專利名稱：一種培育附生蘭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育附生蘭的方法。
背景技術(shù)：
菌根化育苗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于造林工程中，世界上許多發(fā)達國家已將其作為營造 速生豐產(chǎn)林不可缺少的生物措施。菌根化育苗不僅可促進苗木的早期生長，而且可提高苗 木質(zhì)量。蘭科植物是典型的菌根植物，在長期的進化過程中已形成依賴菌根成活和生長的 特性。許多蘭花特別是腐生蘭對菌根已產(chǎn)生絕對的依賴性，在自然條件下沒有菌根就生長 不良，甚至死亡。所有的蘭花種子在自然條件下都需要與真菌共生才能萌發(fā)，形成菌根是它 們在自然條件下成活和生長的前提。自1擬4年美國植物學(xué)家Knudson利用人工添加營養(yǎng)物質(zhì)的方法代替共生真菌， 成功實現(xiàn)了蘭花種子的室內(nèi)無菌播種以來，組織培養(yǎng)技術(shù)已成為蘭花產(chǎn)業(yè)種苗生產(chǎn)的一種 常規(guī)方法。但是該技術(shù)應(yīng)用于蘭科植物的栽培仍有許多問題亟待解決(1)組培苗移栽成 活率低，人們雖然已成功培育出多種野生蘭科植物組培苗，但極低的試管苗移栽成活率成 為規(guī)模化繁育的主要限制因子；( 幼苗生長緩慢，如國蘭組培苗移栽在大田栽培時出現(xiàn) 幼苗生長停滯，需經(jīng)歷一段較長時間的“墩苗期”才能恢復(fù)；C3)組培苗抗逆性、出瓶適應(yīng)性 差，易遭受病蟲害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于培育附生蘭的菌株。本發(fā)明所提供的菌株為假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3，其保藏編號為 CGMCCNo. 4148。假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3CGMCC No. 4148在培育附生蘭植株中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。以上應(yīng)用中，所述附生蘭為蘭科石斛(Dendrobium)屬植物；所述蘭科石斛屬植物 為華石斛(Dendrobium sinense)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育附生蘭植株的方法。本發(fā)明所提供的培育附生蘭植株的方法，為如下1)或2、所示1)包括如下步驟用假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3 CGMCC No. 4148 侵染附 生蘭的組培苗根部，得到菌根化組培苗，再移栽所述菌根化組培苗進行馴化培養(yǎng)，得到附生 蘭植株；2)包括如下步驟用假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3 CGMCC No. 4148 侵染附 生蘭的馴化苗根部，共培養(yǎng)，得到附生蘭植株。上述方法1)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3 CGMCC No. 4148 侵染附生蘭的組培苗根部的方法包括如下步驟將附生蘭的組培苗接入含有假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148 的共生培養(yǎng)基中，再共培養(yǎng)。上述方法2)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3 CGMCC No. 4148 侵染 附生蘭的馴化苗根部的方法為向所述附生蘭的馴化苗根部噴灑假尾孢O^seudocercospora sp. )S3 CGMCC No. 4148 的菌劑。上述任一所述方法1)中，所述共培養(yǎng)的溫度為23°C 46°C，具體為23°C、25°C或 26°C ；所述共培養(yǎng)的光照強度為2000Lx 3000Lx，具體為2000Lx、2500Lx或3000Lx ；所述 共培養(yǎng)的光周期為14h光照/IOh黑暗；所述共培養(yǎng)的時間為30天-45天，具體為30天、35 天或45天。上述任一所述方法1)中，所述含有假尾孢(I^seudocercospora sp.) S3 CGMCCNo. 4148的共生培養(yǎng)基按照包括如下步驟的方法得到將所述假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148接種于共生培養(yǎng)基，進行菌的活化培養(yǎng)，得到 所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148的共生培養(yǎng)基；1 升所述共生培養(yǎng)基由 950mg KN03、825mg NH4NO3>85mg KH2P04、185mg MgSO4. 