專利名稱：人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌及利用其制備人參皂苷Rd的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株人參內(nèi)生真菌，灰綠犁頭霉菌Absidia glauca(CGMCCNo. 4316)， 以及利用該菌專一性轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1為人參皂苷Rd的方法。
背景技術(shù)：
人參皂苷Rd是一種很有應(yīng)用前景的候選藥物，它具有特異性阻斷受體依賴性鈣 離子通道的功能，在腎功能保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、抑制HeLa細(xì)胞生長、誘導(dǎo)C0X22產(chǎn)生、防輻射方 面具有其他單體人參皂苷所沒有的獨(dú)特作用；在鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)作用方面，Rd相對于其他 單體人參皂苷也較強(qiáng)。因此，人參皂苷Rd可開發(fā)成防輻射，治療心血管疾病、炎癥、創(chuàng)傷以 及由損傷引起的體內(nèi)外出血等方面的藥物。然而，由于人參皂苷Rd在人參屬植物中含量較 低，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成至今尚未成功，目前只能通過從人參等藥用植物的根、莖、葉中 提取，但其效率低，成本高，從而限制了 Rd的深入研究和應(yīng)用。因此，獲得大量、高純度的人 參皂苷Rd具有特別重要的科學(xué)研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。對于人參皂苷的轉(zhuǎn)化，若采用傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法，其選擇性低，副產(chǎn)物多，而且容 易對環(huán)境造成污染。相比較而言，生物轉(zhuǎn)化法具有高度專一性和無污染性等優(yōu)勢，因此，具 有很好的應(yīng)用前景。Rd與Rb1具有相同的糖苷配基，其結(jié)構(gòu)差異僅在于C3和C20位上的糖 基，而Rb1在人參中的含量較高，因此，可以通過水解Rb1去除其C-20位上的糖基而獲得，轉(zhuǎn) 化途徑如附圖1所示。目前，很多研究者都在尋找能夠?qū)b1轉(zhuǎn)化成Rd的微生物或者是酶， 然而，大多數(shù)微生物或酶都缺少高度的專一性，甚至?xí)d進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成F2、Rg3或他2， 而生成Rd的效率很低。利用微生物來源的酶轉(zhuǎn)化主要人參皂苷生產(chǎn)人參皂苷Rd普遍存在的問題有轉(zhuǎn) 化過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不專一；作為轉(zhuǎn)化底物的主要人參皂苷濃度不能過高；底物對酶有抑 制作用等。Kim等從70多株好氣菌中篩選到12株產(chǎn)生的酶均可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化成 人參皂苷Rd，底物質(zhì)量濃度為0. 47mg/mL ；而能將人參皂苷Rb1較完全轉(zhuǎn)化的3株細(xì)菌， 均有 Compound K 等副產(chǎn)物產(chǎn)生(Kim M K 等，The Journal of Microbiology, 2005,43 456-46 。Son等利用Thermus caldophilus產(chǎn)生的β -葡萄糖苷酶，將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化 成Rd，底物質(zhì)量濃度為lmg/mL，溫度為75°C。但由于人參皂苷的抑制作用，該反應(yīng)底物用人 參總提取物替代時(shí)，反應(yīng)時(shí)間比用純Rb1延長30倍；當(dāng)人參總提取物質(zhì)量濃度達(dá)到4. 2mg/ mL 時(shí)，人參皂苷 Rd 的產(chǎn)率從 80% 降低到 12% (Son J W 等 Biotechnology Letters, 2008, 30 :713-716)。本發(fā)明人即試圖尋找新的方案，來實(shí)現(xiàn)人參皂苷Rd的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足臨床 需要，同時(shí)可解決人參、三七等常用中藥材的資源緊缺的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有人參皂苷Rd的微生物，以 及使用該菌專一性轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1生產(chǎn)Rd的方法。本發(fā)明的人參內(nèi)生菌是發(fā)明人從人參中分離得到的一株真菌，經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定為灰綠犁頭霉菌Absidia glauca。上述本發(fā)明的灰綠犁頭霉菌已于2010年11月8日提交保藏，具體保藏信息如下保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Center, CGMCC)；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年11月08日；保藏編號CGMCCNo. 4316。本發(fā)明的所述的灰綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)具有如下的特征PDA上25°C菌落生長迅速，5天直徑達(dá)5cm，最適生長溫度25°C 31°C ；菌落初呈 白色，后變?yōu)榛揖G色或藍(lán)綠色，最后呈暗橄欖色；孢囊梗單生或2 4輪生；囊托與孢囊梗 間存在一個(gè)隔膜，孢囊孢子平滑，呈球形，直徑2. 