專利名稱：一種高效誘導(dǎo)人類體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞 的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞向成體細(xì)胞的發(fā)育與分化在基因水平受精密調(diào)控，而逆轉(zhuǎn)成體細(xì)胞的分 化狀態(tài)至多潛能的干細(xì)胞狀態(tài)即為重編程。2007年日本、美國的科學(xué)家(Takahashi et al. 2007 ；Yu et al. 2007 ；Park et al. 2008)相繼報道，在人類體細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄病 毒(或慢病毒)過表達(dá)四個轉(zhuǎn)錄因子基因(0ct4，Sox2, Klf4與c-Myc，或者0ct4，Sox2, Nanog與Lin28)，逆轉(zhuǎn)人類成體細(xì)胞的分化狀態(tài)，獲得多能潛能干細(xì)胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)。有報道證實，通過病毒載體導(dǎo)入0ct3/4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子基 因，即可將體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞(Danwei Huangfu，2008)。2009年3月5日，Cell 報道Rudolf Jaenisch研究組利用Cre-重組酶系統(tǒng)使誘導(dǎo)成功的帕金森病人iPSC無外源 因子，使iPSC臨床應(yīng)用又推進(jìn)了一步。2009年3月26日，Science報道俞君英等通過一種非 整合質(zhì)粒Episomal Vector成功誘導(dǎo)出無外源基因也無載體整合到基因組上的iPSC(俞君 英等人，無載體也無外源基因序列的人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，科學(xué)，2009. 324:7797-801)。人 類體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞(iPSC)是近兩年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重要里程碑事件。在 2007-2008年連續(xù)兩年被science雜志評為十大科學(xué)進(jìn)展(Kennedy 2007 ；Vogel 2008)。通過調(diào)控體細(xì)胞重編程，使成體細(xì)胞獲得與胚胎干細(xì)胞(ESC)相似的多潛能性，具 有非常重要的研究和潛在的細(xì)胞替代治療價值。人類iPSC和胚胎干細(xì)胞能夠特異性的表 達(dá)SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81等表面抗原，以及Nanog、0ct4等核轉(zhuǎn)錄因子基因。 通過懸浮培養(yǎng)，iPSC和胚胎干細(xì)胞能形成胚狀體(EB)后，能夠分化形成人類胚胎的三個胚 層的細(xì)胞，表達(dá)三個胚層所特有的基因。這些特性是判斷iPSC具有類似未分化的人類胚胎 干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。由于多潛能干細(xì)胞(iPSC)具有多向分化潛能，越來越多的研究者正在探索 體外誘導(dǎo)iPSC分化，用于不可再生細(xì)胞的替代治療。此外，由于患者來源的iPSC攜帶相應(yīng) 的致病基因和特異的細(xì)胞病理過程，研究人員已經(jīng)從I型糖尿病、帕金森病和另外至少十 幾種疾病的患者身上誘導(dǎo)獲得iPSC，這些疾病特異的iPSC可作為疾病的細(xì)胞模型，對于研 究人類疾病具有重要意義。盡管iPSC吸引各國研究者開展大量研究，然而目前現(xiàn)有的誘導(dǎo)人類或靈長類體 細(xì)胞為iPSC的技術(shù)體系面臨如下問題①其效率極低，約1/10000左右，②誘導(dǎo)時間漫長， 約24天左右。③各個研究小組所獲得的iPSC其細(xì)胞表型，基因表達(dá)及其功能均有差異。上 述技術(shù)問題在很大程度上限制了 iPSC的研究應(yīng)用。因此，要使人類iPSC在再生醫(yī)學(xué)和疾病發(fā)生研究中得到廣泛應(yīng)用，必須探索一種 高效誘導(dǎo)策略，縮短重編程所需時間，簡化誘導(dǎo)過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞，同時縮短重編 程時間的手段，本發(fā)明的另一個目的是提供使用該手段的方法。本發(fā)明人以實現(xiàn)上述目的為目標(biāo)進(jìn)行了廣泛的研究，并且發(fā)現(xiàn)在將核重編程因子 與體細(xì)胞接觸之前，用含甲狀腺激素T3或T4培養(yǎng)基培養(yǎng)體細(xì)胞，可以顯著的增加iPSC形 成效率。一種誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的方法包括以下步驟
A.用含甲狀腺激素T3或T4的培養(yǎng)基培養(yǎng)體細(xì)胞2-4天；
B.將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸，繼續(xù)培養(yǎng)，挑選形態(tài)類似胚 胎干細(xì)胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，得到多潛能干細(xì)胞。所述甲狀腺激素T3或T4濃度優(yōu)選ΙΟ,-Ι ΤπιοΙ/Ι。加入的甲狀腺激素Τ3或Τ4 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞能量代謝，提高重編程效率和縮短誘導(dǎo)周期。所述核重編程因子為能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的因子，該核重編程 因子以DNA、mRNA或蛋白質(zhì)形式與體細(xì)胞接觸。所述核重編程因子可來源于不同的物種，優(yōu)選與所使用體細(xì)胞相同來源的生物， 如體細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞時，所述核重編程因子優(yōu)選為人的核重編程因子及其變體。