7H20、 220mg CaCl2. 2H20、0. 415mg KI、3. Img H3BO3Ul. 15mg MnSO4. 4H20、4. 3mg ZnSO4. 7H20、 0. 125mg Na2MoO4. 2H20、0. 0125mg CuSO4. 5H20、0. 0125mg CoCl2. 6H20、18. 65mgNa2. EDTA、 18. 9mg FeSO4. 7H20、50mg 肌醇、Img 甘氨酸、0. 05mg VB 1,0. 25mg VB6、0. 25mg 煙酸、30g 蔗 糖、0. 5g活性炭、30g香蕉、30g 土豆、7g-8g瓊脂和水組成；水補足體積；所述共生培養(yǎng)基的pH值為5. 5-5. 8，具體為5. 5,5. 6或5. 8 ；上述任一所述方法2)中，所述假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3 CGMCC No. 4148的菌劑按照包括如下步驟的方法得到將假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCCNo. 4148用DE培養(yǎng)基培養(yǎng)，取帶有菌絲的培養(yǎng)基塊，將帶有菌絲的培養(yǎng)基塊搗碎與 水混合，即得到菌劑；所述搗碎的帶有菌絲的培養(yǎng)基塊與水的體積比為1 0-4)，具體為 1 2、1 3 或 1 4。上述任一所述方法1)中，所述菌的活化培養(yǎng)的溫度為23_26°C，具體為23°C、25°C 或^rc ；所述菌的活化培養(yǎng)在黑暗的條件下進行；所述菌的活化培養(yǎng)的時間為6天-8天， 具體為6天、7天或8天；上述任一所述方法2、中，所述噴灑的方式為每隔10天噴灑1次，共噴灑7次-9 次或7次或8次或9次，每次的噴灑劑量為5ml菌劑/株馴化苗。上述任一所述方法1)中，所述馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)為滅菌的苔蘚；上述任一所述方法2·)中，所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)為無菌苔蘚；上述任一所述方法1)中，所述馴化培養(yǎng)的溫度為25°C 48°C，具體為25°C、26°C或 28°C ；所述馴化培養(yǎng)的濕度為70% -90%，具體為70%、80%或90% ；所述馴化培養(yǎng)的遮陽 率為 60% -70%，具體為 60%、65%或 70% ；上述任一所述方法幻中，所述共培養(yǎng)的濕度為70% -90%，具體為70^^80%或 90% ；所述共培養(yǎng)的遮陽率為60%-70%，具體為60%、65%或70% ；所述共培養(yǎng)的溫度為 25 0C 48°C，具體為 25°〇、261或沘1。上述任一所述方法中，所述附生蘭為蘭科石斛(Dendrobium)屬植物；所述蘭科石 斛屬植物為華石斛(Dendrobium sinense)。實驗證明，與不接菌的對照相比，本發(fā)明方法顯著提高了附生蘭組培苗的移栽成活率，植株的鮮重顯著提高，且植株的適應(yīng)性廣、抗逆性增強，且本發(fā)明方法促進幼苗生長， 縮短蹲苗期，繁殖周期短。因此，本發(fā)明方法在附生蘭的人工培育領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前 景，為附生蘭野生資源的保存奠定了基礎(chǔ)。


圖1為菌株的形態(tài)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中使用的附生蘭種子為華石斛(Dendrobium sinense Tang&ffang)的 種子，在文獻“吳智彪，宋希強，李紹鵬.華石斛內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對其組培苗生長的影響 (J)，熱帶作物學(xué)報，2006，27 (1)，77-79”中公開過，公眾可從海南珠峰園林科技有限公司獲 得。實施例1、真菌的分離與鑒定一、分離方法從采自海南省霸王嶺的野生華石斛(Dendrobium sinense Tang&ffang)分離出菌 株，其方法如下1. 1、選取野生長勢健壯并生長旺盛的野生華石斛的新鮮營養(yǎng)根，流水沖洗掉根表 面腐殖質(zhì)和雜物。1. 2、在超菌工作臺上將根段浸入次氯酸鈣溶液中10-iaiiin進行表面滅菌，然 后用無菌水沖洗3-4次。1. 