一種山核桃rca基因克隆的方法
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程的技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種山核桃RCA基因克隆的方法的技術(shù)領(lǐng)域。
【【背景技術(shù)】】
[0002]山核桃屬胡桃科山核桃屬植物，約有20個(gè)種，其中4個(gè)種原產(chǎn)中國(guó)，原產(chǎn)歐洲東南部及亞洲西部漢代傳入中國(guó)，經(jīng)數(shù)百年的繁育國(guó)內(nèi)品種已經(jīng)和國(guó)外的完全不同了。世界上基本亞熱帶地區(qū)都有胡桃科植物分布，品種數(shù)百種。國(guó)內(nèi)各地都有分布，東北以秋子居多(野生)華北，西北也有分布。
[0003]山核桃在進(jìn)行光合作用時(shí)，關(guān)鍵步驟固定C02過(guò)程需要Rubisco酶的催化。Rubisco酶的活性由植物體內(nèi)復(fù)雜的機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，其中大量研究已證實(shí)Rubiscoactivase (RCA)能夠活化并維持Rubisco酶的催化活性。同時(shí)RCA也被認(rèn)為是植物在各種不同環(huán)境脅迫下對(duì)光合作用的關(guān)鍵調(diào)控因素，Mate等發(fā)現(xiàn)植物表達(dá)低水平的RCA會(huì)導(dǎo)致氮素積累和總生物量的減少，同時(shí)RCA表達(dá)很少或不表達(dá)的個(gè)體則無(wú)法在大氣二氧化碳濃度下存活。因此，相關(guān)研究通過(guò)RCA調(diào)控提高C02吸收率最終提高作物產(chǎn)量具有重要意義。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]本發(fā)明的目的就是解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，提出一種山核桃RCA基因克隆的方法，本發(fā)明利用RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆獲得山核桃2個(gè)RCA基因全長(zhǎng)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析了在堿基序列、編碼氨基酸序列及其他特性差異，并通過(guò)不同發(fā)育時(shí)期葉片的RCA基因表達(dá)情況探求RCA基因的表達(dá)模式。為利用基因工程手段調(diào)控RCA以增加光合速率和提尚抗逆性打下基礎(chǔ)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝頭最外側(cè)幼葉或葉片，迅速液氮冷凍處理后，并置于-70°C冰箱中進(jìn)行保存；
[0007]b)提取RCA:對(duì)步驟a)處理后的幼葉或葉片進(jìn)行RCA提?。?br>[0008]c)序列檢索:通過(guò)克隆和比對(duì)確認(rèn)山核桃存在2個(gè)RCA基因，利用β型RCA的0RF的序列作為查詢標(biāo)記，在山核桃基因組中進(jìn)行同源匹配；
[0009]d)引物設(shè)計(jì):根據(jù)步驟c)獲取的序列信息使用Primer Premier 5.0軟件和primer 3.0 在線(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4_0/)設(shè)計(jì)基因特異性引物用于cDNA、基因組DNA的PCR擴(kuò)增和定量分析；
[0010]e)目的片段克隆及測(cè)試:根據(jù)已有同源基因保守序列和部分轉(zhuǎn)錄組序列，以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用一對(duì)特異性引物擴(kuò)取中間片段，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小550bp，以β -Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)確認(rèn)的RCA基因中間序列，通過(guò)3 ’ RACE特異性弓|物和5 ’ RACE特異性引物獲取基因cDNA的5’端和3’端序列，將DNA片段插入進(jìn)T載體，陽(yáng)性克隆然后進(jìn)tx測(cè)序；
[0011]f) RCA基因組序列分析:基因組DNA參照CTAB法從山核桃葉片中提取，經(jīng)RNase消化后作為擴(kuò)取RCA基因組DNA片段的模版，根據(jù)已有的cDNA和基因組DNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)取相應(yīng)的DNA序列，測(cè)序后使用DNAMAN進(jìn)行多序列比較分析；g)生物信息學(xué)分析:利用 ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，計(jì)算蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)，包括相對(duì)分子量、氨基酸組成、總平均親水性等；利用PsiPred程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP);采用PS0RT(http://www.psort.0rg/)程序，進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用ClustalX2.1進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì)；采用MEGA 5.05軟件，進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；
[0012]h)總RNA提取和不同時(shí)期葉片的定量分析:采用改良的CTAB法與試劑盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)聯(lián)合使用提取不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片的總RNA，以提取所得總 RNA 為模板，OligodT 為引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H_)試劑盒(TaKaRa)操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，稀釋5倍后用以RT-qPCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0013]作為優(yōu)選，RCA指的是 Rubisco activase。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆獲得山核桃2個(gè)RCA基因全長(zhǎng)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析了在堿基序列、編碼氨基酸序列及其他特性差異，并通過(guò)不同發(fā)育時(shí)期葉片的RCA基因表達(dá)情況探求RCA基因的表達(dá)模式，為利用基因工程手段調(diào)控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基礎(chǔ)。
【【具體實(shí)施方式】】
[0015]本發(fā)明一種山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0016]a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝頭最外側(cè)幼葉或葉片，迅速液氮冷凍處理后，并置于-70°C冰箱中進(jìn)行保存；
[0017]b)提取RCA:對(duì)步驟a)處理后的幼葉或葉片進(jìn)行RCA提?。?br>[0018]c)序列檢索:通過(guò)克隆和比對(duì)確認(rèn)山核桃存在2個(gè)RCA基因，利用β型RCA的0RF的序列作為查詢標(biāo)記，在山核桃基因組中進(jìn)行同源匹配；
[0019]d)引物設(shè)計(jì):根據(jù)步驟c)獲取的序列信息使用Primer Premier 5.0軟件和primer 3.0 在線(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4_0/)設(shè)計(jì)基因特異性引物用于cDNA、基因組DNA的PCR擴(kuò)增和定量分析；
[0020]e)目的片段克隆及測(cè)試:根據(jù)已有同源基因保守序列和部分轉(zhuǎn)錄組序列，以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用一對(duì)特異性引物擴(kuò)取中間片段，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小550bp，以β -Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)確認(rèn)的RCA基因中間序列，通過(guò)3 ’ RACE特異性弓|物和5 ’ RACE特異性引物獲取基因cDNA的5’端和3’端序列，將DNA片段插入進(jìn)T載體，陽(yáng)性克隆然后進(jìn)行測(cè)序；
