專利名稱：H7亞型禽流感病毒rt-lamp檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒的檢測試劑盒，尤其涉及H7亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測 試劑盒及其應(yīng)用，屬于禽流感病毒的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感的暴發(fā)和流行給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，對人類健康造成了嚴重威 脅。在禽流感的HA亞型中，只有H5和H7亞型對禽是高致病性的(Alexander DJ，1995)，稱 為高致病性禽流感(High pathogenic avianinfluenza，HPAI)，該類病毒可引起雞群100% 死亡，被國際獸疫局確定為A類傳染病(Truszczynsky et al，2000)。A型流感病毒的自然 宿主是野生水禽、鷗和岸基鳥，而家鴨也是AIVs巨大的儲存庫，同時也被認為是AIVs從自 然宿主到家禽傳播的一個重要中間宿主。許多家禽如雞、火雞、珍珠雞、鵪鶉、鴨、鵝等都可 感染發(fā)病，但以雞、火雞、鴨和鵝多見。近年來時有H7亞型流感頻發(fā)(Cross，et al，1987)，如1999-2000年在意大利爆 發(fā)的H7m病毒導(dǎo)致1300多萬羽雞死亡，造成重大經(jīng)濟損失。2003年荷蘭爆發(fā)了 H7N7亞型 禽流感，不僅導(dǎo)致了重大的經(jīng)濟損失，而且感染89人(Koopmans et al，2004 ；Fouchier et al,2004)。這些事件表明禽流感的危害已不僅是對養(yǎng)禽業(yè)的破壞，更為主要的是它對人類 健康構(gòu)成潛在的威脅。快速診斷和及時監(jiān)測是禽流感防控的首要步驟和重要一環(huán)。目前，有關(guān)禽流感的 檢測方法較多，經(jīng)典的流感病毒病原學(xué)診斷方法中病毒分離及其生物學(xué)特性的研究是最 為可行和最能說明問題的，但病毒的分離鑒定需要將病料接種雞胚或組織培養(yǎng)，需要較長 的時間(幾天到一周)，不能夠滿足急性烈性傳染病緊急疫情防制工作的需要，同時由于 高致病性禽流感病毒存在感染哺乳動物的潛在危險，病毒的操作需要在生物安全三級實 驗室進行，一般檢疫部門不具備這種試驗條件?？焖?、靈敏、特異的分子生物學(xué)檢測技術(shù)， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已經(jīng)在禽流感病毒檢測中發(fā)揮著重要作用 (Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要復(fù)雜的 檢測儀器(如PCR儀，熒光定量PCR儀等)，在一些基層的實驗室操作時受到限制。環(huán)介導(dǎo) 等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技術(shù)是一種新的體 外擴增特異性DNA片段的分子生物學(xué)方法(Notomi，2000)。該方法不需要額外的反轉(zhuǎn)錄步 驟，只需要簡單的水浴鍋，在30-90min內(nèi)即可擴增大量的核酸，不需要通過核酸電泳的方 法來檢測結(jié)果，只需通過其副產(chǎn)物-白色的焦磷酸鎂沉淀來觀察結(jié)果(如果加入熒光染料 后會更易觀察)。LAMP所具有的簡單、快速、高效、實用的特點，非常適合在基層實驗室，甚 至現(xiàn)場進行快速診斷。該方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于H5和H9亞型AIV的檢測。建立一種能夠 靈敏、特異的H7亞型AI V的RT-LAMP檢測方法的前提是需要針對H7HA基因保守區(qū)設(shè)計得 到特異性引物。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的主要目的是提供一種能夠靈敏、特異的檢測H7亞型禽流感病毒RT-LAMP的 試劑盒；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種檢測H7亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒，包括Bst DNA, BstDNA緩沖液， AMV反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs，甜菜堿(Betaine)，硫酸鎂，熒光染料，RT-LAMP引物，蒸餾水；其中，所 述的RT-LAMP引物由一對外引物(H7-F3和H7-B3)，一對內(nèi)引物(H7-FIP和H7-BIP)和一對 環(huán)引物(H7-LF和H7-LB)組成；所述外引物對序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所 述內(nèi)引物對序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對序列為SEQ IDNo. 5和 SEQ ID No. 6 所示。其中，所述的熒光染料可以是熒光檢測試劑或STOR GREEN I。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述檢測H7型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒的 使用方法，包括1、將下述組分加入到反應(yīng)管中