3、將根段切成2_3mm長的小段，放置在PDA培養(yǎng)基上，25°C下暗培養(yǎng)，經(jīng)過一段 時間培養(yǎng)后，待菌絲自根段中長成菌落后，挑取菌絲轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)純化。1.4、沒有污染，轉(zhuǎn)入指型管內(nèi)PDA斜面培養(yǎng)基，4°C短期保存待用。每升PDA培養(yǎng)基是由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g瓊脂粉和IL水制成，PH自然。 將分離得到的菌株與目標(biāo)苗分別進行共生培養(yǎng)，一定時間后檢測該菌株對苗的生長的促進 作用的大小(檢測如下指標(biāo)單位時間內(nèi)苗增加的鮮重、株高、節(jié)數(shù)、葉片數(shù))，各指標(biāo)均高 于對照組，則確定該菌為益菌。結(jié)果得到一株菌，命名為S3.二、鑒定菌株S3在PDA培養(yǎng)基上，菌落黑色，表面為灰白色，背面看有同心圓，菌落生長速 度中等。菌絲淺褐色，有分支，未見分生孢子。如圖1(A為肉眼觀察，B為顯微鏡觀察)。檢測該菌株中的ITS rDNA基因，得到的序列如SEQ ID N0:1所示。將該基因序 列在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行blast比對。比對結(jié)果表明，該序列與假尾孢屬的序列的相似性為 99%。綜合以上鑒定結(jié)果，表明該菌株屬于假尾孢(Pseudocercospora sp.)。該菌株已 于2010年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC No. 4148，分類命名為假尾孢(Pseudocercospora sp.)。實施例2、通過菌根化組培苗培育附生蘭方法I一、組培苗的獲得組培苗的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)中相同。1、無菌播種將成熟未開裂的果莢，經(jīng)過滅菌消毒等處理后，播種至事先消毒好的 空白培養(yǎng)基(即將8g瓊脂粉和IOOOml水混合，PH :5. 5-5. 8)上。2346°C、黑暗培養(yǎng)15_20d 后；改為光照強度為2000Lx 3000Lx，光周期為14h光照/IOh黑暗，溫度23-26°C培養(yǎng)， 20-30d種子即萌發(fā)。2、圓球經(jīng)培養(yǎng)將已萌發(fā)的種子放入培養(yǎng)基為l/2MS+20g糖+50-100ml椰子汁 +20g 土豆+7g瓊脂，PH 5. 5-5. 8。光照強度為2000Lx 3000Lx，光周期為14h光照/IOh 黑暗，溫度23-26°C下培養(yǎng)，30-45d，即可長成幼苗。3、壯苗培養(yǎng)將幼苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基為l/2MS+20g糖+50ml椰子汁+30g 土豆+30g 香蕉+7g瓊脂，PH 5. 5-5. 8。光照強度為2000Lx 3000Lx，光周期為14h光照/IOh黑暗， 溫度23-26°C下培養(yǎng)，30-45d,苗較粗壯，葉片數(shù)達4片，株高可達3cm，株徑0. 2cm。4、生根培養(yǎng)將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后的苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基為l/2MS+20g糖+50ml椰子汁 +30g 土豆+30g香蕉+0. 5g活性炭+7g瓊脂，PH :5. 5-5. 8。光照強度為2000Lx 3000Lx, 光周期為14h光照/IOh黑暗，溫度23-26°C下培養(yǎng)，30-45d，苗較粗壯，根數(shù)可達3根。以上培養(yǎng)基均為每1升培養(yǎng)基所含的添加物的量。二、菌劑的制備1、活化將假尾孢(Pseudocercosporasp. ) S3 CGMCC No. 4148 接種于 PDA 培養(yǎng)基，25°C下 暗培養(yǎng)活化。PDA培養(yǎng)基制備與現(xiàn)有技術(shù)中相同，每升PDA培養(yǎng)基由200克去皮土豆，20g蔗 糖，20g瓊脂粉和IL水制成，PH自然。2、菌塊培養(yǎng)將帶有單一純菌絲的培養(yǎng)基塊接種于DE培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)15天，得到含 有假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148 菌絲的 DE 培養(yǎng)基。DE培養(yǎng)基組成為現(xiàn)有技術(shù)中常用的培養(yǎng)基。每一升培養(yǎng)基具體是由終濃度為110. 98mg/L的CaCl2、終濃度為174. 