-2，3- 丁二醇為底物，4mM的NAD+為輔酶)，結(jié)果只生成⑶-乙偶姻。以NADH為輔酶，催化(R)-乙偶姻生成QR，3R)-2，3-丁二醇(在70°C、pH 8.0 條件下，以IOmM的(R)-乙偶姻為底物，0. 2mM的NADH為輔酶)，結(jié)果只生成QR，3R) -2，3-丁二醇；催化(S)-乙偶姻生成內(nèi)消旋型的meSO-2，3-丁二醇(在70°C、pH 8. 0條件下，以 IOmM的(S)-乙偶姻為底物，0. 2mM的NADH為輔酶)，結(jié)果只生成meSO-2，3- 丁二醇；催化 丁二酮(在70°C、pH 8. 0條件下，以IOmM的丁二酮為底物，0. 2mM的NADH為輔酶)，結(jié)果只 生成(R)-乙偶姻。該蛋白對(duì)OS，3S)-2，3-丁二醇沒有任何活性(在70°C、pH 11. 0條件下，以IOOmM 的OR，3R) -2，3- 丁二醇為底物，4mM的NAD+為輔酶，結(jié)果無任何產(chǎn)物檢測到，也無NADH的 生成)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)的目的蛋白確實(shí)為(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶。試驗(yàn)一、QR，3R) -2，3_ 丁二醇脫氫酶的最適反應(yīng)pH值確定在酮還原反應(yīng)，即從乙偶姻生成2，3_ 丁二醇反應(yīng)方向，在25°C條件下，以10mM(R/ S)-乙偶姻為底物，0. 2mM的NADH為輔酶，測定了該酶從pH4. 0到9. 0的范圍內(nèi)，酶活性的變化情況。結(jié)果顯示(如圖2(a)幅)，該酶的酮還原反應(yīng)的最適pH為8.0。緩沖體系100mM 檸檬酸緩沖體系(pH 4到6)、IOOmM的磷酸鹽緩沖體系(pH 5到8)和IOOmM的Tris-HCl 緩沖體系(pH 8到9)。在二醇氧化反應(yīng)，即從2，3_丁二醇到乙偶姻反應(yīng)方向，在25°C條件下，以IOOmM的 (2R, 3R) -2，3- 丁二醇為底物，4mM的NAD+為輔酶，測定了該酶從pH6. 0到12. 0的范圍內(nèi)，酶 活性的變化情況。結(jié)果顯示(如圖2(b)幅)，該酶的二醇氧化反應(yīng)最適pH為11.0。緩沖體 系IOOmM的磷酸鹽緩沖體系(pH 6到8)、100mM的Tris-HCl緩沖體系(pH 8到9)、100mM 的碳酸氫鈉緩沖體系(PH 9到11)和IOOmM的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖體系(pH 11-12)。試驗(yàn)二、QR，3R) -2，3_ 丁二醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度確定酶活的測定方法是在340nm紫外波長下測定NADH的變化，一個(gè)單位酶活定義為每 分鐘氧化1 μ mol的NADH。(2R, 3R) -2，3- 丁二醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度的測定條件如下在 酮還原反應(yīng)體系，IOmM的(R/S)-乙偶姻為底物，0. 2mM的NADH為輔酶，IOOmM的磷酸鹽緩 沖液(pH 8. 0)體系；二醇氧化反應(yīng)體系，以IOOmM的(2R，3R)_2，3_ 丁二醇為底物，4mM的 NAD+為輔酶，IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液(pH 11.0)體系。酮還原反應(yīng)和二醇氧化反應(yīng)都分 別測定了從40°C到80°C的酶活力。結(jié)果顯示，在酮還原反應(yīng)和二醇氧化反應(yīng)，該酶的最適 反應(yīng)溫度都是70°C。試驗(yàn)三、(2R, 3R) _2，3_ 丁二醇脫氫酶的底物特異性測定在該酶的最適反應(yīng)條件下，分別測定了該酶在二醇氧化反應(yīng)和酮還原反應(yīng)中的底 物特異性。具體方法如下1、二醇氧化反應(yīng)中，底物添加濃度為100mM，4mM NAD+為輔酶，IOOmM碳酸氫鈉緩 沖體系(pH 11.0)，反應(yīng)溫度70°C。對(duì)(2R，3R)-2，3-丁二醇的活力設(shè)定為100%，其它化合 物的相對(duì)活力值如表1所示。表1 二醇氧化反應(yīng)中(2R，3R)-2，3_ 丁二醇脫氫酶的底物特異性測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)將序列表中SEQID NO 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代、缺失或添加且 具有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶或乙偶姻還原酶作用的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO=I 的同源性達(dá)到80%或更高。
2.編碼權(quán)利要求1所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 1的DNA序列；3)所編碼的蛋白質(zhì)序列與序列表中SEQID NO :1限定的蛋白質(zhì)序列具有80%以上同 源性且具有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶或乙偶姻還原酶作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID NO :2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
