專利名稱：短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用，屬于生物工程 技術(shù)領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及一種從短乳桿菌中利用PCR方法篩選克隆出新的谷氨酸 脫羧酶基因、其表達(dá)的谷氨酸脫羧酶，及該酶或表達(dá)該酶的工程菌在制備Y-氨基丁酸中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA)，又稱氨酪酸，是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸。它不僅 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，而且對(duì)人體還具有多種有益的生理功能。大量文獻(xiàn) 報(bào)道，GABA具有降血壓和膽固醇、治療癲癇，安神鎮(zhèn)靜、緩解抑郁癥狀、增強(qiáng)腦功能和長(zhǎng)期記 憶、調(diào)節(jié)激素分泌、預(yù)防糖尿病、健肝利腎、改善更年期綜合癥及提高精子的體外受精能力 等功能。研究顯示，人大腦的衰老有可能是因?yàn)槠浯竽X無(wú)法得到足夠量的化學(xué)物Y-氨基 丁酸(GABA)而造成的。攝入GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，從而促進(jìn)大腦的能量 代謝，活化腦血流，增加氧供給量，最終恢復(fù)腦細(xì)胞功能，改善神經(jīng)機(jī)能。隨著對(duì)GABA生理活性及作用的深入研究，GABA也日益受到關(guān)注。GABA成為一種既 具有顯著藥理作用、可用于疾病治療，又具有保健作用、可用于日常服用的“藥食同源”的生 理活性物質(zhì)。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)Y-氨酪酸(Y-氨基丁酸)片以及Y-氨 酪酸注射液的藥廠已經(jīng)達(dá)到24個(gè)，主要用于治療各種類型的肝昏迷。日本PCI公司利用發(fā) 酵法生產(chǎn)Y-氨基丁酸，作為功能食品配料，已廣泛應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味料 等制品。因此近年來(lái)對(duì)GABA需求也與日俱增。制備GABA的方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法兩大類。最常見(jiàn)的化學(xué)合成方法就是以鄰苯二甲酰亞氨鉀和Y-氯丁氰在強(qiáng)烈條件下(反 應(yīng)溫度高達(dá)180°C)反應(yīng)，所得產(chǎn)物與濃硫酸回流水解，再經(jīng)過(guò)結(jié)晶提純而得。另有以吡咯 烷酮作為原料，經(jīng)氫氧化鈣、碳酸氫銨水解制得GABA的專利報(bào)道?；瘜W(xué)合成GABA雖然反應(yīng) 迅速，但是具有反應(yīng)條件苛刻、安全性差、能耗大、成本高、副反應(yīng)多以及環(huán)境污染嚴(yán)重等缺 點(diǎn)ο生物合成法是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)作 為催化劑，將L-谷氨酸或其鈉鹽α-脫羧生成GABA。生物合成法包括植物富集法和微生 物(酶)催化法兩種。其中的植物富集法是利用植物中GAD催化L-谷氨酸或其鈉鹽產(chǎn)生 GABA。但是植物所能產(chǎn)生的GABA極其微少，所以該方法難以用于GABA的大規(guī)模制備，目前 僅用于增加大米、茶葉等農(nóng)作物中的GABA含量、以提高這些作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。微生物(酶) 催化法是利用具有GAD活力的微生物(或酶)催化L-谷氨酸或其鈉鹽來(lái)制備GABA。與其 他方法相比，微生物(酶 )催化法合成GABA具有許多優(yōu)點(diǎn)，最突出的是條件溫和、專一性 強(qiáng)、副產(chǎn)物少(酶法)、安全性高，是大規(guī)模制備食品或醫(yī)藥級(jí)GABA的理想途徑。微生物(酶)催化法制備GABA的關(guān)鍵是要獲得高活力(谷氨酸脫羧酶活力) 的微生物菌株或酶。但目前，利用微生物(酶)催化法制備Y-氨基丁酸存在的一個(gè)問(wèn)題是所用的菌株常常兼性厭氧細(xì)菌，所以生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致Y-氨基丁酸的生 產(chǎn)效率低。雖然也有克隆谷氨酸脫羧酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)的專利(申請(qǐng)?zhí)?200710022222. 3)，但所獲得谷氨酸脫羧酶活力并不高，而且由于酶的最適溫度高于常溫， 因此還要消耗額外的能量。此外，對(duì)于微生物(酶)催化法制備Y-氨基丁酸而言，由于菌 體代謝的復(fù)雜性，所獲的產(chǎn)物中除了 Y-氨基丁酸外常常還有其他由于菌體自身代謝所產(chǎn) 生的雜質(zhì)。這需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)雜的分離純化才能得到合乎質(zhì)量要求的產(chǎn)品，增加了生產(chǎn) 成本
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種從保藏號(hào)為 CGMCC NO. 1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)中，利用PCR方法篩選克隆出短乳桿
菌谷氨酸脫羧酶基因。具體的，本發(fā)明提供一種短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因，該基因的DNA序列為SEQID NO. 1，全長(zhǎng) 1407bp，來(lái)自保藏號(hào)為 CGMCC NO. 1306 的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。該 基因是一個(gè)尚未報(bào)道的DNA序列，其堿基組成特征如下表1所示表1 短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306谷氨酸脫羧酶基因堿基組成特征
WEWi百分比
A36425.9%T36726·1%
G32022.7%
C35625.3%