優(yōu)選的，所述核重編程因子以DNA形式與體細(xì)胞接觸，所述DNA為分別帶有相應(yīng)核 重編程因子編碼序列的載體。更優(yōu)選的，所述載體為病毒載體或質(zhì)粒。所述病毒載體和質(zhì)粒均有成熟的商品供應(yīng)，可以從市場上購得。更優(yōu)選的，所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺病毒載體。上述任一方案中更優(yōu)選的，所述核重編程因子包含0ct3/4和S0X2、S0X1中的一種。更優(yōu)選的，所述核重編程因子還包含Klf4，c-Myc，Nanog, Lin28中的至少一種。所述Klf4可替換為Klf5或Klf2。所述 c-Myc 可替換為 L-Myc 或 Ν-Myc。更優(yōu)選的，所述核重編程因子為0ct3/4、Sox2、Klf4，c_Myc 或 0ct3/4、Sox2、Klf4， Nanog0上述各核重編程因子編碼序列均可在NCBI上查找得到。上述任一方案中更優(yōu)選的，所述體細(xì)胞可來源于不同的種屬，包括但不限于人類、 大猩猩、猴子等。更優(yōu)選的，所述體細(xì)胞為靈長類動物的皮膚成纖維細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞、淋巴細(xì) 胞、毛囊細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以從靈長類物 種分離得到或者從相關(guān)的細(xì)胞庫購買。更優(yōu)選的，所述體細(xì)胞為人的皮膚成纖維細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、毛囊細(xì) 胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。上述任一方案中更優(yōu)選的，在將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接 觸后，需繼續(xù)用含甲狀腺激素T3或T4的培養(yǎng)基培養(yǎng)5-8天，所述甲狀腺激素T3或T4濃度 為ΙΟ,-Ι ΓπιοΙ/Ι，通過上述處理能夠進(jìn)一步增加iPSC形成效率。上述任一方案中更優(yōu)選的，將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸后，繼續(xù)培養(yǎng)18-30小時，然后換含20%FBS-DMEM培養(yǎng)，3-5天后傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 3-5天，最后換ESC培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天即可得到多潛能干細(xì)胞。所述20%FBS-DMEM為含20%胎牛血清的高糖DMEM或者DMEM/F12培養(yǎng)基，添加終濃 度為 2mmol/L L-glutamine，終濃度為 0. lmmol/L b-巰基乙醇，終濃度為 5-100ng/mL bFGF, 終濃度為0. lmmol/L非必需氨基酸和抗生素。該抗生素優(yōu)選終濃度為50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素。所述飼養(yǎng)層細(xì)胞可以是胚胎期13. 5天的小鼠成纖維細(xì)胞，胚胎期人皮膚細(xì)胞， 成人皮膚成纖維細(xì)胞，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等，優(yōu)選為用絲裂霉素處理使其失去增殖能力 的胚胎期13. 5天的小鼠成纖維細(xì)胞。更優(yōu)選的，將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸的同時補(bǔ)充加入 與新鮮培養(yǎng)液，維持細(xì)胞增殖所需能量，該新鮮培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分 別為 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，10ng/mL 的 bFGF, 20% (vol/vol) FBS 和抗生素。該抗生素優(yōu)選終濃度為50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素。更優(yōu)選的，所述ESC培養(yǎng)基是由knockout DMEM或DMEM/F12、5_100ng/L堿性成纖 維細(xì)胞生長因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b_巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基 酸、20%血清替代物、5-25ug/mL抗支原體藥物plasmocin以及抗生素組成的培養(yǎng)基。該抗生素優(yōu)選終濃度為50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素。通過本發(fā)明方法得到的多潛能干細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞(ES)相似的特性，這些特 性包括增殖能力、表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記、形成包含內(nèi)、中、外三個胚層的組織和細(xì)胞的畸胎 瘤。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為 多潛能干細(xì)胞的方法，能夠提高誘導(dǎo)iPSC效率20-100倍，達(dá)到1. 2%左右，并且縮短誘導(dǎo)周 期至12-16天，同時誘導(dǎo)獲得的iPSC不同克隆之間細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、多潛能基因表達(dá)均 一，能夠用于細(xì)胞替代治療。


圖1是3組細(xì)胞分別誘導(dǎo)13天后TRA-1-60的表達(dá)情況。圖2是3組細(xì)胞分別誘導(dǎo)13天后TRA-1-60陽性表達(dá)率。圖3是實施例5所得iPSC形態(tài)圖片。圖4是實施例5所得iPSC表達(dá)人類ESC多潛能相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記圖。圖5是實施例5所得iPSC形成的擬胚體及其分化圖。