Bst DNA8U
IOX Bst緩沖液2. 5μ L
AMV反轉(zhuǎn)錄酶5U
2. 5M dNTPs3. 5μ L
Betaine3μ L
25M 硫_!鎂1 μ L
20pmolSEQIDNo.1(H7FIP)1 μ L
20pmolSEQIDNo.2(H7BIP)1 μ L
IOpmolSEQIDNo.3(H7F3)0. 25 μ L
IOpmolSEQIDNo.4(H7B3)0. 25 μ L
20pmolSEQIDNo.5(H7LF)0. 5μ L
20pmolSEQIDNo.6(H7LB)0. 5μ L
待檢測的樣fP口 RNA2. 0μ L補充DEPC處理的滅菌雙蒸水至25 μ L。2、將反應(yīng)管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)Ih，80°C作用 IOmin結(jié)束反應(yīng)；3、檢測(1)直觀檢測反應(yīng)物中加入 l.OyL FluorescentDetection Reagent 或 2. OyL SYBR GREEN I (invitrogen, USA)染料，即可直接顯示結(jié)果陽性反應(yīng)發(fā)出綠色熒 光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；(2)瓊脂糖凝膠電泳用2. O%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析陽性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的 梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無條帶出現(xiàn)。本發(fā)明通過分析流感數(shù)據(jù)庫中1963年以來分布于世界各地的家雞與野鳥的97個 H7AIV的亞型流感病毒HA基因序列及其中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流 感重點開放實驗室保存的2個分別為強弱毒的H7AIV的HA序列，找出HA基因保守區(qū)，在此 基礎(chǔ)上設(shè)計了 RT-LAMP特異性引物。這99個基因序列涵蓋了多種家禽及野鳥的HA基因，具有普遍性和代表性。利用該引物建立的RT-LAMP檢測試劑盒對Hl H15亞型禽流感病 毒以及雞新城疫病毒等其他7種禽病病原進行檢測，結(jié)果表明該檢測試劑盒僅能特異性擴 增H7亞型禽流感病毒核酸，而不能擴增其他病毒核酸，具有很好的特異性。Imai等建立的H5亞型禽流感的LAMP方法可檢測到0. OlPFU的病毒含量，對不同 病毒檢測結(jié)果表明相同濃度的高致病力和低致病力的H5病毒在相同條件下反應(yīng)的起始時 間和靈敏度存在差異(Masaki Imai et al,2006 ；Masaki Imai et al，2007)。為了評價本發(fā) 明中建立的檢測試劑盒對高致病性和低致病性H7AIV的檢測能力，采用本發(fā)明檢測試劑盒 對 H7HPAIV (A/FPV/Rostock/1934 (H7N1))和 H7LPAIV (A/Chicken/HeB/2/02 (H7N2))進行了 敏感性檢測，H7-RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖顯示強弱毒株均有敏感梯度，對LPAI-H7N2可 檢測到0. 01PFU,比常規(guī)RT-PCR敏感100倍。對HPAI-H7N1可檢測到0. 1PFU，比常規(guī)RT-PCR 敏感10倍。同時HPAI-H7m反應(yīng)的起始時間也略晚于LPAI-H7N2，試驗結(jié)果表明本發(fā)明檢 測試劑盒可同時應(yīng)用于強弱毒株的檢測，相比之下對弱毒檢測的敏感性要略高于強毒。禽流感病毒的潛伏期從數(shù)小時到數(shù)天，最長可達21天。禽流感暴發(fā)流行初期，最 先做的應(yīng)該是禁止家禽在市場上的流通，實行區(qū)域封鎖，并尋找病毒的來源。因此對活禽 和野禽的監(jiān)測顯得尤為重要(Sakar et al，2010)，AIV帶有囊膜，對消毒劑比較敏感，但在 生產(chǎn)實際中，AIV常從感染禽的鼻腔分泌物中及糞便物中排出，使病毒處于有機物的保護之 下，可通過空氣、接觸和糞便傳播。據(jù)報道，試驗雞攻毒1 后即可從泄殖腔及喉頭拭子中 分離到病毒，持續(xù)到攻毒后第7d左右；攻毒后3 才可以從腦、肝、脾、腎、胰腺的混合樣品 中分離到病毒，可持續(xù)到攻毒后第IOd左右(LIA0，et al，2004)，這表明通過棉拭子可在未 出現(xiàn)癥狀時即可檢測到AIV，可真正做到早發(fā)現(xiàn)早防控。本發(fā)明通過鼻腔接種模仿自然感 染，對感染后不同時間采取的棉拭子用病毒分離、RT-PCR和本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒進 行平行檢測。其中，病毒分離和H7-RT-LAMP方法在感染后第1天即可檢測到病毒，第3天 三種方法均可檢測到病毒。但檢測所需時間卻不同，應(yīng)用本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒檢測 病原僅需要60-30min ；病毒分離方法至少需要2_3d ；RT-PCR方法需要6_7h，用時雖短但敏 感性低于本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明針對家禽中流行較為廣泛、危害較大的H7亞型禽流感病毒的血凝素基因 建立了 RT-LAMP檢測試劑盒，該試劑盒對H7AIV RNA的最小檢測限為0. 1-0. 01PFU，其敏感 性較常規(guī)的RT-PCR高10-100倍，可同時用于高致病力和低致病力H7亞型AIV的檢測。通 過對15個AIV亞型病毒和其他禽病毒病病原RNA的檢測，表明該方法只能特異性擴增H7 亞型AIV，具有良好的特異性。本發(fā)明檢測試劑盒具有用樣少、特異性強、敏感性高、快速準 確等特點，為H7亞型禽流感的防控預(yù)警機制提供了簡捷、有效的早期快速診斷途徑。