G+C67648.0%該基因編碼的推導(dǎo)氨基酸序列為SEQ ID Ν0. 2。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的 表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物——重組谷氨酸脫羧酶。具體的該短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因借助通 用的基因工程手段在大腸桿菌、芽孢桿菌等工程菌中進(jìn)行表達(dá)；通過(guò)異源表達(dá)可以大規(guī)模 產(chǎn)生重組谷氨酸脫羧酶，該表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酸脫羧酶的分子量為53538. 6Da。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述重組谷氨酸脫羧酶或表達(dá)該重 組酶的工程菌在制備Y-氨基丁酸中的用途，具體的利用所獲得的重組谷氨酸脫羧酶或 表達(dá)該重組酶的工程菌高效地將谷氨酸或其鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閅-氨基丁酸，可用于Y-氨基丁酸 的生產(chǎn)制備。在制備Y-氨基丁酸的過(guò)程中，最佳反應(yīng)溫度為35 40°C，最佳反應(yīng)pH為 4. 4。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明人在前期工作中(見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)枮?00510049188.X，發(fā)明名稱為《產(chǎn)γ-氨 基丁酸的短乳桿菌及其用途》專利)分離到一株具有較高Y-氨基丁酸產(chǎn)量的短乳桿菌 (Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306。由于該菌株在Y _氨基丁酸生產(chǎn)中的產(chǎn)量高，因 此可以推斷其表達(dá)的谷氨酸脫羧酶活力較高，對(duì)Y-氨基丁酸的生物制備具有重要價(jià)值。 通過(guò)分析數(shù)種乳酸桿菌谷氨酸脫羧酶基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)優(yōu)化PCR條件，從提取的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306基因組DNA中克隆得到
了谷氨酸脫羧酶基因。在該基因兩端分別加上BamH I和EcoRI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的 質(zhì)粒pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達(dá)。利用本發(fā)明的短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因，通過(guò)大腸桿菌等工程菌的異源表達(dá)， 可以克服短乳桿菌營(yíng)兼性厭氧生長(zhǎng)所導(dǎo)致的生長(zhǎng)速率慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，可在短時(shí)間 內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶。在制備Y-氨基丁酸時(shí)，既可以直接利用表達(dá)谷氨酸脫羧酶 的重組工程菌進(jìn)行Y-氨基丁酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也可以用重組的谷氨酸脫羧酶進(jìn)行Y-氨基 丁酸的酶法轉(zhuǎn)化。當(dāng)采用酶法轉(zhuǎn)化時(shí)，與現(xiàn)有技術(shù)中的酶法轉(zhuǎn)化相比，由于該酶催化活力 高，催化最適溫度在室溫附近，在制備Y “氨基丁酸時(shí)不僅產(chǎn)物純度高、底物轉(zhuǎn)化徹底、生 產(chǎn)效率高，而且不需要額外的加熱能量、生產(chǎn)成本低。


圖1.已有乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因5’端序列比較圖1是目前序列已知的六種源自乳酸菌的谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列(N端)和 對(duì)應(yīng)的堿基序列(5’端)。由圖可見(jiàn)，它們的堿基序列具有不同程度的相似性，而且前四種 相似度較高，后兩種較低。因此，分別以前四種和后兩種谷氨酸脫羧酶基因的5’堿基序列 為依據(jù)，分別設(shè)計(jì)了兩條對(duì)應(yīng)的上游簡(jiǎn)并引物。圖2.已有乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因3’端序列比較圖2是目前序列已知的六種源自乳酸菌的谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列(C端)和 對(duì)應(yīng)的堿基序列(3’端)。與圖1不同的是，其中有五種谷氨酸脫羧酶的堿基序列有很高的 相似性。因此，以這五種谷氨酸脫羧酶基因3’端的堿基序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)一條對(duì)應(yīng)的下游 簡(jiǎn)并引物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的菌株和培養(yǎng)基如下菌株短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306為本實(shí)驗(yàn)室篩選，大腸桿 菌DH5a和大腸桿菌BL21UDE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基(1) IOOOmL GYP固體培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸鈉2g， MgSO4 · 7H20 20mg, MnSO4 · 4H20 lmg, NaCl lmg, FeSO4 · 7H20 lmg，瓊月旨 15g, pH 6. 8。(2) IOOOmL GYP液體培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸鈉2g， MgSO4 · 7H20 20mg, MnSO4 · 4H20 lmg, NaCl lmg, FeSO4 · 7H20 lmg, pH 6. 6-7. 0。(3) 1000ml LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g，瓊脂15g，pH 7. 0.(4) 1000ml LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH 7. 0。實(shí)施例1短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆挑取保藏號(hào)為CGMCC N0. 1306的保藏菌株短乳桿菌(Lactobacillus brevis)在瓊脂斜面培養(yǎng)基上在30°C活化24h，然后接種于25ml GYP液體培養(yǎng)基上，在容積為250ml 的錐形瓶中于30°C下靜置培養(yǎng)至菌體達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)中期(約24h)，然后取4. 