具體實施例方式下面結(jié)合

及具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)一步說明。一.高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞。實施例1.含核重編程因子編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的擴(kuò)增。按現(xiàn)有技術(shù)，從Addgene公司購買分別包含人0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc的逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體。在大腸桿菌中擴(kuò)增后，純化得到含有相應(yīng)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
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實施例2.包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒。按現(xiàn)有技術(shù)，將分別含有0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒。并用通過30-100KD超濾管，5000 X g，4°C，離心30分鐘，收 集病毒液，使其分別濃縮10倍左右，終濃度約為5X 106-5X 107 transducing units/mL/ 單個核重編程因子。將濃縮后的分別含有0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒 等體積混合，取0.6-1.0 ml病毒溶液感染體細(xì)胞，此時的病毒滴度MOI (multiplicity of infection)約為5-50/單個核重編程因子。實施例3.含核重編程因子編碼序列的慢病毒載體的擴(kuò)增。按現(xiàn)有技術(shù)，從Addgene公司購買人0ct3/4、Sox2、Nanog和Lin28的慢病毒質(zhì)粒。 在大腸桿菌中擴(kuò)增后，純化得到含有相應(yīng)基因的慢病毒質(zhì)粒。實施例4.包裝慢病毒。按現(xiàn)有技術(shù)，將分別含有0ct3/4、SOX2、NanOg、Lin28基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，包裝慢病毒。并用通過30-100KD超濾管，5000 X g，4°C，離心30分鐘，收集病毒液，使 其分別濃縮10倍左右。終濃度約為5X 106-5X 107 transducing units/mL/單個核重編程 因子。包裝細(xì)胞的質(zhì)量對感染效率非常關(guān)鍵，將濃縮后的慢病毒混合，取0.6-1.0 ml病毒 溶液感染體細(xì)胞，此時的病毒滴度MOI (multiplicity of infection)約為5-50/單個核重 編程因子。實施例5.多潛能干細(xì)胞的制備。將人類皮膚成纖維細(xì)胞傳代至12孔板，每孔約2. 5-3 X IO4個。在培養(yǎng)基(DMEM/ F12培養(yǎng)基中添加終濃度為0. lmmol/L非必需氨基酸，終濃度為2mmol/L L-glutamine,終 濃度為 0. lmmol/L b-巰基乙醇，終濃度為 10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，終濃度為50 units/mL青霉素和終濃度為50mg/mL鏈霉素)中加 入甲狀腺激素T3，使其終濃度為5X 10_9mOl/L，培養(yǎng)3天后，加入實施例2所得逆轉(zhuǎn)錄 病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鮮培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別 為 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol)FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)，維持細(xì)胞增殖所需能 量。24h后換20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別為20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，30ng/mL bFGF, 50 imits/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，病毒感染后的細(xì)胞增殖減慢，感染后的第3天 左右出現(xiàn)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的形態(tài)改變。換20%FBS-DMEM培養(yǎng)后第5天將細(xì)胞以4-10X IO2/ cm2的密度傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)。傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞后第3天開始換用人ESC培養(yǎng)基培 養(yǎng)，重編程的iPSC克隆在換用人ESC培養(yǎng)基后第4天左右出現(xiàn)，表達(dá)多潛能基因SSEA4， TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin，NANOG 以及內(nèi)源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培養(yǎng)基是 由knockout DMEM培養(yǎng)基中添加終濃度分別為30ng/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原體藥物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素組成的培養(yǎng)基。經(jīng) 過進(jìn)一步的篩選，得到符合胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，即多潛能干細(xì)胞。在加入逆轉(zhuǎn)錄病 毒感染人類皮膚成纖維細(xì)胞后的6天內(nèi)，需在培養(yǎng)基中添加甲狀腺激素T3，使其終濃度為 5Xl(T9mol/L。