25mg/L的 K2SO4、終濃度為 123. 24mg/L 的 MgSO4. 7H20、終濃度為 54. 44mg/L 的 KH2PO4、終濃度為 1. 55mg/ L的Η3Β04、終濃度為6. 53mg/L的MnCl. 4H20、終濃度為0. 80mg/L的ZnSO4. 7H20、終濃度為 0. 24mg/L 的 NaMO4. 2H20、終濃度為 52. llmg/L 的 CltlH14N2O8Na2. 2H20、終濃度為 27. 80mg/L 的 FeSO4. 7H20、終濃度為9g/L的可溶性淀粉、終濃度為lg/L的酵母膏、終濃度為8g/L的瓊脂 和水組成，其最終PH值為6.0?？扇苄缘矸圪徸試幖瘓F化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號為10021318。酵母膏購 白國藥集團化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號為69024838。三、組培苗接菌取直徑為0. 5cm的上述步驟二制備得到的帶菌的培養(yǎng)基塊，接種于共生培養(yǎng)基上，在25°C下暗培養(yǎng)7d(菌種活化)后，將實驗一得到的組培苗接入共生培養(yǎng)基中，再共培 養(yǎng)35d，共培養(yǎng)條件光照強度為2500Lx，光周期為14h光照/IOh黑暗，溫度25°C。利用菌 根染色法進行組培苗菌根化的快速檢測。對照以不接入任何菌的共生培養(yǎng)基培養(yǎng)相同的組培苗。用菌根染色法進行組培苗菌根化的快速檢測將對照和不同處理的根分別放入 10% KOH中，121 °C脫色20min，取出后用無菌水沖洗3次，用苯胺藍90°C條件下染色4h，堿 性H2O2脫色8min，脫水后根段中染上顏色的即為真菌侵染成功的菌根。結(jié)果實驗組的組培 苗菌根化成功，且出現(xiàn)絲狀的藍色條帶，即為被染色的菌絲，對照組的組培苗未出現(xiàn)菌根。共生培養(yǎng)基的組成如表1，用水定容，PH 5. 6, 表1、每1升共生培養(yǎng)組成
權(quán)利要求
1.一種培育附生蘭植株的方法，為如下1)或幻所示1)包括如下步驟用假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3 CGMCC No. 4148侵染附生蘭 的組培苗根部，得到菌根化組培苗，再移栽所述菌根化組培苗進行馴化培養(yǎng)，得到附生蘭植 株；2)包括如下步驟用假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3 CGMCC No. 4148侵染附生蘭 的馴化苗根部，共培養(yǎng)，得到附生蘭植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述用假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148侵染附生蘭的組培苗根部的方法包括如下步 驟將附生蘭的組培苗接入含有假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148的共生 培養(yǎng)基中，再共培養(yǎng)；所述方法2)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp. )S3 CGMCC No. 4148侵染附生蘭 的馴化苗根部的方法為向所述附生蘭的馴化苗根部噴灑假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148 的菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述共培養(yǎng)的溫度 為23°C 46°C，具體為23°C、25°C或；所述共培養(yǎng)的光照強度為2000Lx 3000Lx，具 體為2000LX、2500LX或3000Lx ；所述共培養(yǎng)的光周期為14h光照/IOh黑暗；所述共培養(yǎng)的 時間為30天-45天，具體為30天、35天或45天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述含有假尾 孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148的共生培養(yǎng)基按照包括如下步驟的方法得 到將所述假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148接種于共生培養(yǎng)基，進行菌 的活化培養(yǎng)，得到所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCCNo. 4148的共生培養(yǎng) 基；1 升所述共生培養(yǎng)基由 950mg KN03、825mg NH4N03、85mg KH2P04、185mg MgSO4. 