5ml菌液于 IOOOOrpm離心一分鐘后棄去上清液，采用上海生工所產(chǎn)基因組提取試劑盒，按說(shuō)明書提取 基因組。經(jīng)電泳驗(yàn)證，提取產(chǎn)物為單一條帶，大小與基因組大小相當(dāng)，無(wú)RNA污染。搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌GAD基因序列，分析對(duì)比后選取了與目標(biāo)菌株 親緣關(guān)系可能接近的5個(gè)乳酸菌的GAD基因序列設(shè)計(jì)引物。由于它們之間仍有10% -30% 的差異，因此根據(jù)它們兩端序列構(gòu)成(分別如圖1和圖2所示)和密碼子的偏好性，采用引 物設(shè)計(jì)軟件DNAMAN 6. 0設(shè)計(jì)了兩個(gè)上游簡(jiǎn)并引物上游簡(jiǎn)并弓丨物 1 :5，-cgggatccatgaaYaaRaaYgaYcaRgaRc-3‘；上游簡(jiǎn)并弓丨物 2 :5，-cg￡g^￡atggcWatgttRtaYggWaaac-3，；和一個(gè)下游簡(jiǎn)并引物5，-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3' 其中，上游簡(jiǎn)并引物中的“ggatcc”為限制件核酸內(nèi)切酶BamH I酶切位點(diǎn)，下游簡(jiǎn) 并引物中的“gaattc”為限制件核酸內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)。分別用上游簡(jiǎn)并引物I(Upl)和上游簡(jiǎn)并引物2(Up2)與下游簡(jiǎn)并引物(Downl)配 對(duì)，選擇和優(yōu)化不同的模板/Pfu/引物比例，退火溫度，循環(huán)次數(shù)，以靶基因組(短乳桿菌 (Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306基因組DNA)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以得到擴(kuò)展片 段大小合適、豐度適度和非特異條帶少的PCR結(jié)果。經(jīng)過(guò)比較不同的上、下游簡(jiǎn)并引物配對(duì)和模板/Pfu/引物比例，退火溫度，循環(huán)次 數(shù)，確定反應(yīng)條件，最終得到了一個(gè)DNA條帶。所確定的PCR體系組成為(單位μ 1)超純水，38. 5 ；Pfu buffer, 5 ；上游簡(jiǎn)并引 物1，0.5 ；下游簡(jiǎn)并引物2，0.5 ;dNTP，4 ；模板，1 ;Pfu，0. 5 ；反應(yīng)總體積為50。所用PCR條件為94°C變性5min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，即94°C變性1. 5min, 57°C退火 lmin，72°C延伸3. 5min，共循環(huán)32次，最后在72°C延伸8min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢 驗(yàn)，所得產(chǎn)物條帶單一、清晰、明亮，大小在1000 1500bp之間且接近1500bp，且陰性對(duì)照 無(wú)條帶?？寺‘a(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其具有谷氨酸脫羧酶的保守序列，證實(shí)其為 目的基因谷氨酸脫羧酶基因。實(shí)施例2目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建由于在克隆目的基因時(shí)，已經(jīng)在克隆引物的兩端引入了限制性核酸內(nèi)切酶的酶切 位點(diǎn)(BamH I和EcoR I)，所以在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，只要選擇需要的質(zhì)粒，采用BamH I和 EcoR I對(duì)目的基因和載體質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，然后按照常規(guī)的雙酶切連接方法連接目的 基因和載體質(zhì)粒，即可得到可用于表達(dá)的載體。具體而言，在本實(shí)施例，采用了 pET_28a(+) 作為載體質(zhì)粒，按照表2所述雙酶切條件對(duì)目的基因和pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切。表2雙酶切反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因，其特征在于該基因的DNA序列為SEQ ID NO. 1， 全長(zhǎng)1407bp，來(lái)自保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因，其特征在于該基因編碼的推 導(dǎo)氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.—種權(quán)利要求1所述的短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酸脫羧酶， 分子量為53538. 6Da。
4.一種權(quán)利要求3所述的短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酸脫羧酶 或表達(dá)該酶的工程菌在制備Y-氨基丁酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用。該基因來(lái)自短乳桿菌Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306，全長(zhǎng)1407bp，通過(guò)PCR從短乳桿菌基因組DNA中擴(kuò)增獲得。在該基因兩端分別加上BamH I和EcoRI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物谷氨酸脫羧酶分子量為53538.6Da。該重組谷氨酸脫羧酶或表達(dá)該重組酶的工程菌可將L-谷氨酸或其鹽脫羧轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸，具有轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物純度高，生產(chǎn)效率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102080090SQ20101056744
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者梅樂(lè)和, 胡升, 黃 俊 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院