實施例6.多潛能干細(xì)胞的制備。將人類粘膜上皮細(xì)胞傳代至12孔板，每孔約2. 5-3X IO4個。在培養(yǎng)基中(含 DMEM/F12、0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b-巰基乙醇，10 ng/mL 的 bFGF，20%KSR (knockout serum replacement)，50 units/mL 青霉素禾口 50mg/mL 鏈霉素)加入甲狀腺激素T3，使其終濃度為5 X 10_8mOl/L，培養(yǎng)2天后，加入實施例4所得 的慢病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鮮培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分 別為 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L β -巰基乙醇，10ng/mL 的bFGF，20%FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)，維持細(xì)胞增殖所需能量。18h 后換用20%FBS-DMEM(高糖DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別為20%FBS，2mmol/ L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，5-100ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)。病毒感染后的細(xì)胞增殖減慢，感染后的第3天 左右出現(xiàn)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的形態(tài)改變。換20%FBS-DMEM培養(yǎng)后第4天將細(xì)胞以4-10X IO2/ cm2的密度傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)。代至飼養(yǎng)層細(xì)胞后第4天開始換用人ESC培養(yǎng)基(DMEM/ F12培養(yǎng)基中添加終濃度為2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b-巰基乙醇，0. lmmol/L非 必需氨基酸，60ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，重編程的iPSC 克隆在換用人ESC培養(yǎng)基后第4天左右出現(xiàn)，表達(dá)多潛能基因SSEA4，TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin,NANOG以及內(nèi)源性0ct3/4，SoX2等。經(jīng)過進(jìn)一步的篩選，得到符合胚胎干細(xì)胞 特性的細(xì)胞克隆，即多潛能干細(xì)胞。在加入逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人類皮膚成纖維細(xì)胞后的7天 內(nèi)，需在培養(yǎng)基中添加甲狀腺激素T3，使其終濃度為5 X 10_8mOl/L。實施例7.多潛能干細(xì)胞的制備。將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至12孔板，每孔約2. 5-3 X IO4個。在培養(yǎng)基(DMEM/ F12培養(yǎng)基中添加終濃度為0. lmmol/L非必需氨基酸，終濃度為2mmol/L L-glutamine,終 濃度為 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，終濃度為 60ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，終濃度為50 units/mL青霉素和終濃度為50mg/mL鏈霉素)中加 入甲狀腺激素T4，使其終濃度為liTmol/L，培養(yǎng)3天后，加入實施例2所得逆轉(zhuǎn)錄病毒 液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鮮培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別為 0. lmmol/L 非必需氨基酸,2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol)FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)，維持細(xì)胞增殖所需能 量。30h后換20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別為20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，40ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，病毒感染后的細(xì)胞增殖減慢，感染后的第3天 左右出現(xiàn)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的形態(tài)改變。換20%FBS-DMEM培養(yǎng)后第3天將細(xì)胞以4-10X IO2/ cm2的密度傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)。傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞后第5天開始換用人ESC培養(yǎng)基培 養(yǎng)，重編程的iPSC克隆在換用人ESC培養(yǎng)基后第5天左右出現(xiàn)，表達(dá)多潛能基因SSEA4， TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin, NANOG 以及內(nèi)源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培養(yǎng)基是由 knockout DMEM培養(yǎng)基中添加終濃度分別為5-lOOng/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原體藥物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素組成的培養(yǎng)基。經(jīng) 過進(jìn)一步的篩選，得到符合胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，即多潛能干細(xì)胞。在加入逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人類皮膚成纖維細(xì)胞后的8天內(nèi)，需在培養(yǎng)基中添加甲狀腺激素T4，使其終濃度為 l(T7mol/L。實施例8.多潛能干細(xì)胞的制備。將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至12孔板，每孔約2. 5-3 X IO4個。在培養(yǎng)基(DMEM/ F12培養(yǎng)基中添加終濃度為0. lmmol/L非必需氨基酸，終濃度為2mmol/L L-glutamine,終 濃度為 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，終濃度為 40ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，終濃度為50 units/mL青霉素和終濃度為50mg/mL鏈霉素)中加 入甲狀腺激素T4，使其終濃度為5X 10_8mOl/L，培養(yǎng)4天后，加入實施例2所得逆轉(zhuǎn)錄 病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鮮培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別 為 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20% (vol/vol) FBS, 50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)，維持細(xì)胞增殖所需能 量。24h后換20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基中添加終濃度分別為20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巰基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，20ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，病毒感染后的細(xì)胞增殖減慢，感染后的第3天 左右出現(xiàn)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的形態(tài)改變。換20%FBS-DMEM培養(yǎng)后第4天將細(xì)胞以4-10X IO2/ cm2的密度傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)。傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞后第4天開始換用人ESC培養(yǎng)基培 養(yǎng)，重編程的iPSC克隆在換用人ESC培養(yǎng)基后第4天左右出現(xiàn)，表達(dá)多潛能基因SSEA4， TRA-l-60,TRA-l-81,E-cadherin, NANOG 以及內(nèi)源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培養(yǎng)基是由 knockout DMEM培養(yǎng)基中添加終濃度分別為5-lOOng/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原體藥物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL鏈霉素組成的培養(yǎng)基。經(jīng) 過進(jìn)一步的篩選，得到符合胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，即多潛能干細(xì)胞。在加入逆轉(zhuǎn)錄病 毒感染人類皮膚成纖維細(xì)胞后的5天內(nèi)，需在培養(yǎng)基中添加甲狀腺激素T4，使其終濃度為 5Xl(T8mol/L。除特別陳述外，上述實施例中所使用試劑均可從Invitrogen公司購買，細(xì)胞株均 為標(biāo)準(zhǔn)株。利用含核重編程因子編碼序列的腺病毒載體或質(zhì)粒誘導(dǎo)iPSC的方法可參考上述 實施例，在此不再贅述。本發(fā)明中各培養(yǎng)基中的bFGF在其相應(yīng)的含量范圍內(nèi)均能很好的促 進(jìn)細(xì)胞的生長。本發(fā)明所使用的核重編程因子組合可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)做出相應(yīng)的調(diào)整，在此不再贅 述。二.獲得的多潛能干細(xì)胞的鑒定。分別以人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)為原料，按實施 例5方法制備iPSC，同時設(shè)一無甲狀腺激素T3誘導(dǎo)對照組(HDF)，誘導(dǎo)13天后，如圖1所 示，添加T3組的人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)出現(xiàn)iPSC克隆， TRA-1-60表達(dá)陽性而對照組多數(shù)克隆表現(xiàn)為TRA-1-60陰性或假陽性；如圖2所示，在人皮 膚成纖維細(xì)胞(HDF)與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)中，添加T3使TRA-I-60陽性克隆的 陽性率均比未添加的對照組提高20-100倍左右，其中OSKM為0CT3/4，S0X2，Klf4與c_Myc 的縮寫。