7H20、 220mg CaCl2. 2H20、0. 415mg KI、3. Img H3BO3Ul. 15mg MnSO4. 4H20、4. 3mg ZnSO4. 7H20、 0. 125mg Na2MoO4. 2H20、0. 0125mg CuSO4. 5H20、0. 0125mg CoCl2. 6H20、18. 65mgNa2. EDTA、 18. 9mg FeSO4. 7H20、50mg 肌醇、Img 甘氨酸、0. 05mg VB 1,0. 25mg VB6、0. 25mg 煙酸、30g 蔗 糖、0. 5g活性炭、30g香蕉、30g 土豆、7g-8g瓊脂和水組成；水補足體積；所述共生培養(yǎng)基的PH值為5. 5-5. 8，具體為5. 5、5. 6或5. 8 ；所述方法2)中，所述假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148的菌劑按照 包括如下步驟的方法得到將假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148用DE培 養(yǎng)基培養(yǎng)，取帶有菌絲的培養(yǎng)基塊，將帶有菌絲的培養(yǎng)基塊搗碎與水混合，即得到菌劑；所 述搗碎的帶有菌絲的培養(yǎng)基塊與水的體積比為1 0-4)，具體為1 2、1 3或1 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述菌的活化 培養(yǎng)的溫度為23j6°C，具體為231、251或沈1；所述菌的活化培養(yǎng)在黑暗的條件下進 行；所述菌的活化培養(yǎng)的時間為6天-8天，具體為6天、7天或8天；所述方法2、中，所述噴灑的方式為每隔10天噴灑1次，共噴灑7次-9次或7次或8 次或9次，每次的噴灑劑量為5ml菌劑/株馴化苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述馴化培養(yǎng) 的培養(yǎng)基質(zhì)為滅菌的苔蘚；所述方法幻中，所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)為無菌苔蘚；
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法1)中，所述馴化培養(yǎng) 的溫度為25°C 48°C，具體為25°C、26°C或；所述馴化培養(yǎng)的濕度為70% -90%，具體 為70%、80%或90% ；所述馴化培養(yǎng)的遮陽率為60%-70%，具體為60%、65%或70% ；所述方法幻中，所述共培養(yǎng)的濕度為70% -90%，具體為70%、80%或90%;所述共培 養(yǎng)的遮陽率為60% -70%，具體為60^^65%或70% ；所述共培養(yǎng)的溫度為25°C 48°C，具 體為 25°C、26°C或 ^°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述附生蘭為蘭科石斛 (Dendrobium)屬植物；所述蘭科石斛屬植物為華石斛(Dendrobium sinense)。
9.假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3，其保藏編號為 CGMCC No. 4148。
10.假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3 CGMCC No. 4148在培育附生蘭植株中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育附生蘭的方法。本發(fā)明的培育附生蘭的方法包括如下步驟包括如下步驟用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生蘭的組培苗根部，得到菌根化組培苗，再移栽所述菌根化組培苗進行馴化培養(yǎng)，得到附生蘭植株。實驗證明，與不接菌的對照相比，本發(fā)明方法顯著提高了附生蘭組培苗的移栽成活率，植株的鮮重顯著提高，且植株的適應(yīng)性廣、抗逆性增強，且本發(fā)明方法促進幼苗生長，縮短蹲苗期，繁殖周期短。因此，本發(fā)明方法在附生蘭的人工培育領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景，為附生蘭野生資源的保存奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/14GK102132672SQ20101059468
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者宋希強, 李霖明, 楊澤秀, 鐘云芳 申請人:海南珠峰園林科技有限公司