[0021]f) RCA基因組序列分析:基因組DNA參照CTAB法從山核桃葉片中提取，經(jīng)RNase消化后作為擴(kuò)取RCA基因組DNA片段的模版，根據(jù)已有的cDNA和基因組DNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)取相應(yīng)的DNA序列，測(cè)序后使用DNAMAN進(jìn)行多序列比較分析；g)生物信息學(xué)分析:利用 ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，計(jì)算蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)，包括相對(duì)分子量、氨基酸組成、總平均親水性等；利用PsiPred程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP);采用PSORT (http://www.psort.0rg/)程序，進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用ClustalX2.1進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì)；采用MEGA 5.05軟件，進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；
[0022]h)總RNA提取和不同時(shí)期葉片的定量分析:采用改良的CTAB法與試劑盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)聯(lián)合使用提取不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片的總RNA，以提取所得總 RNA 為模板，OligodT 為引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H_)試劑盒(TaKaRa)操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，稀釋5倍后用以RT-qPCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，RCA 指的是 Rubisco activase。
[0023]本發(fā)明利用RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆獲得山核桃2個(gè)RCA基因全長(zhǎng)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析了在堿基序列、編碼氨基酸序列及其他特性差異，并通過(guò)不同發(fā)育時(shí)期葉片的RCA基因表達(dá)情況探求RCA基因的表達(dá)模式，為利用基因工程手段調(diào)控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基礎(chǔ)。
[0024]上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限定，任何對(duì)本發(fā)明簡(jiǎn)單變換后的方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝頭最外側(cè)幼葉或葉片，迅速液氮冷凍處理后，并置于-70°C冰箱中進(jìn)行保存； b)提取RCA:對(duì)步驟a)處理后的幼葉或葉片進(jìn)行RCA提?。? c)序列檢索:通過(guò)克隆和比對(duì)確認(rèn)山核桃存在2個(gè)RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作為查詢標(biāo)記，在山核桃基因組中進(jìn)行同源匹配； d)引物設(shè)計(jì):根據(jù)步驟c)獲取的序列信息使用PrimerPremier 5.0軟件和primer3.0在線(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)基因特異性引物用于cDNA、基因組DNA的PCR擴(kuò)增和定量分析； e)目的片段克隆及測(cè)試:根據(jù)已有同源基因保守序列和部分轉(zhuǎn)錄組序列，以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用一對(duì)特異性引物擴(kuò)取中間片段，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小550bp，以β -Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)確認(rèn)的RCA基因中間序列，通過(guò)3 ’ RACE特異性弓I物和5 ’ RACE特異性引物獲取基因cDNA的5’端和3’端序列，將DNA片段插入進(jìn)T載體，陽(yáng)性克隆然后進(jìn)行測(cè)序； f)RCA基因組序列分析:基因組DNA參照CTAB法從山核桃葉片中提取，經(jīng)RNase消化后作為擴(kuò)取RCA基因組DNA片段的模版，根據(jù)已有的cDNA和基因組DNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)取相應(yīng)的DNA序列，測(cè)序后使用DNAMAN進(jìn)行多序列比較分析； g)生物信息學(xué)分析:利用ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，計(jì)算蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)，包括相對(duì)分子量、氨基酸組成、總平均親水性等；利用PsiPred 程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP);采用PSORT(http://www.psort.0rg/)程序，進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用ClustalX2.1進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì)；采用MEGA 5.05軟件，進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析； h)總RNA提取和不同時(shí)期葉片的定量分析:采用改良的CTAB法與試劑盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)聯(lián)合使用提取不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片的總RNA，以提取所得總 RNA 為模板，OligodT 為引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒(TaKaRa)操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，稀釋5倍后用以RT-qPCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。2.如權(quán)利要求1所述，一種山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于:RCA指的是Rubisco activase。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于:包括以下步驟：a)取材、b)提取RCA、c)序列檢索、d)引物設(shè)計(jì)、e)目的片段克隆及測(cè)試、f)RCA基因組序列分析、g)生物信息學(xué)分析、h)總RNA提取和不同時(shí)期葉片的定量分析，本發(fā)明利用RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆獲得山核桃2個(gè)RCA基因全長(zhǎng)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析了在堿基序列、編碼氨基酸序列及其他特性差異，并通過(guò)不同發(fā)育時(shí)期葉片的RCA基因表達(dá)情況探求RCA基因的表達(dá)模式，為利用基因工程手段調(diào)控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/10, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105349527
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510817331
【發(fā)明人】鄭炳松, 金松恒, 紀(jì)國(guó)存, 裘玲玲
【申請(qǐng)人】浙江農(nóng)林大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日