4.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶的方法，是將含有權(quán)利要 求2所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到QR， 3R)-2，3-丁二醇脫氫酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于用于構(gòu)建含有權(quán)利要求2所述QR， 3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-22b、pET28、 pET32、pQE-30、pGEX-4T-2、pBR322 或 pUC18 ；以 pET-22b 為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述 QR， 3R)-2，3- 丁二醇脫氫酶基因的大腸桿菌表達(dá)載體為pET22b-2R3R。
6.一種生產(chǎn)(2札3幻-2，3-丁二醇的方法，具體包括以下步驟1)將權(quán)利要求5所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pET22b-2R3R 導(dǎo)入大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)pLysS后，獲得重組大腸桿菌E. coliRBDH ；2)將E.coli RBDH單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、ImM IPTG條件下誘導(dǎo)蛋白 表達(dá)，得到具有(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶活力的細(xì)胞作為生物催化劑；3)利用步驟2)獲得的生物催化劑，添加(3R)-乙偶姻作為底物，37°C下反應(yīng)12個(gè)小 時(shí)，得到(2R，3R)-2，3-丁二醇。
7.—種生產(chǎn)(2R，3R)-2，3-丁二醇的方法，具體包括利用權(quán)利要求1或4所述的QR， 3R)-2，3-丁二醇脫氫酶，添加(3R)-乙偶姻作為底物和輔酶NADH，在pH 8. O的磷酸鹽緩沖 液體系中，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(2R，3R)-2，3- 丁二醇。
8.(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶的應(yīng)用，為下述反應(yīng)之一a)以NAD+為輔酶，用(2札3幻-2，3-丁二醇脫氫酶7001，？!111. O下催化QR，3R)-2， 3- 丁二醇制備(R)-乙偶姻；反應(yīng)條件b)以NADH為輔酶，用(2札3幻-2，3-丁二醇脫氫酶701，？!111. O催化丁二酮制備 (R)-乙偶姻；c)以NAD+為輔酶，用(2札3幻-2，3-丁二醇脫氫酶701，？!111.0催化內(nèi)消旋型 mes0-2，3-丁二醇制備(S)-乙偶姻；d)以NADH為輔酶，用(2札3幻-2，3-丁二醇脫氫酶701，？!18. O催化內(nèi)消旋型⑶乙 偶姻制備內(nèi)消旋型meso-2，3- 丁二醇。
9.生產(chǎn)(3R)-乙偶姻的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1或4所述(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶進(jìn)行以下之一的操作a)在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH11. 0)體系中，添加2mM的NADH為輔酶，IOOmM 丁二 酮作為底物，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3R)-乙偶姻(3R)-乙偶姻；b)在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH11. 0)體系中，添加4mM的NAD+為輔酶，IOOmMQR， 3R)-2，3-丁二醇為底物，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3R)-乙偶姻(3R)-乙偶姻。
10.生產(chǎn)(35)-乙偶姻的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1或4所述(2R，3R)-2，3-丁 二醇脫氫酶，在IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH 11. 0)體系中，添加4mM的NAD+為輔酶，IOOmM 的meSO-2，3-丁二醇作為底物，70°C反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，得到(3S)-乙偶姻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)來源于多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa ATCC12321)的(2R，3R)-2，3-丁二醇脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。通過酶學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)該酶具有嶄新的特性，以NAD+為輔酶，催化(2R，3R)-2，3-丁二醇生成(R)-乙偶姻，催化內(nèi)消旋型meso-2，3-丁二醇生成(S)-乙偶姻；以NADH為輔酶，催化(R)-乙偶姻生成(2R，3R)-2，3-丁二醇，催化(S)-乙偶姻生成內(nèi)消旋型的meso-2，3-丁二醇，催化丁二酮，生成(R)-乙偶姻。此外，該酶底物特異性高，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12P7/26GK102071174SQ201010564858
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者于波, 孫際賓, 曾安平 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所