5 5 μ m(3 μ m)。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Rd的反應(yīng)中，能專一地作用于 底物人參皂苷Rb1,將其轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd ；并且產(chǎn)物只有Rd，無副產(chǎn)物生成。基于上述研 究結(jié)果，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用所述的灰綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)轉(zhuǎn)化底物人參 皂苷Rb1生產(chǎn)人參皂苷Rd的方法。所述的制備人參皂苷Rd的方法，其一是原位轉(zhuǎn)化法，即將活化的灰綠犁頭霉菌 (CGMCC No. 4316)點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。 搜集培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物即可。該方法適用于小量生產(chǎn)人參皂苷Rd。所述的制備人參皂苷Rd的方法之二是微生物酶轉(zhuǎn)化法，是將活化的灰綠犁頭霉 菌(CGMCC No. 4316)接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)5 7天；收集酶液并將其與人參皂 苷Rb1混合后，于40°C下反應(yīng)Mh ；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基是每20mL去離子水中加入麥麩15g 和豆粕5g，經(jīng)口丨！，^^^高壓滅菌〗。!^!!。其中所述的酶液收集方法是加入與產(chǎn)酶培 養(yǎng)基等體積的pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌1 池；紗布過濾，濾液在8000r/min下 離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積的95%乙醇，優(yōu)選0 4°C乙醇，4°C 沉淀4h ；8000r/min下離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液并在 該緩沖液中透析，離心收集上清液即可。采用本發(fā)明的技術(shù)方案生產(chǎn)人參皂苷Rd，具有專一性強(qiáng)、簡單方便、安全可靠、成 本低且無副產(chǎn)物的特點(diǎn)。發(fā)酵產(chǎn)物Rd的純度在90%以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%以上。


本發(fā)明附圖3幅，圖1是人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd的轉(zhuǎn)化途徑示意圖；圖2是本發(fā)明的灰綠犁頭霉菌形態(tài)照片，其中A是孢囊孢子；B、C是孢囊梗及孢 囊；D是囊軸；圖3是本發(fā)明的灰綠犁頭霉菌轉(zhuǎn)化不同底物單一性及產(chǎn)物單一性試驗(yàn)的TLC結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例的方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例的內(nèi)容。無特殊說明，本發(fā)明所用的儀器和試劑包括人參總皂苷、 各種人參單體皂苷對照品，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；薄層層析板Silica Gel-60F254, 德國MERCK公司產(chǎn)品；高效液相色譜分析儀(島灃LC-20AD)，色譜柱為C18kromaSi 1 0DS2250mmX4. 6mm, 5 μ m,中科院大連化學(xué)物理研究所提供；其他試劑均為分析純試劑。如無特殊說明，本部分產(chǎn)物檢測所采用的TLC及HPLC條件為TLC檢測薄層層析板Silica Gel_60F254 ；展開劑V(氯仿)V(甲醇)V(水) =7:3: 0. 5 !^04水溶液，于110°C下烘干顯色。HPLC 檢測(1)樣品處理將萃取液在lOOOOr/min，離心lmin，用直徑為0. 22 μ m的微孔濾膜
過濾ο(2) HPLC條件流速0. 6mL/min ；檢測波長203nm ；柱溫:35°C;流動(dòng)相A為乙腈，B 為高純水；梯度洗脫流動(dòng)相的比例0min，A為20%，B為80% ； 18min，A為40%，B為60% ； 38min，A 為 80%，B 為 20%;48min，A 為 100%，B 為 0%;58min，A 為 80%，B 為 20%;78min， A 為 40%，B 為 60% ；78 90min，A 為 20%，B 為 80%。在該HPLC條件下，底物Rb1,出峰時(shí)間為23. 139min ；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出峰時(shí)間為 25. 237min ；Rd標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為25. 506min，可以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為Rd。實(shí)施例1 菌株的分離篩選1、分離人參內(nèi)生菌選取新鮮健康的人參，用自來水沖洗干凈，經(jīng)濾紙吸干水分 后，先用0. 升汞浸泡1 1.5min，經(jīng)無菌水沖洗4 5次；再用75%酒精浸泡1 1. 5min,經(jīng)無菌水沖洗3 4次。