圖IRT-LAMP的敏感性結(jié)果。圖2RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖顯示結(jié)果。圖3RT-PCR方法的敏感性試驗結(jié)果。圖4LPAIV的H7-RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖。圖5HPAIV的的H7-RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖。圖6RT-LAMP的特異性試驗結(jié)果。
圖7RT-LAMP的特異性試驗結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1試驗材料和方法1. 1毒株和試劑本試驗所用禽流感病毒Hl H15亞型標準參考毒株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；H7 亞型禽流感病毒(HPAIV(A/FPV/Rostock/1934(H7m))和 LPAIV(A/Chicken/ HeB/2/02(H7N2))及其雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏 囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性貧血病 毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。RNA Amplification Kit (RT-LAMP)禾口 Fluorescent DetectionReagent 購自日本 榮研公司；RNA gent S Total RNA Isolation 系統(tǒng)和 Access RT-PCR 系統(tǒng)均購自 Promega 公司。10日齡SPF雞胚、6周齡SPF雞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物 中心提供，所有SPF雞都在負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。1. 2LAMP引物的設(shè)計和合成利用DNAMarsoftware分析了流感數(shù)據(jù)庫中1963年以來、分布于世界各地的家雞 與野鳥的99個H7亞型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守區(qū)，設(shè)計了 6個引 物，分別是外引物(H7-F3 (SEQ ID No. 1)和 H7-B3 (SEQ ID No. 2))，內(nèi)引物(H7-FIP(SEQ ID No. 3)和 H7-BIP(SEQ IDNo. 4))和環(huán)引物(H7_LF(SEQ ID No. 5)和 H7_LB(SEQ ID No. 6)) (表 1)。表IRT-LAMP引物序列
引物名 稱類型長度(S)序列(5’ to 3’)H7-F3正向外引物18-merACGACTGTATGGCCAGTAH7-B3反向外引物18-merCATGAAGACAAGGCCCATH7-FIP正向內(nèi)引物48-merTGGGTCAATCTGTATCCTATTTTGCGAAACAACACTTATGATCACAGCH7-BIP反向內(nèi)引物41-merGTCAAACTGAGCAGCGGCTACAATGGCCAGAAGTATGAAACH7-LB正向環(huán)引物22-merCAAAGATGTGATACTTTGGTTTH7-LF反向環(huán)引物18-merTGCTTCTTCTCTGTATTT1.3RNA 提取RNA的提取采用Trizol LS試劑盒(invitrogen公司)。病毒尿囊液或口咽泄殖腔 拭子按常規(guī)處理后，取樣品250ul，加750ul Trizol LS裂解液，混合震蕩5分鐘(盡量保證 裂解后的液體透明)，加200ul氯仿，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，取上清，加500ul異丙醇，室溫沉淀10-15分鐘，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，棄上清，緩慢加入75%乙醇洗沉淀一次， 倒置濾紙吸干管壁余液，真空抽干或37°C烘干，加入無RNA酶的水20ul，_70°C保存?zhèn)溆谩?. 4RT-LAMP 和 RT-PCR 的反應(yīng)體系H7-RT-LAMP 反應(yīng)總體積為 25 μ L，組成成分如下8U Bst DNA (NewEngland Biolabs，USA)、2. 5μ L IOX Bst 緩沖液(New England Biolabs，USA)、5U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 (TaKaRa, China)、3· 5 μ L 2. 