另外，如圖3所示，通過本實施例5獲得的iPSC在形態(tài)上與人類ESC (H9)相似，且獲得的不同iPSC克隆之間形態(tài)均一)在懸浮培養(yǎng)條件下能形成擬胚體(EB)，在N2培養(yǎng) 基中能向神經(jīng)細(xì)胞分化，表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)。對所得iPSC進(jìn)行分子生物學(xué)方面鑒定，結(jié)果表明形成的iPSC細(xì)胞表達(dá)多潛能基 因 SSEA-3，SSEA-4 (而不表達(dá)小鼠 ES 特異標(biāo)記 SSEA-l)，TRA-l-60，TRA-l-81，E_cadherin， NAN0G(見附圖4)以及內(nèi)源性0CT3/4，S0X2等。通過RT-PCR對內(nèi)源性0CT3/4和NANOG基 因表達(dá)分析顯示獲得的人iPSC細(xì)胞中內(nèi)源性0CT3/4和NANOG基因啟動表達(dá)。對DNA甲基 化分析結(jié)果顯示0CT3/4和NANOG基因啟動子區(qū)相應(yīng)位點完成去甲基化。所得iPSC通過懸 浮培養(yǎng)能形成擬胚體(EB)，在分化條件下能向內(nèi)中外三胚層分化(見附圖5)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的方法包括以下步驟A.用含甲狀腺激素T3或T4的培養(yǎng)基培養(yǎng)體細(xì)胞2-4天；B.將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸，繼續(xù)培養(yǎng)，挑選形態(tài)類似胚 胎干細(xì)胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，得到多潛能干細(xì)胞; 所述核重編程因子以DNA、mRNA或蛋白質(zhì)形式與體細(xì)胞接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟A所述甲狀腺激素T3或T4濃度為 lO.-KTmol/L;步驟A所述體細(xì)胞為靈長類動物的皮膚成纖維細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞、淋巴 細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟B所述將核重編程因子加入到體細(xì) 胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸后，需繼續(xù)用終濃度為ΙΟ,-ΚΓπιοΙ/Ι的甲狀腺激素T3或T4的 培養(yǎng)基培養(yǎng)5-8天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟B所述核重編程因子包含0ct3/4和 Sox2、Soxl 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述核重編程因子還包含Klf4，c-Myc, Nanog, Lin28中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟B所述核重編程因子以DNA形式與 體細(xì)胞接觸；所述DNA為帶有相應(yīng)核重編程因子編碼序列的載體；所述載體為病毒載體或 質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒 載體或腺病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述的方法，其特征在于步驟B具體為將核重編程因子 加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中與體細(xì)胞接觸后，繼續(xù)培養(yǎng)18-30小時，然后換20%FBS-DMEM培養(yǎng)， 3-5天后傳代至飼養(yǎng)層細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，最后換ESC培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天即可得到多潛能 干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于將核重編程因子加入到體細(xì)胞培養(yǎng)液中 與體細(xì)胞接觸的同時補(bǔ)充加入新鮮培養(yǎng)液；所述飼養(yǎng)層細(xì)胞為用絲裂霉素處理使其失去增 殖能力的胚胎期13. 5天的小鼠成纖維細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述ESC培養(yǎng)基是由knockoutDMEM或 DMEM/F12、5-100ng/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、2mmol/L L_glutamine、0. lmmol/L b-巰基 乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/mL抗支原體藥物plasmocin以及 抗生素組成的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的方法，屬于領(lǐng)域生物醫(yī)學(xué)。本發(fā)明提供的高效誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的方法，包括在體細(xì)胞進(jìn)行核重編程步驟前用含甲狀腺激素T3的培養(yǎng)基培養(yǎng)體細(xì)胞2-4天，通過本發(fā)明方法能夠提高誘導(dǎo)iPSC效率20-100倍，達(dá)到1.2%左右，并且縮短誘導(dǎo)周期至12-16天，同時誘導(dǎo)獲得的iPSC不同克隆之間細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、多潛能基因表達(dá)均一，能夠用于人類疾病研究。
文檔編號C12N5/10GK102093981SQ20101059384
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者何毅欣, 吳捷, 周向軍, 周欣, 姜舒, 安鐘姚, 徐亮, 李陶, 胡祥, 許笛, 陳夢飛 申請人:深圳市北科生物科技有限公司