在無菌條件下，采用經(jīng)滅菌的手術(shù)剪將人參根系剪成小塊 (2mmX 2mm)，分別置于直徑9cm的PDA平板上。5 7d后觀察組織塊周圍有無菌落形成，并 挑取內(nèi)生真菌菌絲接種到PDA斜面培養(yǎng)基上純化和保存。培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯200g，葡萄糖18g，瓊脂 18g,lOOOmL。本實(shí)施例所采用的人參(Panax ginseng C. A. Mey)通過自行采集的方式獲得，由 發(fā)明人于是2009年8月采自遼寧省桓仁縣。2、菌株篩選(1)初步篩選制備固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基小塊(cp5mmXH5mm)，分別 將已活化好的真菌點(diǎn)種至塊狀培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7d，將菌塊浸泡在0. 5mL正 丁醇中，取上清液進(jìn)行TLC分析。所述固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基是每IOOmL培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，葡萄糖1. Sg,瓊脂 1. 8g，人參總皂苷20g ；去離子水配制，121°C，1. OkPa高壓滅菌30min。(2)復(fù)篩將已初步篩選出來的活性菌種接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5 7d。 加入IOOmL pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌1 2h。用紗布過濾，濾液在8000r/min下 離心lOmin，取上清液加入300mL 95%冰乙醇，4°C沉淀4h，8000r/min下離心lOmin，倒掉上 清液，沉淀溶于IOmL緩沖液中。在該緩沖液中透析，離心收集上清液即為酶液。取0. ImL 與等體積的單體皂苷溶液(溶劑是上述醋酸-醋酸鈉緩沖液，濃度10mg/ml)混合，40°C下 反應(yīng)Mh，加入0. 2mL正丁醇萃取lh，取上清液進(jìn)行TLC檢測。所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基是麥麩15g，豆粕5g，20mL去離子水，經(jīng)121°C，1. OkPa高壓滅菌
530mino3、菌株保存及活化培養(yǎng)篩選出的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基，4°C冰箱內(nèi)短期保存。需長期保存的菌株采用低溫冷凍干燥法保存，使用前活化SMA培養(yǎng)基 DextroselOg, Asparagine 2g, KH2PO4O. 5g, MgSO4· 7H20 0. 25g,Thiamine chlorideO. 5mg, 瓊脂15g，蒸餾水1000ml ；溫度:20°C。經(jīng)過鑒定，分離篩選到的真菌(CGMCC No. 4316)是灰綠犁頭霉菌，拉丁名Absidia glauca，其形態(tài)學(xué)特征如附圖2所示。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)化單一性試驗(yàn)采用實(shí)施例1步驟2 (2)的方法，試驗(yàn)篩選得到的灰綠犁頭霉菌(CGMCCNo. 4316) 對人參皂苷底物及產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化選擇性，經(jīng)TLC檢測，結(jié)果如附圖3所示可以看出，對原二醇類皂苷RbpRtvR^Rd為底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，本發(fā)明篩得的灰 綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)僅對底物Rb1發(fā)生反應(yīng)，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物僅為一種，根據(jù)Rf值可 以初步判斷該產(chǎn)物為Rd。具有很好的底物選擇性及產(chǎn)物單一性。實(shí)施例3 固體轉(zhuǎn)化法制備Rd①配制固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(PDA)每IOOmL培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，葡萄糖1. Sg,瓊 脂1. 8g,人參皂苷RbfOg ；去離子水配制，121°C，1. OkPa高壓滅菌30min。②將活化的灰綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)點(diǎn)種至上述含有人參皂苷的PDA培養(yǎng) 基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。③產(chǎn)物提取分離以正丁醇浸泡培養(yǎng)物，充分提取；提取液在lOOOOr/min，離心 Imin,用直徑為0. 22 μ m的微孔濾膜過濾后，HPLC分離目標(biāo)產(chǎn)物，HPLC條件流速0. 6mL/min ；檢測波長203nm ；柱溫35°C ；流動(dòng)相A為乙腈，B為