5M dNTPs(Promega)、3 μ L Betaine (Sigma, USA)、1 μ L 25M Μ 酸鎂(Promega)、20pmol H7 FIP 1. Ομ L,20p mol Η7 BIPl.OyLUOp molH7 F3 0· 25 μ L、 IOp mol H7 B3 0. 25 μ L, DEPC處理的滅菌雙蒸水8. 75 μ L。加入2. 0 μ L抽提獲得的RNA 到體系中，置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62.5°C反應(yīng)lh，80°C作用IOmin結(jié) 束反應(yīng)。反應(yīng)物中加入 1. 0 μ LFluorescent Detection Reagent 2. 0 μ L SYBR GREEN I (invitrogen, USA)染料，即可直接顯示結(jié)果陽性反應(yīng)發(fā)出綠色熒光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；或用2. 0%的瓊脂糖凝膠電 泳進行分析陽性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無條帶出現(xiàn)。H7-RT-PCR的弓|物序列為H7Up :5，AATGCACAAGGAGAGGGAACTGC3，；H7Low 5' TGATGCCCCGAAGCTAAA CCA3，；擴增片段大小為501bp。反應(yīng)總體積為25 μ L，組成成分如下5. 0μ L5X反應(yīng)緩 沖液、0.5yL 10M dNTPU. 0μ L 15Μ 硫酸鎂、0· 25 μ L 20pmol H7U p,0. 25 μ L 20ρ mol H7Low,0. 5μ L A MV反轉(zhuǎn)錄酶、0. 5 μ LTaq DNA聚合酶、14 μ L DEPC處理的滅菌雙蒸水。加 入2. 5yL RNA到體系，置于PCR儀反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為45°C逆轉(zhuǎn)錄45mi n，94°C預(yù)變性anin， 94°C 30s,52°C 45s,68°C 45s，；35 個循環(huán)，最后 68°C延伸 &iiin。PCR產(chǎn)物用 1. 0% 的瓊脂糖 凝膠電泳進行分析(Hongmei, et al，2009)。1. 5敏感性試驗對測定病毒含量的H7亞型標準參考毒株和2個H7亞型禽流感病毒(HPAIV(A/ FPV/Rostock/1934(H7Nl)(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)(Garten et al, 1985)和 LPAIV(A/ Chicken/HeB/2/02(H7N2)(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)(Li et al，2006)的尿囊液提取核 酸，將抽提所得的H7AIV總RNA進行10倍倍比稀釋(分別為100000PFU、10000PFU、1000PFU、 100PFU, 10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU)。對上述各濃度 RNA 用 H7-RT-LAMP 和 H7-RT-PCR方法同時進行檢測。1.6特異性試驗用該H7-RT-LAMP方法分別檢測Hl H15亞型禽流感標準參考毒株，檢測不同 亞型病毒之間是否存在非特異性擴增。檢測雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病 毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病 毒(ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)等其他7種禽病病原，檢測 H7-RT-LAMP方法的特異性。H7AIV毒株作為陽性對照。1. 7用病毒分離、RT-PCT和RT-LAMP方法檢測感染H7亞型禽流感病毒雞H7 亞型病毒(A/African Starling/England/983/1979)以每羽份 104PFU/0. ImL 通過鼻腔人工感染SPF雞17只，5只對照雞接種0. 2ml滅菌的正常SPF雞胚尿囊液。感染 后的SPF雞在感染后的I-Ild隔天采集咽拭子和泄殖腔拭子樣品，分別用病毒分離、RT-PCT和RT-LAMP方法檢測。2實驗結(jié)果2. IRT-LAMP的敏感性結(jié)果由病毒含量為IO5PFU的H7RNA，進行10倍倍比稀釋后用本發(fā)明的RT-LAMP檢測試 劑盒和RT-PCR方法進行平行檢測，發(fā)現(xiàn)RT-PCR方法可檢測IPFU滴度的病毒，RT-LAMP反 應(yīng)的特征性階梯狀條帶亮度隨濃度減少有漸暗的改變(圖1B)，綠色熒光亮度也漸漸變暗 (圖1A)。最終病毒在10_7稀釋(0.01PFU)時仍然可以擴增出明顯的階梯狀目的條帶和可 視化的熒光(圖IA和B)，即可敏感地檢測到0. OlPFU的病毒核酸，比常規(guī)RT-PCR方法(圖 3)敏感100倍，RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖顯示(圖2)，隨著稀釋度的增加，反應(yīng)曲線的起 始點向后逐漸推移，表明該方法對濃度的變化很敏感。進一步對高致病力(HPAI)H7亞型禽 流感強毒A/FPV/Rostock/1934(H7Nl)和低致病力(LPAI)H7亞型禽流感弱毒A/Chicken/ HeB/2/02(H7N2))進行了敏感性檢測，H7-RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖顯示，LPAI的敏感性 可檢測到0. 