高純水；梯度洗脫流動(dòng)相的比例Omin，A 為 20%，B 為 80% ；18min，A 為 40%，B 為 60% ；38min，A 為 80%，B 為 20% ；48min，A 為 100%，B 為 0% ；58min，A 為 80%，B 為 20% ；78min，A 為 40%，B 為 60% ；78 90min，A 為 20%，B 為 80%。收集M 27min洗脫液，脫除溶劑即可得產(chǎn)物Rd。經(jīng)檢測，產(chǎn)物Rd的純度92%， 底物轉(zhuǎn)化率67%。實(shí)施例4 微生物酶法制備Rd①配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基麥麩15g，豆粕5g，20mL去離子水，經(jīng)121°C，1. OkPa高壓滅菌 30mino②將活化的灰綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于培養(yǎng) 5 7天；③收集酶液加入與產(chǎn)酶培養(yǎng)基等體積的pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌1 2h ；紗布過濾，濾液在8000r/min下離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積 的95%冰乙醇(0 4°C )，4°C沉淀4h ；8000r/min下離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. O醋酸-醋酸鈉緩沖液并在該緩沖液中透析，離心收集上清液即得酶液；④將所得酶液與等體積人參皂苷Rb1溶液混合，于40°C下反應(yīng)Mh，該人參皂苷Rb1 溶液溶劑為步驟③所述及的醋酸-醋酸鈉緩沖液，濃度10mg/ml ；⑤以正丁醇為溶劑萃取反應(yīng)液中的產(chǎn)物，按照實(shí)施例3步驟③的操作提取分離產(chǎn) 物。經(jīng)檢測，產(chǎn)物Rd的純度94%，底物轉(zhuǎn)化率75 %。
權(quán)利要求
1.一種人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌(CGMCC No. 4316)，其特征在于該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參 皂苷Rb1制備Rd的能力。
2.權(quán)利要求1所述的人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌(CGMCCNo. 4316)，其特征在于該菌專一 性作用于底物人參皂苷Rb1,將其轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd。
3.權(quán)利要求2所述的人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌(CGMCCNo. 4316)，其特征在于該菌與人 參皂苷Rb1反應(yīng)產(chǎn)物只有Rd，無副產(chǎn)物生成。
4.制備人參皂苷Rd的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1、2或3所述的灰綠犁頭霉菌 (CGMCC No. 4316)。
5.權(quán)利要求4所述的制備人參皂苷Rd的方法，其特征在于是將活化的灰綠犁頭霉菌 (CGMCC No. 4316)點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。
6.權(quán)利要求4所述的制備人參皂苷Rd的方法，其特征在于是將活化的灰綠犁頭霉菌 (CGMCC No. 4316)接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)5 7天；收集酶液并將其與人參皂苷 Rb1混合后，于40°C下反應(yīng)24h ；其中所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基是每20mL去離子水中加入麥麩15g和豆粕5g，經(jīng)121 °C， 1. OkPa高壓滅菌30min。
7.權(quán)利要求6所述的制備人參皂苷Rd的方法，其特征在于所述的酶液收集方法是 加入與產(chǎn)酶培養(yǎng)基等體積的PH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，攪拌1 ；紗布過濾，濾液在 8000r/min下離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積的95%乙醇，4°C沉淀 4h ；8000r/min下離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. O醋酸-醋酸鈉緩沖液并在該緩 沖液中透析，離心收集上清液即可。
8.權(quán)利要求7所述的制備人參皂苷Rd的方法，其特征在于所述的乙醇溫度O 4°C。
全文摘要
一種人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌(CGMCC No.4316)，該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1制備Rd的能力，并且具有很高的底物單一性和產(chǎn)物單一性。利用該菌制備人參皂苷Rd可以采用原位轉(zhuǎn)化，將其點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1的PDA培養(yǎng)基上，于25℃靜置培養(yǎng)5～7天。或者采用微生物酶法，活化后將其接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5～7天；收集酶液并將其與人參皂苷Rb1混合后，于40℃下反應(yīng)24h。采用本發(fā)明的技術(shù)方案生產(chǎn)人參皂苷Rd，具有專一性強(qiáng)、簡單方便、安全可靠、成本低且無副產(chǎn)物的特點(diǎn)。發(fā)酵產(chǎn)物Rd的純度在90％以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60％以上。
文檔編號C12N1/14GK102080048SQ20101057187
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者呂國忠, 孫曉東, 張薇 申請人:大連民族學(xué)院