01PFU, HPAIV的敏感性可檢測到0. 1PFU，結(jié)果見圖4和圖5。2. 2RT-LAMP的特異性結(jié)果為了檢測H7-RT-LAMP的引物的特異性，用RT-LAMP檢測Hl H15亞型禽流感病 毒標準參考毒株，結(jié)果表明僅對H7亞型禽流感病毒擴增出特征性階梯狀條帶和呈現(xiàn)綠色 熒光(圖6)。同時對雞新城疫等其他7種禽病也進行了檢測，其他禽病核酸也沒有擴增出 特征性階梯狀條帶和顯示出綠色熒光，H7-RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖也顯示僅有H7亞型 禽流感病毒有擴增曲線，其它亞型病毒則呈陰性結(jié)果。表明本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒能 特異性擴增H7亞型禽流感病毒，而不與其它亞型的AIV和其它禽病病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng) (圖7)。另外，通過對加入環(huán)引物的前后進行比較發(fā)現(xiàn)，環(huán)引物的加入可以大大縮短反應(yīng)時 間，由原來的60min可縮短為30min。2. 3對感染H7亞型禽流感病毒雞的病咽拭子和泄殖腔拭子樣品中的H7W病毒基 因的檢測 為了評價H7-RT-LAMP對臨床樣品的檢測能力，模擬自然感染病例，通過鼻腔人工 感染17只SPF雞，分別隔天采集I-Ild的咽拭子和泄殖腔拭子樣品，同時用病毒分離、一步 法RT-PCR和本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒進行平行檢測。檢測結(jié)果表明，感染后第1，3，5，7， 9，11天的咽拭子和泄殖腔拭子中，采用病毒分離和本發(fā)明RT-LAMP檢測均可檢測到病毒核 酸。病毒分離從咽拭子樣品中檢測到36份陽性樣品，從泄殖腔拭子中檢測到34份陽性樣 品。本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒從咽拭子樣品中檢測到37份陽性樣品，從泄殖腔拭子中檢 測到34份陽性樣品。RT-PCR從第3天開始可檢測到病毒核酸，從咽拭子樣品中檢測到30 份陽性樣品，從泄殖腔拭子中檢測到觀份陽性樣品(表1)。上述三種檢測方法從泄殖腔 拭子樣品中檢出數(shù)量均低于從咽拭子樣品的檢出數(shù)量。所有對照樣品三種方法檢測均為陰 性。表權(quán)利要求
1.一種H7亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒，包括Bst DNA, BstDNA緩沖液，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs，甜菜堿，硫酸鎂，熒光染料，RT-LAMP引物和蒸餾水；其特征在于所述的 RT-LAMP引物由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成；所述外引物對序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4所示，所述環(huán) 引物對序列為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
2.按照權(quán)利要求1所述的H7亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述 的熒光染料是熒光檢測試劑或STOR GREEN I。
3.權(quán)利要求1或2所述的H7亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒在制備檢測或診斷 H7亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了H7亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒及其應(yīng)用，包括Bst DNA，Bst緩沖液，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs，甜菜堿，硫酸鎂，熒光染料，RT-LAMP引物，蒸餾水；所述的RT-LAMP引物由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成；所述外引物對序列為SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，內(nèi)引物對序列為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，環(huán)引物對序列為SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本發(fā)明檢測試劑盒具有用樣少、特異性強、敏感性高、快速準確等特點，為H7亞型禽流感的防控預(yù)警機制提供了簡捷、有效的早期快速診斷途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102134591SQ20101059810
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者包紅梅, 李雁冰, 熊永忠, 王秀榮, 田國彬, 陳化蘭 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所